专利名称：自固化磷酸钙原位成骨活性骨水泥及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医用材料领域，涉及一种原位固化并能诱导新骨形成的磷酸钙活性骨水泥硬组织修复材料。
自固化磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement，CPC)，它是由几磷酸钙盐组成的混合物(Chow，US 5525148，5545254，1996)，用固化液调和成糊状后能根据缺损部位任意塑形，在人体环境温度下自行水化固化，其最终成份转化为羟基磷灰石。它吸收了羟基磷灰石陶瓷生物相容性好以及聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥易塑型的优点，成为目前世界上修复骨骼缺损材料中能自行硬化并产生骨头再生效果的新材料。材料植入动物体内无毒性反应、生物相容性好，固化后与骨质紧密连接，且逐步被吸收及引导新骨长入，植入后材料降解与新骨形成对等。这些特性因而引起人们的广泛关注，各发达国家纷纷加大对这一领域的研究力度。目前发明人研制的CPC材料已应用于临床，结果是令人鼓舞的。已在全国三百多家医院使用达15000多例，均能满意修复骨缺损。在临床研究中发现，材料植入6个月后有部分降解，但随访12个月CPC的吸收和骨长入尚不足30％，这是由于材料只具有引导新骨形成能力，但无成骨活性的缘故。为了加速材料降解，发明人制成多孔磷酸钙骨水泥(刘昌胜，ZL98110645.5)，其降解和骨融合速率大大加快，但仍然只起支架作用，无诱导成骨活性，对有些应用场合，如骨不连，骨延迟愈合情形，仍然显得不足，须提高其成骨活性，加速材料降解，才能更好地使用。
随着生物医学工程技术的发展，各种骨生长因子，如骨形态发生蛋白(BMP)，转化生长因子(TGF-β)，纤维细胞生长因子(FGF)等基因表达的成功，为骨不连、骨缺损治疗提供了另一条思路。但纯的生物活性因子在体内溶解太快，易于被酶切或抗体拮抗而失去活性，难以发挥作用，必须依赖于一个好的载体。
Zelin表明(Bone，200026-161-168)，成纤维细胞生长因子(FGF)能促进中胎层和神经外胚层细胞有丝分裂，FGF-2是骨组织中含量很大的一类细胞因子，可以促进成骨细胞的有丝分裂，产生更多的细胞以促进成骨，还可刺激转化生长因子(TGF-β)在成骨细胞中的分泌量，并且还可以促进血管生成的作用，促进血管向植入物中生长，加速材料的降解以利于成骨细胞的生长。李校坤等(促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用，99100585.6)采用海绵作为FGF的载体，在促进成纤维细胞的生长及伤口愈合效果肯定，但整个复合体没有强度，生物活性因子释放太快。
转化生长因子(TGF-β)能增加成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、I型胶原、骨连接素)的表达，还可以诱导人成骨细胞中自身的表达，并可诱导BMP-2在成骨细胞中的表达，增加其成骨能力，从而共同形成诱导成骨的正反馈，增加成骨，(Hefferan等，J.CellBiochem.2000，78380-390；Kverborg等，J.Endocrinal，2001，169(3)；549-561)，但目前并未报道很好的载体。
目前研究和应用较多的载体主要有1)无机盐类；2)多聚体类(如聚乙醇酸、聚乳酸等)；3)生物类(如胶原、纤维蛋白等)。
对于BMP的载体，有很多种，一是将小牛骨去蛋白后，吸附BMP。(提取分离的BMP或重组人BMP)(胡蕴玉等重组合异种骨，ZL94244566.X，李晓光等，骨形态发生蛋白与煅烧骨的复合方法，98125671.6)，表明能诱导新骨形成。Urist MR(β-tricalcium PhosphateDelivery System for Bone Morphogenetic Protein，Climi.Orthop.Relat.Res.，1984，187277-280)等采用磷酸三钙多孔陶瓷为载体。磷酸三钙陶瓷类同异种骨复合一样只能采用先烧结成型再浸泡吸附的方法进行BMP复合。而通过物理方法吸附的BMP等活性因子的发挥作用时间很短，早期(二周左右)效果明显，后期就不明显了。因此研制能在较长时间跨度里释放诱导因子的载体系统具有实际应用意义。石膏(CaSO4)也可以作为载体，但石膏反应产热，对生物因子活性有影响。多聚体类不能彻底降解；生物类总不能完全解决免疫性问题；且后两类均无一定的力学强度。而CPC的材料特性基本克服了以上所有不足，利用磷酸钙骨水泥固化过程温和的特性，将BMP与CPC均相复合，使材料在填充修复的同时又具有诱导加速成骨作用，促进骨愈合，从而有望成为BMP的非常理想的载体，有望彻底解决骨折延迟愈合及骨不连、骨缺损的治疗问题，具有较高的学术价值和广阔的应用前景。基于此，Ohura K.etal(Bone Defect Repair Using SubcutaneouslyInduced Bone by a Bioresorbable Calcium Phosphate Cement Combinedwith rhBMP-2，Biocerams.，Proc.Int.Symp.Ceram.Med.，1999，12，237-240)将CPC固化好后的固化体吸附rhBMP-2，结果成骨效果提高。王文波(上海医科大学博士学位论文，1997年)，侯春林等(CN9911985.4)、曹战强等(中国人民解放军总医院硕士学位论文，2000年)分别单独将发明人研制的CPC直接复合rh-BMP2植入动物体内后，可加速CPC的降解和新骨的形成。但BMP的使用量均比较高，在1gCPC粉末中含5mgBMP以上才有比较明显的成骨活性。可能源于BMP直接复合于CPC中，从表面上看未检测到小含量的蛋白的引入影响CPC的固化，但是CPC水化反应过程中的酸碱反应却对生物活性因子有一定影响，使BMP在低浓度时不易发挥作用。同时人体新骨的形成是多种生物活性因子共同作用的结果(张学军等，中华实验外科杂志，1995，1259～60)单一使用BMP，在相同骨诱导能力下，体外引入的活性因子量是体内自身含量的几倍到几十倍以上(Urist MR等，Clin Orthop，1984，187277～80)，故须仿生自体骨特性采用多种因子组合的办法来解决骨诱导再生问题。
本发明需要解决的技术问题之二是公开上述水泥的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题是公开上述水泥的应用，以满足人们的需要。
本发明详细的技术方案如下所述所说的原位自固化磷酸钙原位成骨活性骨水泥由磷酸钙骨水泥(简称CPC)与治疗有效量的复合生物活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品组成，其优选的质量比如下磷酸钙骨水泥∶复合活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品＝1000∶(0.1～150)。
更优选的质量比如下磷酸钙骨水泥∶复合活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品＝1000∶(10～100)。
所说的自固化磷酸钙骨水泥是由几种磷酸钙盐按一定的比例混合的混合物，可以按(US5525148，US5545254)公开的方法配制，可以是磷酸三钙(α型或β型)、磷酸四钙中的一种或两者的混合物；磷酸八钙、磷酸二氢钙、羟基磷灰石、氟磷灰石中的一种或它们的混合物；所说的复合活性因子包涵体或微胶囊为一种海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖或聚肽分子束等包埋生物活性因子的包埋物，其中海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、聚肽分子束等与生物活性因子的质量比为100∶(1～100)，直径为50～1000μm。
所说的生物活性因子为调节、促进骨质生长的细胞因子，包括骨形态发生蛋白系列(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨多肽等中的一种或一种以上，其来源可以是人基因重组，经发酵、分离后得到，也可以直接从动物体内提取得到，其中以BMP-2、BMP-7以及其同FGF的复合为佳。
所说的生物活性因子冻干品为上述生物活性生长因子经冷冻干燥得到的成品。
本发明所说的活性骨水泥的制备方法包括如下步骤1.将海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖或聚肽分子束等与生物活性因子采用微胶囊化包埋技术将生物活性因子包埋在海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖或聚肽分子束等中，获得含有复合生物活性因子的包涵体或微胶囊，所说的微胶囊化包埋技术为一种常规的技术，许多文献均有所报道，本发明不再赘述，一般可采用界面凝聚法、聚合法、喷雾干燥法等，以喷雾干燥法为佳。
2、将平均直径为5～20μm的自固化磷酸钙骨水泥与包涵体或微胶囊或生物活性因子冻干品按比例混合，即可获得原位成骨活性的自固化磷酸钙活性骨水泥。
用生理盐水或其他盐溶液作为固化液，按固液比2∶1～5∶1的比例与其混合均匀，调和成糊状物，即可植入体内。糊状物也可在体外37℃、100％湿度环境中固化后形成的固化体，即可植入体内。
所说的其他盐溶液包括为磷酸盐水溶液。
本发明的优点是十分显著的，分别采用海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖、聚肽分子束等包埋BMP与FGF、TGF-β等的复合物，使其成为含有复合生物活性因子的包涵体或微胶囊，以维持生物活性因子的活性，且隔断生物活性因子同CPC水化反应的直接接触，避免相互之间的影响。
将包埋生物活性因子的包涵体或微胶囊同CPC粉末相复合，然后按常规将固化液与之混合，形成的膏体可以任意塑形，在人体环境与湿度下自行硬化，填充时同周围骨组织紧密结合。这样既不影响CPC自身的性能，又使其生物活性性能大大提高。
在体内生物活性因子可诱导血管、新骨的形成，形成活性组织，实现功能重建，而所使用的CPC固化体又可作为新骨形成的钙源和磷源，加速形成骨组织。
CPC材料植入后，在新骨形成生物愈合前，可以起到一定强度的支撑作用，也可以起到对破碎骨块的粘结作用。
构建的新材料可用于各种原因引起的骨缺损、骨不连、骨延迟愈合的填充修复；创伤骨折中骨折愈合促进剂；四肢骨延长术中骨组织的生长填充加速剂；股骨头坏死用修复材料；椎体压缩性骨折中骨缺损填充或椎体强度强化材料；椎体矫形、融合植入材料；椎体减压植骨材料；关节翻修用材料；钢板、螺钉内固定植入粘结、填充强化材料；颌面骨缺损修复材料；颅骨骨缺损修复材料；牙槽骨缺损修复及牙槽嵴垫高用材料等。
材料的使用可以是直接膏体填充方法，可以是注射的方法，也可以是经皮椎体成形术的方法，还可以是预先固化成型的固化体在术中植骨。
下面将结合实施例进一步阐述本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1称取3g直径小于20μm的由磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成的自固化磷酸钙骨水泥粉末，称取0.3g海藻酸钠，3mg水不溶性的BMP与3mg FGF、3mg TGF-β，喷雾复合包埋制备成直径为500μm微胶囊，并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g生理盐水，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
实施例2
称取3g由磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成直径小于20μm的自固化磷酸钙骨水泥粉末。称取0.3g胶原，3mg水不溶性的BMP与3mgFGF、3mg TGF-β，复喷雾合包埋制备成直径为50～1000μm包涵体，并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g生理盐水，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
实施例3称取有磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成直径小于20μm的自固化磷酸钙骨水泥粉末3g。称取0.3g羟基纤维素，1mg水不溶性的BMP与5mg FGF、3mg TGF-β等的活性复合物，复合包埋制备成直径为50～1000μm包涵体或微胶囊，并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g生理盐水，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
实施例4
称取有磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成直径为10μm的自固化磷酸钙骨水泥粉末3g。称取0.3g聚肽分子束，9mg TGF-β，复合包埋制备成直径为100μm微胶囊，并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g生理盐水，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
实施例5称取3g由磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成的直径为1μm的自固化磷酸钙骨水泥粉末。称取4mg胰岛素样生长因子并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g生理盐水，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
实施例6称取3g由磷酸氢钙、磷酸四钙和羟基磷灰石组成的直径为20μm的自固化磷酸钙骨水泥粉末。称取9mgBMP-2，并将其倒入粉末中，在器皿中分散均匀，加入1.2g浓度为8wt％磷酸盐溶液，用牙科调制刀调和均匀成泥团，置于37℃、100％湿度环境中固化。将固化体植入到15只兔股骨髁部，均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后1年内兔外周血Ca、P浓度无明显波动，90天后碱性磷酸酶活性恢复正常水平。材料植入1个月浅层明显降解，新骨向材料内部生长；3个月后材料降解和新骨替代非常明显；12个月材料基本完全降解且被新生骨替代。
权利要求
1.一种自固化磷酸钙原位成骨活性骨水泥，其特征在于由磷酸钙骨水泥与治疗有效量的复合生物活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品组成。
2.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于质量比如下磷酸钙骨水泥∶复合活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品＝1000∶(0.1～150)。
3.根据权利要求2所述的水泥，其特征在于质量比如下磷酸钙骨水泥∶复合活性因子包涵体或微胶囊、生物活性因子冻干品＝1000∶(10～100)。
4.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于所说的自固化磷酸钙骨水泥是由几种磷酸钙盐的混合物。
5.根据权利要求4所述的水泥，其特征在于磷酸钙盐是磷酸三钙(α型或β型)、磷酸四钙中的一种或两者的混合物，磷酸八钙、磷酸二氢钙、羟基磷灰石、氟磷灰石中的一种及其混合物。
6.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于所说的复合活性因子包涵体或微胶囊为一种海藻酸钠、胶原、羟基纤维素或聚肽分子束包埋水不溶性的生物活性因子的包埋物。
7.根据权利要求6所述的水泥，其特征在于，海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、聚肽分子束与生物活性因子的质量比为100∶(1～100)。
8.根据权利要求6或7所述的水泥，其特征在于，包涵体或微胶囊直径为50～1000μm。
9.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于，所说的生物活性因子包括骨形态发生蛋白系列(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、活性细胞生长因子(FGF)、骨多肽中的一种或一种以上。
10.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于，生物活性因子为BMP-2、BMP-7以及其同FGF的复合物。
11.根据权利要求9或10所述的水泥，其特征在于，生物活性因子来源于人基因重组或动物体内。
12.根据权利要求1所述的水泥，其特征在于，所说的生物活性因子冻干品为权利9中所述的生物活性因子冻干品。
13.根据权利要求1～12任一项所述的水泥的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖或聚肽分子束与生物活性因子采用微胶囊化包埋技术将生物活性因子包埋于海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、壳聚糖或聚肽分子束中，获得含有复合生物活性因子的包涵体或微胶囊；(2)将自固化磷酸钙骨水泥与包涵体或微胶囊或生物活性冻干品按比例混合，即可获得原位成骨活性的自固化磷酸钙活性骨水泥。
14.根据权利要求1～12任一项所述的水泥的应用，其特征在于用生理盐水或其他盐溶液作为固化液，按固液比2∶1～5∶1的比例与其混合均匀，植入体内。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所说的其他盐溶液包括为磷酸盐水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种自固化磷酸钙原位成骨活性骨水泥及其制备方法和应用。分别采用海藻酸钠、胶原、羟基纤维素、聚肽分子束等包埋BMP与FGF、TGF－β等的复合物，以维持生物活性因子的活性。将包埋生物活性因子同CPC粉末相复合，与固化液混合，形成的膏体可以任意塑形，在人体环境与湿度下自行硬化。本发明在体内生物活性因子可诱导血管、新骨的形成，形成活性组织，实现功能重建，而所使用的CPC固化体又可作为新骨形成的钙源和磷源，加速形成骨组织。本发明可用于各种原因引起的骨缺损、骨不连、骨延迟愈合的填充修复。
文档编号A61L31/00GK1416913SQ0215088
公开日2003年5月14日 申请日期2002年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者刘昌胜, 陈芳萍, 杨果诗 申请人:上海瑞邦生物材料有限公司