专利名称：致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂制备方法，特别是致病性嗜水气单胞菌灭活疫 苗的制备方法，属于微生物疫苗制备技术领域。
背景技术：
嗜水气单胞菌广泛分布于近岸海水，河流湖泊，下水道废水中，是一种 条件致病菌，可引起人和多种动物的败血症、腹泻等疾病，在一定条件下会 引起暴发流行，近年来，我国常有因嗜水气单胞菌引起许多水产动物发病或
大量死亡(陆承平，水产学报，1992， 16 (3))以及使人类致病的报道。褐 牙鲆是珍贵的经济鱼类之一，目前在中国北方沿海地区大规模养殖，本发明 人从河北唐山的会达水产公司和普林海珍的发病褐牙鲆体内均分离到致病 菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定表明该菌为嗜水气单胞菌，是导致牙 鲆腹水病和败血症的直接致病菌，感染了该菌的病鱼，出现腹腔积水，肠积 水及出血等症状，该病极易传染，严重时可导致大批牙鲆的死亡，严重危害 养殖业的发展。多年以来，对于该病的防治主要依赖于抗生素的治疗，虽然 有一定效果，但是容易产生耐药性和造成体内、河水环境的药物残留，威胁 人体的健康和安全。因此，寻找治疗该病的安全有效的途径成为业内的共同 任务。

发明内容
本发明的目的是提供一种致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法，克 服了以往此类鱼病使用抗生素治疗所产生的体内药物残留问题。
本发明的构思是这样的免疫，是防治因嗜水气单胞菌引起牙鲆腹水病 和败血症的一条重要途径。本发明直接从病鱼体内分离致病菌，经鉴定后以 该病原菌为抗原制备灭活疫苗。将该疫苗给健康鱼注射后通过凝集试验和间 接ELISA检测免疫后的牙鲆体内的血清抗体水平，从而可以测定疫苗的效果。
具体说本发明的致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法包括以下步
骤(l)通过PCR检测将分离自患腹水病褐牙鲆体内的致病性嗜水气单胞菌 于普通LB培养基中摇培12~16小时，用分光光度计检测OD值，达到0.6以 上或检测菌浓度达到109CFU/mL; (2)用质量分数为0.3% 0.4%甲醛溶液对 致病性嗜水气单胞菌进行灭活，于37'C灭活12小时，其间振摇2 3次；(3) 将所得灭活菌液于5000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水重悬后即 可得到致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗。
使用该疫苗免疫时采用渗透压差的方法进行浸泡免疫，主要激发鱼体的 粘膜免疫。具体操作如下①将待免牙鲆依据生产条件分为若干组，每组20 尾，置于浓度为8"/。的NaCl溶液中，浸泡2分钟；②将浸泡过的牙鲆捞出后 置于10倍稀释的疫苗溶液中，浸泡3分钟，依此类推；③一周之后以同样方 法加强免疫一次。其余词养条件与其他牙鲆一致。
将所制备疫苗腹腔注射于昆明小鼠，经过安全性检测后，试验用的小鼠 一切正常，内脏剖检未见任何异常，初步证明该疫苗使用安全。将疫苗免疫 小鼠两次，通过凝集实验及间接ELISA检测抗血清抗体滴度，在波长450nm 处检测其分光光度，表明阳性孔发生了明显的抗原抗体反应，证明该疫苗具 有良好的免疫原性。第35天以最小致死剂量进行攻毒，生理盐水对照组小鼠 全部死亡，免疫过的小鼠免疫保护率达到80%。
本发明取得的有益效果是该疫苗制备方法操作快速简便，所采用的试 剂无毒无副作用，且价廉易储存，易于进行大量制备。使用该方法制备的疫 苗免疫保护率达到80%,由于该疫苗为纯生物制剂，因此无任何毒副作用， 不会对牙鲆的肉质和周围水体造成污染，可以从根本上遏制病原的传播。为 大规模研制牙鲆灭活疫苗和科学防控牙鲆腹水病奠定了理论和技术基础。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明。 实施例1 致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备 将通过PCR检测的分离自患腹水病褐牙鲆体内的致病性嗜水气单胞菌接种 于普通LB培养基，置于摇床上，设置培养温度为3(TC，调节转速为160rpm
摇培12-16小时，用分光光度计检测OD值达到0.6以上或检测菌浓度达到 109 CFU/mL;用质量分数为0.3% 0.4%的甲醛溶液对致病性嗜水气单胞菌 进行灭活，该混合液于37'C下恒温灭活12小时，其间振摇2 3次；将灭活 过的菌液取lOOjil涂布于平板上，进行无菌检验；取出后将所得灭活菌液置 于离心机上，转速为5000rpm，离心10分钟，将上清液弃去，收集剩余菌体， 根据需要用适量生理盐水重悬后即可得到致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗，放
置在4t:条件下保存备用。
实施例2疫苗免疫实验(1)
2006年4月，在唐山普林海珍水产养殖公司进行小规模免疫实验，随 机抽取30尾平均体重为50g的褐牙鲆，平均分为三组，每组10尾，使用实 施例1制备的致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗进行免疫试验，具体方法如下 首先测定嗜水气单胞菌最小致死剂量(MLD),测得牙鲆的最小致死剂量为1 X109CFU/mL;然后将制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗，采用腹腔注射方法进 行免疫，第一组为生理盐水对照组，第二组为不加强免疫组，第三组为加强 免疫组，每尾牙鲆注射所制备的疫苗250nl，饲养一周后，第三组加强免疫一 次，第二组继续饲养；35天后按照最小致死剂量(MLD)对每尾牙解进行活 菌攻毒实验， 一周内对照组褐牙鲆全部死亡，其余两免疫组的免疫保护率分 别达到60%和80%。 实施例3疫苗免疫实验(2)
依照上述方法于2006年5月，在唐山会达水产养殖公司进行了小规模注 射免疫试验，随机抽取60尾平均体重为100g的褐牙鲆，共分为三组，第一 组为生理盐水对照组，第二组为疫苗免疫组，第三组为疫苗加佐剂免疫组， 每尾牙鲆注射所制备的疫苗250fd,饲养一周后，同法免疫一次；35天后对 每尾牙鲆进行活菌攻毒，按照最小致死剂量(MLD)进行攻毒，每尾注射活菌 量为150nl， 一周内对照组褐牙鲆全部死亡，其余两组的免疫保护率分别达到 70%和80%。
实施例4疫苗免疫实验(3)
在唐山十里海紫天养殖场进行较大规模免疫试验，对200尾牙鲆进行免
疫,将牙鲆分为每20尾一组,每一组先在9%的高浓度NaCl溶液中浸泡2min， 再快速转移至10倍稀释的疫苗溶液中，浸泡3min,依此类推，将200尾牙 鲆全部进行浸泡免疫， 一周后以同样方法加强免疫一次。第35天时随机抽取 20尾进行针刺攻毒实验，免疫保护率达到85%;该200尾受免鱼发病率仅为 5%。
权利要求
1、一种致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)通过PCR检测将分离自患腹水病褐牙鲆体内的致病性嗜水气单胞菌于普通LB培养基中摇培12～16小时，用分光光度计检测OD值，达到0.6以上或检测菌浓度达到109CFU/mL；(2)用质量分数为0.3％～0.4％甲醛溶液对致病性嗜水气单胞菌进行灭活，于37℃灭活12小时，其间振摇2～3次；(3)将所得灭活菌液于5000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水重悬后即可得到致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)将通过PCR检测的分离自患腹水病褐牙鲆体内的致病性嗜水气单胞菌接种于普通LB培养基培养达到一定浓度；(2)用甲醛溶液对该菌进行灭活；(3)离心培养物收集菌体，用生理盐水重悬后得到致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗。该制备方法操作快速简便，易于批量制备，所得疫苗为纯生物制剂，无任何毒副作用，不会对牙鲆的肉质和周围水体造成污染。用该方法制备的疫苗免疫褐牙鲆，其免疫保护率达到80％，可以从根本上遏制病原的传播。本发明为防治褐牙鲆鱼类流行性腹水症提供了新的途径。
文档编号A61K39/02GK101181635SQ20071018535
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月10日 优先权日2007年12月10日
发明者楠 李, 申红旗, 赵宝华 申请人:河北师范大学