专利名称：一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂及其制备方法
技术领域：
本发明光敏剂技术领域，涉及一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂。
背景技术：
光动力学疗法(photodynamic therapy, F1DT)是近20年发展起来的一种新的治疗恶性肿瘤的方法。它是利用外加光敏剂或光敏剂前体，增加肿瘤内光敏剂的聚集，随后给予特定波长的激发光激活光敏剂，从而引发细胞氧化应激反应造成肿瘤细胞的死亡。与传统的手术、放疗、化疗相比，它具有相对的选择特异性，毒副作用小，非侵入性，无累加毒性等特点。近年来美国、日本、荷兰和加拿大等国的卫生部门已相继确认了这一肿瘤新疗法的合法性。同时，PDT疗法在非肿瘤的治疗中也受到了重视，用于移除有害的细胞或组织。
5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一种常用的被美国FDA认证的光敏剂，它由于代谢快、毒副作用小被临床病人和基础研究者所青睐。然而其亲水性的分子结构限制了对细胞膜的穿透力，从而限制了 5-ALA对于结节状肿瘤的治疗。所以，改善5-ALA对细胞膜的穿透力不仅可以提高5-ALA对肿瘤的杀伤效率，还能加大其在临床上的应用范围。从1995年便有人通过制备5-ALA的脂类衍生物来改善其亲脂性能以增加其对细胞膜的通透性，到目前为止关于这方面的研究很多，但是没有一种方法让人们感到满意和普遍接受。近年来，随着纳米技术的飞速发展，纳米材料在生物医学工程领域的研究已成为一个很有生命力的新方向。使用纳米材料运载药物，不仅可以使药物具备新的特性，如改善药物的溶解性、增强药物的靶向性、增强对细胞的穿透力等，还能利用纳米微粒本身特殊的物理和化学特性，在一些疾病的诊断和治疗中发挥作用。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂及其制备方法，通过纳米技术对5-ALA进行改进，提高5-ALA对细胞膜的穿透性，从而提高光动力学疗法疗效。本发明是通过以下技术方案来实现一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，在pH为7. 20 7. 45的溶液中，5_氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金通过静电力结合，其质量比为5-氨基乙酰丙酸阳离子胶体金=3 10: I。所述的阳离子胶体金为聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐所形成的直径为10 50nm的胶体金颗粒。其中5-氨基乙酰丙酸的浓度为0. 5 10mM。还含有pH缓冲剂和稳定剂。所述的pH缓冲剂为HEPES，其在改性光敏剂中的最终浓度为10 50mM ;所述的稳定剂为四辛基溴化铵，其在改性光敏剂中的最终浓度为I 10mM。一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，包括以下步骤
I)阳离子胶体金的制备在聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液加入其质量0. I 5%的氯金酸，搅拌混匀，然后加入乙醇并搅拌混匀，调节pH为8. 0 8. 5，加热至沸腾后冷却至室温，得到阳离子胶体金溶液；2)将阳离子胶体金溶液过滤后注入到pH为7. 20 7. 45的5_氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸与阳离子胶体金的质量比为3 10:1，超声分散，并加入pH缓冲剂和稳定剂，避光冷藏保存。所述的pH缓冲剂为HEPES，稳定剂为四辛基溴化铵。所述的HEPES在改性光敏剂中的最终浓度为10 50mM ;四辛基溴化铵在改性光敏剂中的最终浓度为I 10mM。所述的超声分散中超声功率为250 300W，频率为50 90Hz。 所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂在制备用于光动力治疗的药物的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，利用纳米胶体金的穿透力，通过静电吸引力将5-ALA和阳离子纳米金(GNPs)结合，从而提高5-ALA对细胞膜的穿透性，从而提高光动力学疗法中对肿瘤细胞的杀伤效率。本发明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，通过不同的光谱来进行表征分析，最后用细胞试验验证了这种5-ALA和阳离子纳米金结合的新型光敏剂5-ALA-GNPs在光动力疗法中的可行性。具体的以人类白血病慢性粒细胞K562用来作为光动力疗法的治疗对象。与单独的纳米金和5-ALA相比，结合体的杀伤效果明显提高，对K562细胞活性的抑制效果从单独5-ALA的60%提升至71%左右。细胞实验的结果证明了这种新型光敏剂良好的光动力治疗效果和它在光动力学疗法中的应用价值。


图I为纳米金的电镜照片；图2为纳米金与5-ALA结合后的电镜照片；图3为Au+5-ALA与5-ALA的细胞的光动力学疗法效果对比图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，本发明提供基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，是将5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金结合形成结合体，以改善其细胞穿透性。其中作为改性的阳离子纳米金(GNPs)为具有能够提供静电吸引力的阳离子的纳米金即可，一旦吸附形成结合体之后，阳离子纳米金就可发挥其增强对细胞的穿透力的能力，从而协助5-氨基乙酰丙酸穿过细胞膜。下面通过具体的制备实施例来进行说明，实施例中所选择的阳离子胶体金为聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐所形成的胶体金颗粒，这并不是对技术方案中阳离子胶体金与5-ALA结合的限定，也不排除其他阳离子胶体金与5-ALA的结合，比如市场上可购买的多种阳离子胶体金。所述是对本发明的解释而不是限定。实施例I基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，包括以下步骤I)阳离子胶体金的制备取0.Ig聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(Poly diallyl dimethylammonium chloridePDDA)置于50mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，定容至lOOmL。将IOOmL PDDA溶液移至250mL烧杯中，磁力搅拌10分钟，加入质量分数1%的氯金酸3mL,磁力搅拌10分钟使之充分混勻。加入2mL无水乙醇,磁力搅拌2分钟后,用氢氧 化钠溶液调节PH值至8. 5。最后，用微波炉加热至沸腾，冷却至室温后放入4°C冰箱保存。2)纳米金与5-ALA的结合分别将ImM、IOmM和IOOmM三种不同浓度的5-ALA调节pH值到7. 4左右。将新制备的胶体金溶液用220 的注射滤器过滤，分别与不同浓度的5-氨基乙酰丙酸按体积比
I I混合，超声分散5分钟(功率285W，频率59Hz )；根据溶液量加入HEPES作为pH缓冲剂，使其在溶液中的最终浓度为20mM作为，使PH值保持恒定，根据溶液量加入相稳定剂四辛基溴化铵，使其在溶液中的最终浓度为2mM以保持5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金结合体的稳定，在4°C避光冷藏保存备用。参见图I所示的纳米金的电镜照片，图2所示的纳米金与5-ALA结合后的电镜照片，图I与图2相比结合5-ALA后的结合体5-ALA-Au明显比未结合前变大。实施例2基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，包括以下步骤I)阳离子胶体金的制备取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，定容至100mL。将IOOmL I3DDA溶液移至250mL烧杯中，磁力搅拌10分钟，加入质量分数1%的氯金酸5mL,磁力搅拌10分钟使之充分混勻。加入2mL无水乙醇,磁力搅拌2分钟后,用氢氧化钠溶液调节PH值至8. O。最后，用微波炉加热至沸腾，冷却至室温后放入4°C冰箱保存。2)纳米金与5-ALA的结合分别将浓度为IOmM的5-ALA调节pH值到7. 2左右，将新制备的胶体金溶液用220 u m的注射滤器过滤，调节注入的胶体金溶液，使5-氨基乙酰丙酸与阳离子胶体金的质量比为4. 5:1，超声分散3分钟(功率285W，频率75Hz )；根据溶液量加入HEPES作为pH缓冲剂，使其在溶液中的最终浓度为IOOmM,使pH值保持恒定；pH缓冲剂也可以为其他缓冲剂；根据溶液量加入相稳定剂四辛基溴化铵，使其在溶液中的最终浓度为5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金结合体的稳定，在4°C避光冷藏保存备用。实施例3基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，包括以下步骤I)阳离子胶体金的制备取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，定容至100mL。
将IOOmL PDDA溶液移至250mL烧杯中，磁力搅拌10分钟，加入质量分数2%的氯金酸5mL,磁力搅拌10分钟使之充分混勻。加入2mL无水乙醇,磁力搅拌2分钟后,用氢氧化钠溶液调节PH值至8. O。最后，用微波炉加热至沸腾，冷却至室温后放入4°C冰箱保存。2)纳米金与5-ALA的结合分别将浓度为IOmM的5-ALA调节pH值到7. 2左右，将新制备的胶体金溶液用220 u m的注射滤器过滤，调节注入的胶体金溶液，使5-氨基乙酰丙酸与阳离子胶体金的质量比为8:1，超声分散10分钟(功率300W，频率80Hz)；根据溶液量加入HEPES作为pH缓冲剂，使其在溶液中的最终浓度为IOOmM,使pH值保持恒定；pH缓冲剂也可以为其他缓冲剂；根据溶液量加入相稳定剂四辛基溴化铵，使其在溶液中的最终浓度为5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金结合体的稳定，在4°C避光冷藏保存备用。 实施例4基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，包括以下步骤I)阳离子胶体金的制备取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，定容至lOOmL。将IOOmL PDDA溶液移至250mL烧杯中，磁力搅拌10分钟，加入质量分数2%的氯金酸5mL,磁力搅拌10分钟使之充分混勻。加入2mL无水乙醇,磁力搅拌2分钟后,用氢氧化钠溶液调节PH值至8. O。最后，用微波炉加热至沸腾，冷却至室温后放入4°C冰箱保存。2)纳米金与5-ALA的结合分别将浓度为IOmM的5-ALA调节pH值到7. 45左右，将新制备的胶体金溶液用220 u m的注射滤器过滤，调节注入的胶体金溶液，使5-氨基乙酰丙酸与阳离子胶体金的质量比为5:1，超声分散10分钟(功率300W，频率90Hz)；根据溶液量加入HEPES作为pH缓冲剂，使其在溶液中的最终浓度为IOOmM,使pH值保持恒定；pH缓冲剂也可以为其他缓冲剂；根据溶液量加入相稳定剂四辛基溴化铵，使其在溶液中的最终浓度为5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金结合体的稳定，在4°C避光冷藏保存备用。经过改性可以提高5-ALA对细胞膜的穿透性，从而提高光动力学疗法中对肿瘤细胞的杀伤效率。具体人类白血病慢性粒细胞K562用来作为光动力疗法的治疗对象来进行说明。当K562细胞处于指数生长期时，调整细胞浓度到大约5X IO5左右，将细胞和制备好的新型光敏剂放置于96孔板中孵育4小时后，用汞灯照射系统以3. 6J/cm2的能量密度于暗室中照射I小时。光照后，将光照组和空白对照组的96孔板中各实验孔都加入10iilCCK-8(CellCounting Kit-8)试剂(试剂中主要成分WTS-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4- 二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，一种常用于检测细胞增殖和细胞毒性的试剂)，再次放入培养箱孵育。分别在不同的时间段，利用酶标仪以450nm为检测波长，测量各实验孔OD值，检测细胞活性。
检测结果如图3所示，分别给出了对照组(即不加入任何物质的细胞)，细胞纳米金混合培养液，细胞5-ALA混合培养液以及细胞5-ALA-Au混合培养液在激光照射下的细胞的活性分析结果。通过分析可知，与单独的纳米金和5-ALA相比，改性后的5-ALA结合体的杀伤效果明显提高，对K562细胞活性的抑制效果从单独5-ALA的60%提升至71%左右。效果的提高是由于纳米金增加了 5-ALA对细胞的穿透能力，从而增加了细胞对结合体的摄入。 细胞摄入结合体越多，5-ALA在细胞中的堆积越多，转化的原卟啉IX就越多。原卟啉IX正是光动力学疗法中杀伤细胞的光敏物质，因此，会有更多的细胞被杀伤。细胞实验的结果证明了改性后的光敏剂良好的光动力治疗效果和它在光动力学疗法中的应用价值。
权利要求
1.一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，其特征在于，在pH为7. 20 7. 45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金通过静电力结合，其质量比为5-氨基乙酰丙酸阳离子胶体金=3 10: I。
2.如权利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，其特征在于，所述的阳离子胶体金为聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐所形成的直径为10 50nm的胶体金颗粒。
3.如权利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，其特征在于，其中5-氨基乙酰丙酸的浓度为O. 5 10mM。
4.如权利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，其特征在于，还含有pH缓冲剂和稳定剂。
5.如权利要求4所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂，其特征在于，所述的pH缓冲剂为HEPES，其在改性光敏剂中的最终浓度为10 50mM ;所述的稳定剂为四辛基溴化铵，其在改性光敏剂中的最终浓度为I 10mM。
6.一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，其特征在于，包括以下步骤 1)阳离子胶体金的制备 在聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液加入氯金酸后，搅拌混匀，然后加入乙醇并搅拌混匀，调节PH为8. O 8. 5，加热至沸腾后冷却至室温，得到阳离子胶体金溶液； 2)将阳离子胶体金溶液过滤后注入到pH为7.20 7. 45的5-氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸与阳离子胶体金的质量比为3 10:1，超声分散，并加入pH缓冲剂和稳定剂，避光冷藏保存。
7.如权利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，其特征在于，所述的PH缓冲剂为HEPES，稳定剂为四辛基溴化铵。
8.如权利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，其特征在于，所述的HEPES在改性光敏剂中的最终浓度为10 50mM ;四辛基溴化铵在改性光敏剂中的最终浓度为I 10mM。
9.如如权利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂的制备，其特征在于，所述的超声分散中超声功率为250 300W，频率为50 90Hz。
10.权利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂在制备用于光动力治疗的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏剂及其制备方法，在pH为7.20～7.45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和阳离子胶体金通过静电力结合。利用纳米胶体金的穿透力，通过静电吸引力将5-ALA和阳离子纳米金(GNPs)结合，从而提高5-ALA对细胞膜的穿透性，从而提高光动力学疗法中对肿瘤细胞的杀伤效率。与单独的纳米金和5-ALA相比，结合体的杀伤效果明显提高，对K562细胞活性的抑制效果从单独5-ALA的60%提升至71%左右。证明了这种新型光敏剂良好的光动力治疗效果和它在光动力学疗法中的应用价值。
文档编号A61P35/00GK102727891SQ201210192480
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者姚翠萍, 张镇西, 李政, 梅建生, 王斯佳, 王晶, 许澔, 韩玉龙 申请人:西安交通大学