专利名称：含有脂质体细胞因子的生物降解材料的微球血管栓塞剂及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物降解材料的血管栓塞剂及其制备和应用，特别涉及利用从天然植物海藻酸中提取的，具有良好生物降解特性和生物相容性的多聚糖钠盐或明胶包被采用脂质体包裹的细胞因子，制成50μm-75μm，75μm-150μm，100μm-200μm，200μm-300μm，200μm-450μm，100μm-300μm，300μm-500μm，500μm-700μm，700μm-900μm的微球，用于肿瘤动脉栓塞和局部靶向免疫化学治疗。
背景技术：
肿瘤动脉栓塞疗法是在支配癌组织的微动脉内注入栓塞物质，使该处微动脉发生机械式栓塞，达到抑制肿瘤生长目的的一种新疗法。1981年Kato首先提出化疗栓塞法，将化疗药物与栓塞物质有效有机结合，对一些不能手术的恶性肿瘤提出新方法。近年来国内外应用化疗栓塞疗法在临床上可用于肝癌、肾癌、盆腔肿瘤及头颈部肿瘤等治疗，收到较好的疗效。但栓塞后复发率较高。
微球制剂系药物与适宜的辅料通过微型包裹技术制备的微球。栓塞微球的疗效与其粒径、骨架降解速率、载药及其释药速度等因素有很大关系。用含药物的微球制剂堵塞支配癌组织的微动脉，栓塞部位可不断定向癌靶区释放抗癌药物，杀伤癌细胞，使药物具有靶向性和控释作用，且改变了药物在体内分布及动力学，提高药物的生物利用度，治疗效果显著，毒副作用降低。
肿瘤动脉栓塞疗法选用的微球类制剂应具有以下性质栓塞力强，有足够的机械强度和理化稳定性；药物从载体上释放缓慢而持久，能在靶区维持治疗浓度；载体能被机体逐渐蚀解消失，具有生物相容性；无抗原性，长时间滞留于靶区对机体无害等。
海藻酸钠是从天然植物海藻中提取的多聚糖钠盐，可溶于水形成黏度胶体，在钙离子作用下产生大分子链间交链固化，是一种生物衍生材料，具有良好的生物相容性和良好的生物降解特性。因此，可根据需要加工成不同规格的圆形的固态微球。在动物血管内磷酸缓冲液下的环境下，钙离子渐渐析出，微球以分子链的形式5-10天或3-6个月降解消失，降解产物为甘露糖和古罗糖，不被人体吸收。其微球大小均匀和可控制，且进入血管后可迅速溶胀，栓塞定位效果好。因此，利用其可降解的特性，根据设计要求，制备包载成抗肿瘤的微球或/和含脂质体包裹的细胞因子的微球，注入靶器官后可逐步定时释放靶药，用于肿瘤的局部免疫化学治疗。
免疫治疗可清除残余肿瘤细胞和小的微转移灶及早期肿瘤，防止肿瘤的转移与复发，是肿瘤治疗的特异疗效的辅助疗法。细胞因子是调节机体免疫及抗感染和抗肿瘤的重要因素。
IL-2可使静止的前细胞毒T细胞转化为细胞毒T细胞，维持LAK细胞、TIL细胞的生长，还可以通过活化的巨噬细胞提高非特异性肿瘤杀伤作用，并且在淋巴细胞因子激活的杀伤细胞(LAK)中产生，单独或过继输入的杀伤细胞联合应用可减低肿瘤的转移和复发。IFN-Γ是有一种活化的T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生的，多对肿瘤细胞具有抗增殖作用，同时还能够增加肿瘤细胞的免疫源性和具有对细胞免疫的调节作用，包括刺激NK细胞和单核细胞的增殖作用，协助保持持续的TH1型细胞反应，并刺激IL-12的产生，因而形成了一种正反馈的循环。TNF具有多种功能，其中抗肿瘤的效应，主要表现为对某些类型的细胞具有细胞毒作用，可导致肿瘤新生血管坏死，也可增强肿瘤血管内皮细胞凝血活性导致病理性凝血，阻断瘤区血液供应。另外，TNF也可通过活化某些水解酶而杀伤肿瘤细胞。
实验和临床研究结果提示白介素-2(IL-2)，干扰素(IFN-α，β和γ)，肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，具有抗肿瘤作用，且联合应用比单一使用更能发挥抗肿瘤作用。细胞因子与化疗药物联合应用，具有协同或增强疗效作用。研究还显示TNF-α，IFNα，IFNγ及IL-2等，提高肿瘤细胞对化疗药物的反应。
干扰素除诱导肿瘤细胞分化外，还具有对阿霉素(ADM)，5-FU，顺铂，长春花硷，烷化剂等药物的增敏作用。在免疫治疗过程中，IFN-α常和IL-2联合使用，优于IFN-α或IL-2单独使用，是1+1＞2的组合。另外IFN-α常和IL-2和TNF-α三种联合应用也能较好地辅助化疗药物的作用。另外，细胞因子可调节多药耐药基因(MDR1)的基因表达，可增加MDR1相关药物如阿霉素及长春新碱的细胞毒性，且其作用呈时间依赖性和浓度依赖性。高浓度的细胞因子可引起MDR1的明显逆转，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，改善肿瘤细胞的微环境，增加机体对肿瘤细胞的免疫应答等多种途径，达到抗肿瘤的目的。因此，细胞因子联合化疗可用于化疗耐药的肿瘤治疗。
某些化疗药物CTX，MMC，ADM，DDP等可增强IL-2等细胞因子的抗肿瘤效果，不同化疗药物与细胞因子联合时，具有协同或增强疗效作用。化疗同时给予免疫治疗，既可减轻化疗产生的免疫抑制作用，又可发生协同作用，不仅降低化疗的副作用，增强宿主的耐受力，又利于改善肿瘤的区域控制率，减少局部复发和远处转移率。另一方面免疫治疗也可增强化疗的效果。因此，不同抗癌方法在一定条件下联合应用是合理的。免疫化学治疗成为肿瘤治疗的重要手段。
日本东京大学的谷口维绍教授等在最近Nature网络杂志上发表其干扰素和抗癌剂合用研究，结果发现干扰素可提高细胞内P53蛋白的表达，干扰素和放疗和化疗并用后，疗效比单用化疗和放疗效果好，且减少抗癌药物的剂量和药物副作用。英国Windbichler GH等对148例IC--IV期经肿瘤细胞减灭术的原发性卵巢肿瘤患者，进行Γ-干扰素与CP方案化疗联合应用的前瞻性研究(一种随机的三期临床试验)，作者认为在卵巢癌一线化疗中加入Γ-干扰素具有延长肿瘤无进展生存周期的作用。
由于采用的细胞因子及其在体内的应用可产生许多不良反应，限制其临床应用。IL-2在体内半衰期短，稳定性差，临床大剂量的应用可导致肝肾功能损害和肺毛细血管渗漏综合症等全身副作用。TNF-α能被肾排泄和各种蛋白酶分解，在体内不稳定。半衰期短，在人体的耐受量底，副作用除发热，恶心呕吐，头疼，部分出现严重的低血压及休克等。
如何临床合理使用细胞因子，具有重要的意义。目前采用措施有(1)多细胞因子联合应用(IFN，IL-2)或与化疗药物联合应用降低其剂量，(2)对其结构进行改变，以获得低毒高效的细胞因子，如坏死因子衍生物。(3)采用脂质体可明显增加其稳定性和体内的生物利用度，体内半衰期延长，以减少毒性，靶向性强，生物活性提高，抗肿瘤和免疫调节效能。(4)改变给药途径和方法。
对体内实质性脏器，经动脉介入是一种重要局部途径。经动脉栓塞进行免疫治疗的局部给药可使药物直接分布于癌组织，在肿瘤局部维持高浓度，激活效应细胞功能，抗肿瘤作用更强；同时区域免疫治疗可克服肿瘤引起的免疫抑制；更容易产生对肿瘤抗原的免疫记忆和免疫应答；且全身副作用很小，使用安全。IFN局部应用可使局部较高的浓度药物直接接触肿瘤组织，可增加病灶及周围的巨噬细胞，淋巴细胞的浸润，对肿瘤细胞表现出很强的破坏作用。对各种暴露性肿用IFN直接注入乳头状瘤，乳腺癌，宫颈癌等瘤体内，可取得满意的近期疗效，充分显示其优越性。
高建等采用干扰素(IFN-α1b)联合肝动脉化疗栓塞治疗(TACE)对HBSAg阳性的62例肝癌患者进行疗效和预后观察，结果显示IFN+TACE联合应用，可抑制乙型肝炎病毒复制，减轻介入化疗后肝脏损害，降低肝内复发率，提高患者生存率，且不良反应少。潘铁军等采用TNF和IL-2化疗栓塞治疗肾恶性肿瘤，并与单纯肾动脉栓塞患者进行比较结果细胞因子组肿瘤组织中有较多的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，且肾静脉残端均为坏死的肿瘤细胞，包膜内无存活的瘤细胞。提示TNF和IL-2联合应用一方面通过破坏肿瘤血供，致肿瘤组织缺血坏死，另一方面可激活巨噬细胞，被激活的细胞可识别和杀伤瘤细胞，且减少诱导靶细胞产生耐药性。曹泽毅等经盆腔腹膜后间隙注入IL-2观察TIL和NK活性，探讨起进行生物治疗的可行性。结果显示IL-2+5-FL组较5-FU组和IL-2组CD3，CD4，CD8，CD25和NK细胞差异有显著性，提示IL-2经盆腔腹膜后间隙可激活肿瘤组织TIL和NK的活性。
微球制剂系药物与适宜的辅料通过微型包裹技术制的微球，药物以微球形式给药后，可使药物具有靶向性和控释作用，同时可改变药物体内动力学，提高其生物利用度，降低毒副作用。肿瘤动脉栓塞微球对肿瘤细胞的杀伤机制是使含药物微球聚集于肿瘤附近动脉血管，在一定程度上阻断组织供血，从而在肿瘤局部持续，有效地诱发癌细胞凋亡，最终导致癌细胞缺血，缺氧坏死。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种采用可降解生物材料包载脂质体细胞因子(白介素-2，肿瘤坏死因子，干扰素)化疗药物的血管栓塞剂。
本发明的另一目的是提供上述包载脂质体细胞因子(白介素-2，肿瘤坏死因子，干扰素)化疗药物的血管栓塞剂的制备方法。
本发明的再一个目的是应用制备的上述血管栓塞剂进行荷人卵巢癌，肝癌，肾癌及宫颈癌裸鼠和晚期或复发的卵巢癌，肝癌，肾癌和宫颈癌局部治疗，或宫颈癌的新辅助化疗。
本发明的目的是通过以下技术方案达到的一种含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于包括药物载体和脂质体细胞因子，所述药物载体包裹所述脂质体细胞因子。
所述药物载体为海藻酸钠或明胶。
所述脂质体细胞因子是将细胞因子包封于脂质双分子层而形成的微型球状体。其粒径为25纳米-5微米，一般为1微米左右。
所述脂质体可以是磷脂胆碱(卵磷脂，PC)和牛脑中的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或二棕榈酰-DL-α-磷脂酰胆碱。为了提高包封率，可加入硬脂胺磷酸脂(10％)；为了使膜稳定，可加入适当的胆固醇(20-50％)。脂质体的制备方法有薄膜分散法、超声波制备法、乙醇注入法与醚注入法、逆相蒸发法、冷冻干燥法等。
所述海藻酸钠或明胶与所述脂质体细胞因子的重量比为1∶1～90∶1。
所述含脂质体细胞因子的海藻酸钠或明胶微球血管栓塞剂可以是储存在二价金属阳离子固化液当中的微胶珠或微球。
所述含脂质体细胞因子的海藻酸钠或明胶微球血管栓塞剂也可以是粉末状微粒。
所述储存在固化液中的微胶珠或微球的粒径范围在50～900μm。
所述粉末状微粒的粒径范围在50～900μm。
一种含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂的制备方法，其步骤如下(1)将脂质体细胞因子按比例称重，用溶剂溶解；得脂质体细胞因子溶液；(1)将海藻酸钠按比例称重，溶解，得海藻酸钠溶液；(2)将氯化钙或氯化钡称重，配制成1～10％浓度的溶液，得固化液；(3)将所得脂质体细胞因子溶液和海藻酸钠溶液混合，并通过高压静电微球液滴发生装置与所述固化液混合固化成圆形或类圆形的微球或微胶珠，得含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂。
所述溶剂可以是水、乙醇、酸如乙酸、碱如苛性钠等。
所述高压静电微球液滴发生装置包括一静电发生装置，所述静电发生装置上有正负两极，正极与微量注射装置的针头相连，负极与浸在所述固化液中的不锈钢钢丝相连接，注射装置内装有脂质体细胞因子和海藻酸钠的混合溶液，滴入所述固化液中形成微球。
所得含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂为储存在固化液中的微球，称为湿球。其粒径范围可以是100～200μm。
将所得含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂倾析后，将下面的微球放入烘箱干燥，密闭保存，得粉末状颗粒，称为干球。其粒径范围可以是100～200μm。
一种含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂的制备方法，其步骤如下(1)将脂质体细胞因子按比例称重，用溶剂溶解；得脂质体细胞因子溶液；(2)将明胶按比例称重，用水加热溶解，得明胶溶液；(3)将所得脂质体细胞因子溶液和明胶溶液混合，搅拌均匀，倒入55-60℃的矿物油中，搅拌，冷却至5℃以下，得含脂质体细胞因子的湿明胶微球血管栓塞剂；(4)将上述明胶微粒湿球加入异丙醇或丙酮脱水，搅拌，分离微球，用异丙醇洗二次，待干；(5)取微球若干，加入10％甲醛异丙醇溶液，固化，过滤，干燥，得干明胶微球。
所述第(1)步中所用溶剂可以是水、乙醇、酸如乙酸、碱如苛性钠等。
采用介入放射或介入超声的方法，将导管插入靶器官供血动脉，行动脉造影，根据造影所见，决定选用栓塞微球的直径。尽量使用微导管进行超选择栓塞，使用时要无菌操作。将瓶盖开封，静置沉淀后，用注射器将瓶中保养液(即固化液)抽掉加等量的生理盐水冲洗微球三遍或将瓶中保养液(即固化液)抽掉加等量生理盐水，连同生理盐水及微球倒入无菌碗内，用50～60ml生理盐水冲洗微球一遍弃掉冲洗液，再加入适量或稀释后的造影剂混均(使微球充分悬浮于造影剂中)，透视下经导管视具体情况缓慢或缓慢多次注入(切忌过量栓塞)，直到造影剂流速明显减慢时，即完成栓塞。再次行动脉造影判定栓塞效果。
如果含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂是粉末状颗粒，则先将保存在密闭容器中干球溶于在生理盐水中溶胀(湿球)，再加入适量或稀释后的造影剂混合均匀(使微球充分悬浮于造影剂中)，再在影像设备监视下通过导管超选择性栓塞在病变部位的血管内缓慢或缓慢多次注入(切忌过量栓塞)，直到造影剂流速明显减慢时，即完成栓塞。再次行动脉造影判定栓塞效果。
本发明的海藻酸钠药物载体为天然提取物，是从天然植物褐藻中提取的β-D-甘露醇和α-L-古罗糖混合组成的多糖钠盐，是一种线性大分子，分子量50,000-100,000道尔顿，水合力强，溶于水可形成粘稠胶体，在钙离子作用下产生大分子链间交联固化，可根据临床需要加工成不同大小规格圆形或类圆形的固态微球。此种微球具有良好的生物相容性，在生物机体内，钙离子渐渐析出，微球以分子脱链的形式在3-6个月内无毒降解。降解时不产生碎屑，并可造成靶器官血管的永久性栓塞(当栓塞剂在血管内长达2个月之久时，病人血管内的血栓形成而达到永久性栓塞的目的)，而达到治疗的目的。明胶也基本上起同样的作用。
实际操作中，用这种“生物多功能微球”栓塞材料通过物理堵塞肿瘤或治疗部位周围的小动脉血管，造成相应的血管闭锁，切断对该部位组织的血供与营养，导致其因缺血缺氧而萎缩和坏死。同时也可通过减少靶器官的血供，为手术治疗创造有利条件。将此种微球作为加入肿瘤治疗用药的载体，定时、定位、定向地对局部病灶组织缓慢释放，从而大大提高疗效，降低药物的毒副作用，具有栓塞与药物双重治疗作用。
本发明根据脂质体细胞因子独特的抗癌作用机制和临床应用情况，根据生物降解材料微球的半互穿网络结构和可降解原理，结合以往生物降解材料微球栓塞剂应用实际，从安全，无毒，无免疫原性，无遗传毒性，无生殖毒性，无致癌性等方面考虑。选用生物降解材料作为载体加入抗肿瘤的靶药，定时、定点、定向、定期的局部释放靶药，杀伤肿瘤细胞，达到治疗目的。
免疫治疗可清除残余肿瘤细胞和微转移灶，防止肿瘤的转移与复发。其中细胞因子作为免疫治疗制剂中重要成分，可相互作用，诱导多种因子参与免疫网络中调节。且局部给药可使药物直接分布于癌组织，在肿瘤局部维持高浓度，激活效应细胞的功能，抗肿瘤作用更强；区域免疫治疗可克服肿瘤引起的免疫抑制；(3)使机体更容易产生对肿瘤抗原的免疫记忆和免疫应答；(4)全身副作用减少，使用安全。
应用可产生协同或增加效应，即具有化疗和放疗增敏作用，且多种细胞因子联合应用比单一使用更有效发挥作用。因此，区域免疫化疗治疗，既可减轻化疗产生的免疫抑制作用，又可发生免疫及相互协同作用，结果降低化疗的副作用，增强宿主的耐受力，又利于改善肿瘤的区域控制率，减少局部复发和远处转移率。
经动脉进行肿瘤局部免疫治疗，具有重要的临床意义。但目前尚缺乏细胞因子微球与抗肿瘤药物微球，并联合应用进行肿瘤的局部免疫化学治疗。因此，本发明利用海藻酸钠或明胶制备含脂质体包裹的细胞因子的微粒，注入靶器官后可逐步定时释放靶药，用于肿瘤的局部免疫化学治疗，可发挥对肿瘤的动脉栓塞治疗，化学治疗和免疫治疗多重作用，增强疗效，减少复发，尤其对肝癌，肾癌等。
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施例方式
IL-2脂质体细胞因子的制备1.材料与方法(逆相蒸发法)膜材大豆卵磷脂(SYPC)∶胆固醇＝1∶1(摩尔比)有机相用乙醚配制。
水相IL-2 0.1M PBS.有机相∶水相＝3∶1将膜材溶于乙醚30毫升中，加入IL-2溶液，冰浴间隙超声震荡2-3分钟(0.5分钟，间隙0.5分钟)，使成均匀的乳状液，在20-25度旋转蒸发除去乙醚，得到白色均匀的脂质体悬液。
2.包封率测定将制备的脂质体悬液经高速低温离心(30000G，60分钟4度)后吸收上清，沉淀用PBS冲洗，再离心，重复2次，将离心的下层脂质体加入乙醚使其水相与脂相分离，按Lorry氏法测定出水相中IL-2的浓度，求得包封率。包封率为34.5+1.12％。此法共重复5次回收率试验，回收率平均为95％。(分别采用紫外分光光度计法，BCA蛋白浓度测定法及Lowry法测定原液中蛋白浓度)。
3.电镜观察将脂质体稀释到一定倍数后，将其放置于铜网上，用滤纸片吸干，放置10分钟，然后用5％磷钨酸负染数分钟，取出自然干燥后，进行电镜观察。
制备的IL-2脂质体呈悬浮液体，经磷钨酸负染后，电镜下多数脂质体为大单层脂质体，直径在0.2μm。
4.稳定性试验取脂质体测其当日包封量，然后保存于4℃，分别于2，4，6个月时取样离心，测其包封量，再取1毫升脂质体稀释1倍保存于4℃，于4个月后时测定其包封量，然后计算渗漏率。
通过测定渗漏率发现，未稀释的脂质体样本在4℃保存6个月，其渗漏率无明显变化，稀释1倍后在4℃保存4个月，渗漏率明显增加(23％)5.活性测定(ConA诱导T细胞微量测定法)(1).加包载的IL-2脂质体于RPMI-1640培养CTLL的细胞培养，取对数生长的细胞，250G，10分钟，洗去残存的IL-2。用1％台盘蓝染色法计数细胞，并决定细胞活力。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml，.96孔板中加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测的样品，每个稀释度3个孔，8-10个稀释度，阴性对照不加PBS。每孔加0.1ml的细胞悬浮液，在37℃ 5％CO2培养箱中培养18-24小时，每孔加10ul(1.85×104Bq)[H3]脱氧胸苷，继续培养4小时。用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3％的醋酸水溶液洗涤滤纸3次，洗去游离的[H3]脱氧胸苷。将滤纸放置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上进行同位数活性计数。根据CPM值对样品进行作图，计算待测样品的IL-2浓度。
(2)取C57BL/6小鼠脾，研磨碎配成5×105个/ml单细胞悬液，加入ConA5ug/ml，置于在37℃ 5％CO2培养40-48小时。将培养液置于淋巴细胞分层液上，1700r/min，离心15min，取界面层细胞，将上述反应反应细胞配成1×105个/ml浓度的悬液。取96孔板中分成3组(空白组，对照组，待测组)，每组10孔，每孔加0.1ml细胞悬液，空白组加同体积PBS，对照组每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2，待测组每孔加0.1ml的IL-2脂质体(IL-2 100单位)。37℃ 5％CO2培养40-48小时，用多头细胞收集器将细胞收集，液体闪烁仪上进行同位数活性计数。结果显示空白组为3411+358，对照组16540+1987，待测组21003+1812。包裹的IL-2脂质体较未包裹有提高。
二.IFN脂质体细胞因子的制备1材料与方法卵磷脂(SYPC)∶胆固醇＝2∶1(摩尔比)，有机相用氯仿。水相IFN-α0.1MPBS。
2制备方法(逆相蒸发法)卵磷脂40mg，胆固醇20mg，，溶于氯仿4毫升，40度，水浴，100-150rpm，旋转蒸发除去氯仿，加入乙醚4毫升中，并加入IFN-α溶液(0.5毫升PBS)中与之混合，二者经超声进行乳化冰浴间隙超声震荡2-3分钟(0.5分钟，间隙0.5分钟)，使成均匀的乳状液，在40度旋转蒸发100-150rpm除去乙醚，得到白色均匀的脂质体悬液。最后通过凝胶柱层析方法除去未包的药物。
3.粒径测定取新制备的脂质体IFN-α，NS稀释，将其放置于铜网上，用滤纸片吸干，放置10分钟，然后用5％磷钨酸负染数分钟，取出自然干燥后，进行电镜观察及粒径测定。
4.包封率测定将制备的脂质体悬液经高速低温离心(30000G，60分钟4度)后吸收上清，沉淀用PBS冲洗，再离心，重复2次，将离心的下层脂质体加入乙醚使其水相与脂相分离，按Lorry氏法测定出水相中IL-2的浓度，求得包封率。包封率为34.5+1.12％。此法共重复5次回收率试验，回收率平均为95％。
5.稳定性试验取脂质体测其当日包封量，然后保存于4℃，分别于2，4，6个月时取样离心，测其包封量，再取1毫升脂质体稀释1倍保存于4℃，于4个月后时测定其包封量，然后计算渗漏率。
通过测定渗漏率发现，未稀释的脂质体样本在4℃保存6个月，其渗漏率无明显变化，稀释1倍后在4℃保存4个月，渗漏率明显增加(23％)6.活性测定(以细胞病变效应(CPE)效应为基础的结晶紫染色测定方法)用含10％小牛血清的MEM培养液按1∶200稀释VDV，并接种于对数生长的单层Wish细胞中进行增殖，孵育至细胞病变达75-100％时冻存于-20度以下，次日反复冻融2-3次，收集毒种存于液氮中。VSV的效价的滴定以24小时时微量板孔中半数出现细胞病变的现象的稀释度为1个TCID50，此稀释度的倒数乘以10倍作为病毒效价(TCID50/ml).微量CPE测定法中国生物制品规程中要求采用Wish细胞/VSV体系测定，根据干扰素对Wish细胞的保护性，即细胞病变程度按5级打分法记录不同浓度时的保护性，用国家标准品(LOT03/94)为参考标定其IU值。
结晶紫染色测定方法将生长良好的单层Wish细胞用含10％小牛血清的MEM培养液配细胞浓度约为5×105个/ml悬液，加到96孔细胞培养板上，100ul/孔，同时设立标准样品对照，体积与样品相同，在含5％CO2，37度培养箱中培养4小时，每孔加入4倍梯次稀释于干扰素样品100ul/孔，样品稀释用含7％小牛血清的MEM培养液，37度培养箱中培养18-24小时，弃上清后用含3％小牛血清的MEM培养稀释的VSV病毒(100TCID50/ml)攻击，然后于5％CO2，37度培养箱中培养24小时。弃培养上清液，每孔加40ul的结晶紫染色液室温30分钟，弃染液，用蒸馏水冲洗残余的染液，用滤纸吸干后每孔加入100ul的脱色液脱色，在SPECTRA 250型的自动酶标仪器于570nm波长处测定每孔的OD值。分别以干扰素-α国家标准样品效价值在自动酶标仪上计算样品的效价值。
三.海藻酸钠包载细胞因子脂质体微球制备
1.材料与方法2.包封率3.稳定性4.释放量四、肝癌模型建立及应用(1)验对象纯种、清洁新两兰大白兔50只(由重庆医科大学实验动物中心提供)，雌雄不均，3～4月龄，体质量2～3kg。
(2)实验材料皮下Vx2移植瘤种兔由北京医科大学超声生物工程研究所提供。bcl2、bax免疫组化染色试剂盒购自博士德公司，VEGF免疫组化染色试剂盒购自Neo Marker公司。DAB显色试剂盒、粘片剂购自迈新公司。肝动脉插管购自BD公司。
(3)实验方法将靠近Vx2移植瘤种兔肿块边缘生长旺盛的鱼肉样组织切成1～2mm3瘤块，将肿瘤块植入肝左前叶内。两周后肝脏上形成一直径约1cm浸润性生长的肿瘤。肝脏移植瘤术后的第2周末，在肝动脉根部穿刺置管并固定。数字表法随机将实验动物平均分成5组(每组10只动物)阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(顺铂1.28mg·kg-1·d-1)、实验组1(As2O3 0.6mg·kg-1·d-1)、实验组2(As2O3 1.2mg·kg-1·d-1)、实验组3(As2O3 1.96mg·kg-1·d-1)。每天经肝动脉插管灌注实验用药，连续治疗7d。肝脏移植瘤术后第5周末后，切取邻近(15cm)肿瘤相同部位正常肝组织和全部肝癌组织。称瘤重，取肿瘤及肝组织光镜、电镜标本各1份。
(4)观察指标阳性对照组、实验组的肿瘤重量及其平均瘤重抑制率平均瘤重抑制率＝(1-给药组的平均瘤重阴性对照组的平均瘤重)×100％。
透射电镜观察瘤细胞、肝细胞的细胞体积、核形态及核染色质变化。
检测bcl2bax基因表达及VEGF表达其中染色结果判断标准bcl2bax基因表达以胞浆或和胞膜着色呈棕黄色的瘤细胞为阳性细胞。阳性细胞数＜5％为(-)，5％～15％为(+)，15％～50％为(++)，＞50％为(+++)。VEGF表达为新生毛细血管内皮细胞及部分肿瘤细胞胞浆和或胞膜着色呈棕色为阳性细胞。染色明显者为VEGF阳性，染色弱或不染色为VEGF阴性。
(5)统计学方法实验数据以x±s表示，用SAS 8.1统计软件行q检验、Fisher′s精确检验。免疫化疗微球经动脉栓塞进行荷人宫颈癌的裸鼠的治疗。
五、建立小鼠U14宫颈癌移植瘤模型将U14宫颈癌细胞稀释成7×106个/ml，将平均体重18-22g的NIH小鼠34只小鼠右前肢腋窝区消毒后，皮下注射上述瘤细胞悬液0.1ml/只(细胞数7×105个/只)。生长3-4周后，将移植肿瘤取下，切成1mm×1mm×1mm大小的瘤块，再次接种于小鼠的肝左叶被膜下。
2.荷人宫颈癌的裸鼠的治疗瘤块注药接种10天后，再次取原切口，在手术显微镜下测种植瘤结节的最大经和最小经，并行肝动脉插管注药。其中动物随机分为A生理盐水组；B IL-2组；C IL-2脂质体组；D单纯化疗组；E IL-2+化疗组；F IL-2脂质体组+化疗组。
2周后每组取6只，再次测量种植瘤结节的最大经和最小经，计算肿瘤体积，比较肿瘤生长率。(其中肿瘤体积生长率为治疗后体积除以治疗前体积)，行HE染色观察肿瘤坏死程度(轻0-30％，中30-70％，重71-100％)及淋巴细胞浸润情况，治疗后荷瘤大鼠自然存活时间。
六.大鼠肝癌动脉栓塞a)大鼠移植瘤肝癌模型建立取接种Walker-256瘤细胞3-5天后Wistar大鼠癌性腹水0.5-1ml，无均条件下注射至健康大鼠皮下，7-10天可以长直径约1-2cm肿瘤，切取新鲜鱼肉样瘤组织剪成1m3组织块，接种到大鼠肝左外叶，1周后复制成直径为0.5-1cm的肝癌模型。取肝癌模型大鼠30只。用PE-50管在手术显微镜下经胃十二指肠动脉逆行插入肝固有动脉注入栓塞剂，进行肝动脉栓塞，注药的同时暂时阻断肝总动脉及肝右动脉。注药结束后结束后胃十二肠动脉，关腹，归笼饲养。
b)肝动脉栓塞治疗将动物随机分为A生理盐水组；B IL-2组；C IL-2脂质体组；D单纯化疗组；E IL-2+化疗组；F IL-2脂质体组+化疗组。
权利要求
1.一种含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于包括药物载体和脂质体细胞因子，所述药物载体包裹所述脂质体细胞因子。
2.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述药物载体为海藻酸钠或明胶。
3.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述脂质体细胞因子为脂质体包裹所述细胞因子。
4.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述脂质体是磷脂胆碱或牛脑中的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或二棕榈酰-DL-α-磷脂酰胆碱。
5.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述细胞因子为白介素-2，干扰素或肿瘤坏死因子。
6.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述药物载体与所述脂质体细胞因子的重量比为1∶1～90∶1。
7.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂是储存在二价金属阳离子固化液当中的微胶珠或微球。
8.按权利要求1所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂，其特征在于所述储存在二价金属阳离子溶液中的微胶珠或微球的粒径范围为50～1000μm。
9.一种含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂的制备方法，其步骤如下(1)将脂质体细胞因子按比例称重，用溶剂溶解；得脂质体细胞因子溶液；(2)将海藻酸钠按比例称重，溶解，得海藻酸钠溶液；(3)将氯化钙或氯化钡称重，配制成1～10％浓度的溶液，得固化液；(4)将所得脂质体细胞因子溶液和海藻酸钠溶液混合，并通过高压静电微球液滴发生装置与所述固化液混合固化成圆形或类圆形的微球或微胶珠，得含脂质体细胞因子的海藻酸钠微球血管栓塞剂。
10.按权利要求9所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂的制备方法，其特征在于所述高压静电微球液滴发生装置包括一静电发生装置，所述静电发生装置上有正负两极，正极与微量注射装置的针头相连，负极与浸在所述固化液中的不锈钢钢丝相连接，注射装置内装有脂质体细胞因子和海藻酸钠溶液，滴入所述固化液中形成微球。
11.按权利要求1～8中任一项所述的含脂质体细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂在制备治疗荷人肝癌，宫颈癌等动物体内或用于晚期或复发肝癌，肾癌，膀胱癌，结直肠癌等各种恶性肿瘤的药中的应用。
全文摘要
本发明公开了含免疫细胞因子的可降解生物材料微球血管栓塞剂及其制备和应用。其主要技术特征是利用从天然植物海藻酸中提取的、具有良好生物降解特性和生物相容性的多聚糖钠盐或明胶，包被采用脂质体包裹的免疫细胞因子如白介素－2，肿瘤坏死因子，干扰素等，制成50μm－75μm，75μm－150μm，100μm－200μm，200μm－300μm，200μm－450μm，100μm－300μm，300μm－500μm，500μm－700μm，700μm－900μm，等不同的脂质体细胞因子微球。用于荷人肝癌、宫颈癌等动物体内或用于晚期或复发肝癌，肾癌，膀胱癌，结直肠癌等各种恶性肿瘤的动脉栓塞和局部靶向免疫化学治疗。
文档编号A61K38/20GK1876177SQ20051007492
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月6日 优先权日2005年6月6日
发明者李小平, 崔恒, 魏丽惠, 冯捷, 洪宏, 李新建, 齐宪荣 申请人:北京圣医耀科技发展有限责任公司