专利名称：对肺炎衣原体具有特异反应性的单克隆抗体及其制造方法
技术领域：
本发明涉及对肺炎衣原体具有特异反应性的单克隆抗体，制造此单克隆抗体的方法，产生这种抗体的细胞，制造该细胞的方法，检查和/或测定肺炎衣原体的方法，该方法所用试剂，诊断肺炎衣原体感染的方法和试剂。本发明能够被有效地用于制药工业，特别是用于制造用以诊断肺炎衣原体感染的试剂。
已知有四种衣原体，它们是结膜炎衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉衣原体，和眼结膜衣原体。据信肺炎衣原体会引起呼吸道感染，非典型肺炎等等。
由于肺炎衣原体引起的呼吸器官感染的症状与肺炎支原体或流感病毒引起的感染的症状相似，医师经常对此作出错误的判断。所以，就需要开发一种诊断肺炎衣原体引起的感染的简单方法。
一般，通过检测感染部位的病原细胞或者通过检测体液，如血清等中的该病原细胞的抗体，就能可靠地诊断出感染。前一种方法被称为抗原试验，而后者被称为抗体试验。二者在临床上都很重要。
抗原试验包括间接荧光抗体技术和直接荧光抗体技术，在间接荧光抗体技术中，被检测的抗原的抗体被加入到试样中，然后加入另一种被荧光剂和类似物作为标记的抗体以测定试样中有无该抗原，在直接荧光抗体技术中，不用另一种荧光抗体，而是将预先被荧光剂和类似物作了标记的待检的抗原的抗体加入到试样中，从而测定试样中有无抗原。
作为肺炎衣原体的抗原，已知有脂多糖(LPSs)和蛋白质。LPSs对衣原体属具有普遍的抗原性。作为蛋白质抗原，39.5KDa，60KDa，75KDa，98KDa蛋白质及其类似物是已知的。39.5KDa蛋白被称为主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein)(下文略为″MOMP″)。
作为对衣原体属有特异性的抗原，GLXA(一种特异性糖脂抗原属)，脂多糖(LPSs)，MOMP及其类似物是已知的。Elizabeth S.Stuart等人报道了抗衣原体属的GLXA的单克隆抗体(CurrentMicrobiology，28，85-90(1994))。Harland D.Caldwell等人报道了抗衣原体属的LPs的单克隆抗体(Infection and Immunity，44(2)，306-314(1984))。他们通过直接荧光抗体技术，用单克隆抗体给肺衣原体的包含体染色。Ellena M.Peterson等人(Infectionand Immunity，59(11)，4147-4153(1991)和Byron E.Batteiger等人(Infection and Immunity，53(3)，530-533(1986))报道了抗衣原体属的MOMP的单克隆抗体。
从Richard S.Stephens等人(J.Immunology，128(3)，1083-1089(1982))的报道开始，已发表了许多有关抗结膜炎衣原体的单克隆抗体。H.Puy等人报道了抗鹦鹉衣原体的单克隆抗体，其中包括在间接荧光抗体试验中对鹦鹉衣原体和肺炎衣原体具有同样反应性的单克隆抗体(Immunology Letters，23，217-222(1989/1990)。但是，尚无单克隆抗体识别出的抗原的描述。Kuroda等人报道了抗眼结膜衣原体的单克隆抗体(Am.J.Vet.Res，54(5)，709-712(1993))。
在一般的用初级体或肺炎衣原体的MOMP的免疫接种中，很难获得能够产生与MOMP中抗原性低的抗原位点有特异性反应的单克隆抗体的细胞。无论是与MOMP的低抗原位点有特异反应的单克隆抗体，还是产生这种抗体的细胞，目前都未得到。
Iijima等人报道了作为抗肺炎衣原体的单克隆抗体的53 KDa蛋白的单克隆抗体(Y.Iijima，J.clinical Microbiology，32(3)，583-588(1994)。
Cho-chou Kuo等人报道了在间接荧光抗体技术中，肺炎衣原体的包含体能被肺炎衣原体有特异性的单克隆抗体(RR402)染色(J.Clinical Microbiology，24(6)，1034-1037(1986)及日本未审查专利申请昭64-500083号)。但是，没有被单克隆抗体识别的抗原的描述。
Izutsu等人报道了与肺炎衣原体反应的单克隆抗体(日本未审查专利申请平7-16098号)。他们揭示出通过间接荧光抗体技术，用单克隆抗体能使包含体染色。
Harland，D，Caldwell等人报道的抗LPS单克隆抗体具有对除肺炎衣原体之外的衣原体属种类的反应性，故难以用这种单克隆抗体专门检测肺炎衣原体。
Ellena M，Peterson等人和Byron E.Batteiger等人报道的抗MOMP的单克隆抗体具有对除肺炎衣原体之外的衣原体属种类的反应性，故难以用这些单克隆抗体专门检测肺炎衣原体。另外，它们未被标记。
尚不清楚Iijima等人报道的抗体是否能专门检测肺炎衣原体。并且，尚无肺炎衣原体的包含体能被该单克隆抗体染色的报道。
Cho-chou等人和Izutsu所用的间接荧光抗体支术的方法需要长时间进行抗原试验，因此，对临床检查中短时间处理大量试样来说是不适宜的。
本发明的一个目的是提供对肺炎衣原体的MOMP具有特异反应性的单克隆抗体。这些单克隆抗体能用来专门检测肺炎衣原体，并能在临床检查中短时间处理大量试样。
本发明的主题是以下物质(1)一种对肺炎衣原体的主要外膜蛋白具有特异反应性的单克隆抗体。
(2)如(1)所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不具有反应性。
(3)如(1)所述的单克隆抗体，其对肺炎衣原体的初级体具有反应性。
(4)如(3)所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不具有反应性。
(5)如(1)所述的单克隆抗体，其中的抗体是被标记的。
(6)如(1)所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的。
(7)如(6)所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
(8)一种单克隆抗体，对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白具有反应性且是被标记的。
(9)如(8)所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体和鹦鹉衣原体的包含体不具有反应性。
(10)如(8)所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
(11)一种产生对蛋白具有特异反应性的单克隆抗体的产生抗体细胞的制备方法，该方法包括给动物免疫接种天然和变性蛋白的一种，并用其他蛋白加强剂量，得到一种产生抗体的细胞，并用骨髓瘤细胞融合该产生抗体的细胞。
(12)如(11)所述的方法，包括给动物免疫接种一种天然蛋白并用一种变性蛋白加强剂量，得到一种产生抗体的细胞，并用骨髓瘤细胞融合该产生抗体的细胞。
(13)如(11)所述的方法，其中的变性蛋白是用去污剂或还原剂处理天然蛋白得到的。
(14)如(11)所述的方法，其中的蛋白是衣原体的主要外膜蛋白。
(15)如(11)所述的方法所制备的产生单克隆抗体的细胞。
(16)一种产生单克隆抗体的细胞，该细胞能产生如(1)所述的单克隆抗体。
(17)如(16)所述的产生单克隆抗体的细胞，是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
(18)一种制备单克隆抗体的方法，包括培养如(15)所述的产生单克隆抗体的细胞。
(19)一种制备单克隆抗体的方法，包括培养如(16)所述的产生单克隆抗体的细胞。
(20)用如(1)所述的单克隆抗体检测和/或测定肺炎衣原体的方法。
(21)如(20)所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
(22)用如(8)所述的单克隆抗体检测和/或测定肺炎衣原体的方法。
(23)如(22)所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
(24)一种检测和/或测定肺炎衣原体的试剂，其中包括如(1)所述的单克隆抗体。
(25)如(24)所述的试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
(26)一种检测和/或测定肺炎衣原体的试剂，其中包括如(8)所述的单克隆抗体。
(27)如(26)所述的试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
(28)一种用如(1)所述的单克隆抗体诊断肺炎衣原体感染的方法。
(29)如(28)所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
(30)一种用如(8)所述的单克隆抗体诊断肺炎衣原体感染的方法。
(31)如(30)所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
(32)一种诊断肺炎衣原体感染的试剂，其中包括如(1)所述的单克隆抗体作为活性成分。
(33)如(32)所述的诊断试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
(34)一种诊断肺炎衣原体感染的试剂，其中包括如(8)所述的单克隆抗体作为活性成分。
(35)如(34)所述的诊断试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
优选的对肺炎衣原体的MOMP具有特异反应性的单克隆抗体包括，对肺炎衣原体的MOMP具有特异性反应而对结膜炎衣原体的MOMP不具反应性的单克隆抗体和对肺炎衣原体的MOMP具有特异性反应并对肺炎衣原体的初级体具有反应性的单克隆抗体。较优选的是对肺炎衣原体的MOMP具有特异性反应而对结膜炎衣原体的MOMP不具反应性且对肺炎衣原体的初级体有反应性的单克隆抗体。
对肺炎衣原体的MOMP具有特异反应性的单克隆抗体的具体例子包括，杂交瘤细胞系CP-6产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系CP-11中产生的单克隆抗体及类似物。杂交瘤细胞系CP-6和CP-11已按布佩斯条约的条款在the National Institute of Bioscience andHuman-Technology，the Agency of Industrial Science andTechology(1-3，Higashi lchome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，Japan)以FERM BP5-5155和FERM BP-5156保藏。
优选的对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白具有反应性的单克隆抗体是那些对结膜炎衣原体和鹦鹉衣原体的包含体不具反应性的单克隆抗体。
对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白具有反应性的单克隆抗体的具体例子包括，杂交瘤细胞系AY6E2E8产生的单克隆抗体及类似物。杂交瘤细胞系AY6E2E8已按布达佩斯条约的条款在the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，the Agencyof Industrial Science and Technology以FERM BP-5154保藏。
本发明还涉及能产生对蛋白具有特异反应性的单克隆抗体的产生细胞的制备方法，其中包括给动物免疫接种天然蛋白和变性蛋白的一种，用其他蛋白加强剂量，得到产生抗体的细胞，用骨髓瘤细胞融合该产生抗体的细胞。
本发明的制备产生抗体细胞的方法特征是，给动物免疫接种，除此它还能够按通常的步骤包括给动物免疫接种，细胞融合，融合的细胞的筛选，产生特异性抗体的细胞的筛选，克隆等等来完成。
本发明方法所用的蛋白包括衣原体，特别是肺炎衣原休属，细菌，病毒的MOMP，动物，包括人以及植物所衍生的各种蛋白及类似物。
天然蛋白被定义为保持原始空间结构的蛋白质，包括衣原体，细菌，病毒有机体本身，例如，衣原体的EB，以及蛋白质的部分和完全提纯物。天然蛋白被用作免疫接种的抗原。肺炎衣原体的各种菌株衍生的抗原能用作特蛋白抗原。例如，能够使用YK-41菌标的和EBS和TWAR。
变性的蛋白被定义为以下条件下的蛋白质，其在生理溶液中的原始空间结构已被某种处理所破坏，以及以下条件下的蛋白质，其双硫键(S-S键)也已断开，且优选其氨基酸序列被识别为抗原位点。变性蛋白也可用作免疫接种的抗原。由于免疫接种变性蛋白充分地加强了产生变性蛋白中抗低抗原性位点的抗体的细胞，故即使在只免疫接种天然蛋白难以得到产生抗天然蛋白的单克隆抗体的细胞的情况下，也能容易地得到产生抗体细胞。
在用天然蛋白或变性蛋白作免疫接种的抗原时，只诱发形成蛋白中抗高原性位点的抗体，而难以有效地诱发形成抗低抗原性位点的抗体。
用作免疫接种抗原的肺炎衣原体的MOMP和EB可以通过例如下文实施例描述的方法从YK-41菌株中制得。
使蛋白质变性的方法包括但不限于以下方法，用还原剂或洗涤剂处理，热处理，用有机溶剂处理等。优选用还原剂或洗涤剂处理的方法。还原剂包括但不限于2-巯基乙醇。洗涤剂包括但不限于SDS(十二烷基苯磺酸钠)。
被免疫接种的哺乳动物包括小鼠，鼠，兔子，羊，鸡等。小鼠是特别优选的。
哺乳动物用天然蛋白和变性蛋白的一种免疫接种并用其他蛋白作最后接种，优选用天然蛋白免疫接种并用变性蛋白最后免疫接种。在肺炎衣原体的情况下，建议用肺炎衣原体的EB或天然MOMP给哺乳动物免疫接种再用变性蛋白，例如已被洗涤剂或还原剂处理变性的MOMP进行最后免疫接种。
另外，在免疫接种中优选使用一种辅助剂。辅助剂的优选例子包括弗氏完全佐剂(下文略为″FCA″)，弗氏不完全佐剂(下文略为″FIA″)及类似物。
免疫接种一般可通过1-5或更多次的注射完成。抗原的注射量一般可为每只哺乳动物1ng-10mg，并能随抗原的不同而改变。
最后免疫接种一般可通过1-5或更多次的注射完成。抗原的注射量一般可为每只哺乳动物1ng-10mg，并能随抗原的不同而改变。通常，用于最后免疫接种的抗原量为免疫接种中所用量的1/100至1/10。
经上述方法足量的免疫接种后，从被免疫接种的哺乳动物中分离出脾细胞，B淋巴细胞或类似物作为能产生抗体的母体细胞。
一般可用骨髓瘤细胞作为制备杂交瘤细胞系的其他母体细胞。例如，可以使用小鼠的P3U1，NS-1，653，SP2，X63，MPC-11及类似物，鼠的AG1，AG2，AG3，RCY3，210及类似物，人的SKO-007及类似物。优选的是小鼠的细胞，特别优选P3U1，653及类似物。
细胞融合可用聚乙二醇法，Sendai病毒法，电融合法等等。优选用聚乙二醇的方法。
杂交瘤细胞的筛选可通过在只能使感兴趣的杂交瘤细胞生长的筛选培养基中培养来进行。例如，HAT(次黄嘌呤氨蝶呤胸苷)培养基，HAz(次黄嘌呤重氮丝氨酸)培养基等是优选的培养基。
筛选产生特异性抗体的细胞，是通过回收井中的上清液，该井中的培养基中生长了所需的杂交瘤细胞，再用所需蛋白(如肺炎衣原体的EB或MOMP)检查是否存在有由酶抗体技术或免疫印迹技术形成的抗体来完成。
克隆被定义为以一个克隆衍生的一细胞群的形式获得产生特异性抗体的细胞的过程。克隆可通过有限稀释培养法，把菌落置于软琼脂上的方法，单细胞处理法，FACS法等方法进行。有限稀释培养方法较简单，故是优选的。
产生单克隆抗体的细胞可用上述方法获得。
通过本发明方法获得的产生单克隆抗体的细胞包括杂交瘤细胞系CP-6和CP-11。
用所述方法获得的产生单克隆抗体的细胞可在适宜的培养基中培养以产生单克隆抗体。或者，通过给小鼠等注射得到的杂交瘤细胞系，再收集腹水得到单克隆抗体。
培养基包括，补以胎儿腓肠血清的改善Eagle培养基(MEM培养基)，Dulbecco的改善Eagle培养基(DMEM培养基)，RPM11640培养基等等。
从培养液的上层清液中回收单克隆抗体可通过用蛋白A柱，蛋白G柱等的亲和色谱法，离子交换色谱法，聚乙二醇分馏法，乙醇分馏法，硫酸铵分馏法及类似的方法进行。优选的是亲和色谱法，更优选的是使用蛋白A柱。
对所得的单克隆抗体可测定其对所需的蛋白的特异反应性。例如，用Western印迹法筛选与所需蛋白有特异性反应的单克隆抗体，该法中使用了经适当溶剂处理和电泳处理的有机物。更具体地，可测定单克隆抗体对肺炎衣原体的MOMP或EB的特异反应性，和/或与53KDa抗原蛋白的反应性。对肺炎衣原体的MOMP的特异反应性可被定量测定，方法是用Western印迹法测定与分子量约39.5KDa的MOMP带有特异反应性的抗体的存在，该法中使用用适宜溶液处理和电泳处理的肺炎衣原本的EB。可以相信被定量测定为对肺炎衣原体的MOMP有特异反应性的单克隆抗体识别了作为抗原表位的肺炎衣原体的MOMP氨基酸序列。
研究与单克隆抗体反应的抗原蛋白是这样进行的用λgtll及类似物制备肺炎衣原体的cDNA库，表达cDNA来得到肽，令单克隆抗体与所得到的肽反应，分析与单克隆抗体特异反应的cDNA的密码子，该密码子插入λ噬菌体。
本发明制备单克隆抗体的方法能够制备任何类型(球蛋白类型)的抗体。可以使用单克隆抗体的片段和有单克隆抗体片段的分子。
本发明方法制备的单克隆抗体能将蛋白中低抗原性位点识别为抗原表位，这在以前是难以做到的。更特别的是，它们能识别作为抗原表位的蛋白质平面结构或氨基酸序列。
对肺炎衣原体的MOMP有特异反应性的单克隆抗体和对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白有反应性的单克隆抗体可以通过以下方法得到，例如，培养本发明方法制备的产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤细胞系)，收集培养物上层清液，然后用上述方法提纯。在本方法中为了制备产生单克隆抗体的细胞所用的免疫接种可用已知技术完成。
优选地，本发明所得的单克隆抗体基本不与衣原本属的其他种类，如结膜炎衣原体，和鹦鹉衣原体反应。特别是，更优选基本不与衣原体属其他所有种类的MOMP而仅与肺炎衣原体的MOMP反应的单克隆抗体，和与肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白有特异性反应的单克隆抗体，因为它们能用于诊断肺炎衣原体特异性疾病种类。
如果单克隆抗体在直接或间接荧光技术中与肺炎衣原本之外的种类反应，但严格地说只具低的反应性，它们能从呈高反应性的那些中被识别出来，故能实用于诊断中。这种单克隆抗体也是有用的。单克隆抗体不应与经常分离的结膜炎衣原体发生交叉反应是很重要的，但它们是否与不经常分离的鹦鹉衣原体和眼结膜衣原体发生交叉反应并不是那么重要。如果单克隆抗体在直接或间接荧光技术中与肺炎衣原体高度反应但只与其他种类(如鹦鹉衣原体)微弱反应，而与其他种类(如结膜炎衣原体和眼结膜衣原体)根据不反应，它们就能用于确定哪个种类的衣原体引起的疾病，故它们是优选的。
本发明的单克隆抗体包括任何类型(球蛋白类型)的抗体。还包括单克隆抗体的片段(Fab，fab′，fab′2等)和有单克隆抗体的片段的分子。
对肺炎衣原体的MOMP有特异反应性的单克隆抗体和对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白有反应性的单克隆抗体可以被标记。
给单克隆抗体作标记可以是在单克隆抗体上结合一种标记试剂，如各种染料，胶体，酶等。
染料包括荧光染料，如FITC(荧光素5-异硫氢酸盐)，若丹明，荧光素等。FITC以其适用性和易得性而成为优选。FITC可由SigmaCo.，Ltd购得。
胶体包括金胶体等等。
酶包括过氧化物酶，碱性磷酸酶，荧光素酶，β-半乳糖苷酶等等。
给单克隆抗体结合上标记可用任何已有技术，如″EXPERIMENTALIMMUNOLOGY″中所述的方法，Ivan Lefkovits等人编，NishimuraShoten，(1985)。
另外，在单克隆抗体和标记试剂之间可以插入化学物质，如生物素，抗生物蛋白，链抗生物素蛋白，digoxygenin等等。
由于FITC结合在抗体的赖氨酸残基上，结果是用FITC标记使某些抗体失去其抗原结合活性。
用例如直接或间接标记之后的本发明单克隆抗体能检测和/或测定肺炎衣原体。用上述方法可直接给本发明单克隆抗体作标记。用已被标记试剂(已标记的另一种抗体)标记的、能识别并与单克隆抗体结合的抗原能给本发明单克隆抗体间接标记。该另一种抗体包括兔子抗一小鼠免疫球蛋白抗体等等。在标记试剂是荧光感染的情况下，用紫外线照射它并检测和/或测定所发生的荧光。当标记试剂是酶时，加入底物检测和/或测定由酶的催化反应产生的发色和颜色增强。如果需要，在两种情况下均可使用敏化剂。
检测和/或测定肺炎衣原体的试剂包括未标记的或标记的本发明单克隆抗体本身及其混合物，至少包括以下成分的一种。
(1)、抑制非特异性免疫反应的物质(如，牛的血清清蛋白)(2)、用作标记试剂的酶的底物(3)、敏化剂(4)、控制抗原(肺炎衣原本的MOMP，53KDa抗原蛋白)(5)、作了标记的另一种抗体这些成分无论单独使用或两种或多种混合使用，优选制成冻干制品以便于临床应用。
检测和/或测定肺炎衣原体的试剂能直接用作诊断肺炎衣原体感染的试剂。
本发明的单克隆抗体能用于诊断肺炎衣原体感染。肺炎衣原体感染能用检测和/或测定肺炎衣原体的试剂或诊断肺炎衣原体感染的试剂来诊断。在试用这些试剂和诊断试剂的试验中，当试样呈现阳性时就证实肺炎衣原体感染的发生。
优选使用本发明单克隆抗体的混合物，由于抗原的量随试样不同，故它能识别不同的抗原。
可以混合单克隆抗体的例子包括对肺炎衣原体的MOMP有反应性的单克隆抗体和对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白有反应性的单克隆抗体。
另外，本发明单克隆抗体可以与其他单克隆抗体或多种隆抗体混合。
本发明单克隆抗体和本发明方法制得的那些抗体可以用在检测所需蛋白的方法中，特别是使用免疫反应，如放射免疫测定法，酶免疫测定法等的方法中。它们也能用作科学研究中诊断试剂的成分。如果需要，它们能直接或以嵌合剂或饮剂或抗体的形式用在药物制剂中。
另外，本发明单克隆抗体和本发明方法制备的那些抗体能用在诊断工具箱中，它们在其中通过聚合酶链反应结合起来。
本发明产生抗体的细胞还能用作抗体基团的来源。抗体基团能表现在各种细胞中。
以上描述是本发明的概括说明。参考以下具体实施例可对本发明有更完全的理解，这些例子在此只用于说明之目的，而不是限制本发明的范围。实施例1制备对肺炎衣原体(1)的MOMP有特异性的单克隆抗体1.1制备肺炎衣原体的EB为了制备肺炎衣原本的EB，使用YK-41菌株。根据Kishimoto等人的方法[KENSA TO GIFUTU(试验和技术)18(7)，959-964(1990)]用YK-41菌株感染人的肺细胞(下文称为″HL细胞″)。在24-或6-井佩特里细菌培养皿中培养的感染细胞被刮出并和培养基一起回收，然后以6000rpm离心分离30分钟。去掉上层清液后，沉淀物被悬浮在蔗糖，磷酸盐和谷氨酸的混合溶液中[含7.5(w/v)蔗糖，3.8mMKH2PO4，7mM K2HPO4和5mM谷氨酸，(PH7.4)，下文称为″SPG″]。用均质机破碎悬浮物然后以2500rpm离心分离10分钟。去掉上层清液，沉淀物悬浮于SPG中。重复这些过程5次，然后回收上层清液。回收的上层清液与23％(v/v)的Urografin(Nihon Schering K.K.)和50％(w/v)的蔗糖按上层清液Urografin蔗糖＝2∶2∶1的体积比混合，然后以8000rpm离心分离1小时。去掉上层清液后，回收下层[50％(w/v)蔗糖层]并悬浮于SPG中，洗涤后以10000rpm离心分离30分钟。吸走上层清液，沉淀物悬浮于SPG中，以1∶4的体积比与密度梯度为26.6-38％(v/v)的Urografin混合，以8,000rpm离心分离1小时，回收中间层并悬浮于SPG。以10000rpm离心分离30分钟后，吸去上层清液，沉淀物悬浮于适宜量的SPG中，于是得到EB溶液。分配后，该溶液存储于4℃或-70℃。
1.2制备肺炎衣原体的MOMP用盘式制备电泳分离和提纯上文1.1所得的EB溶液，由此得到肺炎衣原体的MOMP。简要地说，0.5ml所得的EB溶液[蛋白(EB)浓度727μg/ml]与0.5ml 2X试样缓冲液
混合，在100℃煮沸3分钟以使蛋白质溶解。然后，将全部体积加入到盘式凝胶(基层凝胶4％；分离凝胶10％)中，进行电泳[设备盘式预备电泳设备NA-1800 Nippon Eido K.K.制造；操作条件100V(直流电压)]并于一定体积回收(0.26ml/部分)。对于每部分进行SDS平板电泳(设备DNA-PAGE电泳设备NB-5000，Nippon Eido K.K.制造；操作条件100V(直流电压)]。结果证明分子量为39.5K的MOMP在第33至45部分被回收(蛋白浓度0.21mg/ml)。
1.3制备杂交瘤细胞系和单克隆抗体上述过程得到的EB的生理盐水(0.5ml)与0.6mlFCA(Difco)混合。用近距离声波定位器(Branson)处理所得混合物得到油包水乳化物，用它作为免疫接种的抗原。用五只8周的BALB/c雌性小鼠，每只腹膜内给药200μl此抗原(一剂中EB的量为10μg/小鼠)。给药6天和12天后，用FIA(Difco)进行免疫接种。此免疫接种后6天后给动物放血。用点免疫束测定法(dot immuno binding assay)(下文简称为″DIBA″)测定每份得到的血清浆液的抗体效价。自测定抗体效价那天开始对呈现最高抗体效价的动物进行三天最后免疫接种，自尾部静脉给药200μl由上述方法得到的提纯MOMP(一剂中的MOMP的量1μg/小鼠)。三天最后免疫接种完成后次日将每只小鼠颈脱位处死并取出脾。然后将单细胞分散从而制得用于细胞融合的脾细胞。细胞融合的匹配细胞是P3U1小鼠骨髓瘤细胞，它是在CO2细胞培养器(Napco)中，37℃，5％CO2及饱和湿度下，在补以10％(v/v)牛胎儿血清的Dulbecco MEM培养基(下文述为″10F培养基″)里预告培养的。
上述脾细胞(4.8×107)和P3U1小鼠骨髓瘤细胞(1.2×107)混合，以1000rpm离心分离10分钟。然后吸走上层清液。施以轻微的振动，0.2ml细胞融合加速剂[50％(W/V)聚乙二醇；分子量4000；Merck制造)使细胞粒松散。1分钟45秒后，用1分钟加入10ml培养液。再加入20ml培养液以使细胞悬浮。然后，将分散液离心分离和逐级分离(300rpm3分钟，500rpm3分钟，700rpm3分钟)。吸走上层清液后，向细胞粒中加入5％Briclone(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)(下文称为″10F＋Bri培养基″)以制备细胞分散液。此细胞分散液分散在96-井平底多层盘中(Corning)得到细胞密度为4×104骨髓瘤细胞/井/0.1ml，然后在37℃，5％CO2和饱和湿度下恒温培养。
次日，含HAT的10F培养基(补以1×10-4M次黄嘌呤，4×10-7M氨蝶呤，1.6×10-5胸苷和10％(v/v)牛胎儿血清的Dulbecco′s MEM培养基；下文称为″HAT培养基″)按体积为0.1ml/井加入到井中。此外，每3至4天用HAT培养基替换一半的培养液上层清液；如此，称为HAT筛选的过程进行约2星期。能观察到杂交瘤细胞系生长的井中上层清液被收集和用DIBA筛选，制备抗EB的抗体。
用96-井u形底多层盘进行DIBA(Corning)。预先将作为抗原的EB以0.02μg/点的量固定于3mm方膜过滤器上(Advantec；47mm直径格滤器；Cat.No.A045b047A)，向该过滤器加入10％(v/v)FCS(胎儿腓肠血清)，在室温下反应15分钟。然后，去掉上层清液，加入100μl的杂交细胞系培养上层清液，在室温下反应1小时。去掉上层清液，加入100μl稀释500倍的过氧化物酶标记的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗体(Cappel Inc.)，室温下反应1小时。最后，加入4-氯-1-萘酚作为底物使反应溶液上色。在固定有抗原膜过滤器上能裸眼观察到颜色出现的井被断定为在抗体制备中呈阳性。
在上述筛选得到结论呈抗体制备阳性的那些井中的杂交瘤细胞系，通过有限稀释培养法次克隆。简单地说，抗体制备阳性杂交瘤细胞悬浮于HAT培养基中，测定悬浮液的细胞密度。然后将悬浮液稀释，分散在一个新小盘上，细胞密度为从2至100个细胞/100μl/井，恒温培养。使用HT＋5％Briclone培养作稀释剂。
当观察到高倍稀释的井中有杂交瘤细胞的生长时，检测杂瘤细胞产生抗体的能力，并显微观察来证实其是单克隆，然后重复同样的操作过程以制备产生抗EB的单克隆抗体的克隆，其具有很高的能力来维持抗体的产生。对每个如此获得的克隆，培养规模逐渐加大。最后，每个克隆培养在50ml 10F培养基中，并检查培养物上层清液产生抗体的特性。
到此所述的试验规程进行了两遍，最后得到表1所示的10支产生单克隆抗体的克隆菌株。
由上述10支杂交瘤细胞克隆产生的单克隆抗体的球蛋白类采用ISOTYPE-Ab-STAT-1成套用具(Kit)(Sang Stat Medical)进行测定。
如表1所示，单克隆抗体CP-1，CP-2，CP-4，CP-5，CP-6，CP-7和CP-8对结膜炎衣原体不呈现反应性，但对肺炎衣原体呈现反应性。
下一步，将由10F培养基培养每个产生如表1所示单克隆抗体的杂交瘤克隆而获得的繁殖细胞以1×107个细胞/小鼠的量给预先经0.5ml Pristan(Wako Purechemical Co.，Ltd.)处理过的BALB/C小鼠由腹腔接种。接种后两至三周，从每只小鼠体内得到腹水，从其中提纯得到本发明的单克隆抗体。
用下述方法提纯接种杂交瘤克隆No.6所得到腹水，其中使用了固定化蛋白A的亲合柱。简单的说，向小鼠腹水中加入等量的1.5M甘氨酸和3M NaCl(PH8.9)的混合物。所得混合物通过0.45μm的尼龙过滤器(Corning)，送入蛋白A-Poros(NGK Insulators Ltd.)亲合柱，并用1.5M甘油和3M HaCl(PH8.9)的混合物洗涤。然后，用含150mMNaCl的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)将抗体洗脱。
用1M Tris-HCl缓冲液(PH9.0)中和之后，洗脱物被冷却，用PBS渗析过夜。测定所回收的溶液在280nm的吸收率(用Model U-2000，Hitachi，Ltd)通过0.2μm乙酸纤维素过滤器(Corning)，于-80℃下贮存，从而制得提纯抗体的溶液。
1.4单克隆抗体的特异性分析用免疫印迹法进行单克隆抗体的特异性分析。用上文1.1所述的方法制得的EB溶液(EB浓度727μg/ml，测定对肺炎衣原体的反应性，具体地说，将含50μg EB的EB溶液与试样缓冲剂
以1∶1的体积比混合，煮沸10分钟。然后，所得混合液进行电泳[设备AE-6560，Atto有限公司制造；凝胶Pagel 1020 DL；电泳缓冲剂0.025M Tris，0.192M甘油，0.1％(w/v)SDS，(PH8.3)；操作条件直流电流20mA，80分钟]。用NA-1510(Nippon Eido K.K.)作为转移设备，电泳脉体，两层3mm厚的滤纸(Whatman)和硝化纤维膜(Bio Rad)浸在预浸渍在冰中的转移缓冲剂
中15分钟。在一个垫片上，放有滤纸，凝胶，硝化纤维膜和依此顺序的滤纸，然后，将另一个垫片放在顶端，并将它们放在转换设备中。该设备被放在冰中，于50V直流电压下开启2小时，将蛋白质转移到硝化纤维膜上。用PBS(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)洗涤硝化纤维膜(每次2分钟，共两次，振摇)，然后用10％FCS/PBS终止(室温下振摇30分钟)，再用PBS(Nissui药物有限公司)，洗涤硝化纤维膜(每次2分钟，共三次，振摇)，并与每个表1所列的所有杂交瘤细胞的培养物上层清液反应(室温下振摇1小时)。用PBS(每次两分钟，共三次，振摇)洗涤之后，硝化纤维膜与稀释500倍的过氧化物酶标记的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗体(Cappel Inc.)在室温、振摇下反应1小时。用PBS(每次两分钟，共三次，振摇)洗涤硝化纤维膜，然后加入成色溶液(1ml的3mg/ml 4-氯-1-萘酚，5ml PBS，2μl过氧化氢水溶液)进行反应，直到蛋白带出现。然后用蒸馏水洗涤膜数次终止反应。
在上述类似条件下进行免疫印迹法，用提纯的结膜炎衣原体(菌株L2)的EB分析对结膜炎衣原体的反应性。
结果是，本发明的CP-6和CP-7两个单元克隆抗体对结膜炎衣原体的MOMP不呈现反应性，而对肺炎衣原体的MOMP呈现反应性。
1.5 用荧光抗体技术分析抗体(对结膜炎衣原体，鹦鹉衣原体和眼结膜衣原体的反应性)结膜衣原体，鹦鹉衣原体和眼结膜衣原体的离析物分别点样(1μl)于载玻片上，将每一种表1所示的所有杂交瘤细胞的培养物上层清液置于其上(8μl)。然后，将载玻片放在湿箱子中，反应在其中于37℃进行3小时。用PBS和蒸馏水洗涤载玻片，然后空气干燥。空气干燥后将8μl稀释10倍的FITC标记的抗小鼠球蛋白/山羊血清(KPL Inc.)放在载玻片上盖住所有斑点。将载玻片放在湿箱子中，反应于37℃下进行30分钟。然后洗涤载玻片并空气干燥。加入100μl包埋溶液(50％甘油-PBS)以形成包含体，用荧光显微镜检测。结果，本发明的CP-6和CP-7两种单克隆抗体只在它们与肺炎衣原体在一起时有亮点，说明这些抗体与EB反应。
产生上述单克隆抗体CP一6的杂交瘤细胞以杂交瘤细胞和CP-6保藏在the National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technology保藏号(Accession No.)FERM P-14436；BP-5155)。
表1杂交瘤克隆号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10本发明单克隆抗体CP-1CP-2CP-3CP-4CP-5CP-6CP-7CP-8CP-9CP-10球蛋白类型 IgG2b IgG2b IGM IgG2b IgMIgG1IgG3IgM IgM IgM对肺炎衣原体的反应性*1 + + + + + + + + + +对结膜炎衣原体的反应性*2 - - + - - - - - + +*1用DIBA法测定对肺炎衣原体的反应性。
*2用DIBA法测定对结膜炎衣原体L2菌株的反应性。只有单克隆抗体CP-3，CP-9和CP-10被发现呈阳性。
实施例2制备对肺炎衣原体的MOMP有特异性的单克隆抗体(2)用与实施例1中1.1—1.3基本相同的方法获得产生单克隆抗体的克隆(CP-11)的一支菌株，制备抗体CP-11的溶液。
用ISOTYPE Ab-STAT-1 kit(Sang Stat Medical)测定，结果发现杂交瘤细胞克隆CP-11产生的单克隆抗体的球蛋白类型是IgG1。
用与实施例1中1.4基本相同的方法分析杂交瘤细胞克隆CP-11产生的单克隆抗体的特异性。此单克隆衣原体对结膜炎衣原体的MOMP不呈现反应性，对肺炎衣原体的MOMP呈现很强的反应性，对鹦鹉衣原体的MOMP只是呈现极弱的反应性。
另外，用与实施例1中1.5基本相同的方法，用间接荧光抗体技术分析此单克隆抗体。结果如表2所示。
表2反应性*肺炎衣原体+++鹦鹉衣原体±结膜炎衣原体 -眼结膜衣原体 -*极强反应性 +++强反应性 ++弱反应性+极弱反应性 ±未观察到反应性 -如数据所示，根据用此单克隆抗体的间接荧光技术，强反应可断定表示肺炎衣原体；极弱反应可断定表示鹦鹉衣原体；不反应可断定表示结膜炎衣原体或眼结膜衣原体。
产生此单克隆抗体的杂交瘤细胞以杂交瘤细胞系CP-11保藏在the Natioal Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technolgy(Accession No.FERM P-14592；Bp-5156)。
从以上结论可推断此单克隆抗体能识别肺炎衣原体的MOMP暴露在EB膜外面的那部分氨基酸序列。
实施例3制备杂交瘤细胞系AY6E2E8产生的单克隆抗体。
用杂交瘤细胞系AY6E2E8产生的单克隆抗体作为单克隆抗体。杂交瘤细胞AY6E2E8保藏于the National Institute ofBioscience and Human-technology，Agency of IndnstrialScience and Technology(Accession No.FERM P-13688；BP-5154)。
给小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞系AY6E2E8得到含单克隆抗体的腹水，向1体积的该腹水中加入3体积PBS，混合，并于3000rpm离心分离10分钟。用孔径大小为0.22μm的过滤器滤出上层清液，通过高压液相色谱法(HPLC法)用预先经PBS平衡了的色谱超级蛋白A柱Chromatop Superprotein A Column)(4.6mm dia.×100mm，NGKInsulators，Ltd.)提纯。
用0.22μm过滤器过滤后的试样(1ml)被倒入该柱中，然后以1ml/min保持3分钟和5ml/min保持4分钟加入PBS进行洗涤。向此柱中以2ml/min的速率加入1升纯水保持5分钟，其水中溶解有8.77gNaCl，16.7g柠檬酸(一水合物)和14.72g Na2HPO4·12H2O，洗脱单克隆抗体。收集含有单克隆抗体的部分。向这些部分加入2M三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液，将pH值调整至7-9。所得溶液在4℃下贮存。
实施例4与杂交瘤细胞系AY6E2E8产生的单克隆抗体反应的抗原蛋白分析4.1制备肺炎衣原体菌株YK-41的基因组的DNA由上述1.3所得提纯的肺炎衣原体菌株YK-41的EB悬浮液(300μl)(蛋白浓度1.37mg/ml)在4℃下以12000rpm离心分离5分钟。将沉淀物悬浮于500μl含有1mM EDTA的Tris-HCl缓冲液(PH8.0)中(下文称为″TE缓冲液″)。再进行一次类似的离心分离，然后将沉淀物悬浮于300μl TE缓冲液中。向悬浮液中加入30μl 1％的SDS水溶液和30μl 1mg/ml的蛋白酶K水溶液，于56℃恒温培养30分钟，溶解EB。向所得溶液中加入350μ1 0.1M的Tris-HCl缓冲液(PH8.0)饱合酚，用涡流混合机充分混合。然后，在4℃下以12000rpm离心分离5分钟，回收水层(DNA提取液)。重复这一提取过程。然后向回收水层中加入2μl 10mg/ml RNase溶液，于37℃恒温培养2小时，从而分解RNA。向所得溶液中加入300μl 0.1M Tris-HCl缓冲液(PH8.0)饱和酚，氯仿和异戊醇按25∶24∶1(体积比)的混合液(下文称为″PCI″)，用涡流混合机充分混合，在4℃下以12000rpm离心分离5分钟。然后回收所得水层。这一操作总共重复5次。
向所得溶液中加入1/10体积的10M醋酸铵水溶液和2体积的乙醇，沉淀DNA5分钟，然后在4℃下以12000rpm离心分离5分钟。对于沉淀过程，加入600μl 70％的乙醇水溶液，混合后在4℃下以12000rp离心分离5分钟，重复此过程两次。将离心管放置15分钟，并打开盖子以干燥沉淀物。将沉淀物溶解在200μl TE中，于-20℃贮存。
4.2制备基因组DNA库向100μl所得的基因组DNA溶液中加入10μl限制酶的M-缓冲液和10μl限制酶的混合物(通过混合AccI，Hae III各0.4μl和用20μl ITE稀释AluI的1/50稀释液)，在37℃恒温培养20分钟。反应时间20分钟是基因组DNA被分解成部分水解的、大小为1kbp-7kbp的DNA片段所需的时间。预先用少量的基因组DNA来测定反应时间。向上述反应溶液中加入100μl PCI，用涡流混合机充分混合，在4℃下以12000rpm离心分离5分钟，然后回收水层。向此水层中加入3M醋酸钠水溶液(10μl)和乙醇(220μl)，于-80℃下放置15分钟，使部分水解的DNA沉淀。在4℃下以12000rpm离心分离5分钟之后，排掉上层清液。向沉淀物中加入500μl 70％的乙醇水溶液，混合后以12000rpm再次离心分离5分钟。排掉上层清液，将沉淀物减压干燥。
将上述得到的部分水解的DNA溶解在20μl纯水中。向19μl此溶液中加入14μl下文描述的连接剂(20pmole/μl)，4.5μl 10mMATP，4.5μl含50mM MgCl2的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，50mM二硫苏糖醇和500μg/ml牛血清清蛋白(下文称为″10X络合化缓冲液″)，2μl纯水和1μl T4连接酶，在16℃下恒温培养4小时，从而使连接剂连在DNA上。
5′-AATTCGAACCCCTTCG-3′3′-GCTTGGGGAAGCp-5′将连上连接剂的部分水解的DNA送入Chroma Spin 6000柱，其中的流动相是含有0.1M NaCl和1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液。收集两滴洗脱物。用0.8％琼脂胶电泳分析每一个部分的位置，回收含1kbp-7kbp DNA片段部分。向如此得到的144μl部分中，加入13μl纯水，20μl 10mM ATP，20μl含0.1M MgCl2的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，50mM二硫苏糖醇，1mM亚精胺氢氯化物和1mM EDTA(下文称为″10X磷酸化缓冲液″)和3μl多核苷酸激酶，于37℃下恒温培养30分钟，将DNA片段的5′末端磷酸化。向反应溶液中加入PCI(200μl)，振摇使混合充分，在4℃下以12000rpm离心分离5分钟。然后回收水层。向回收层中加入1μl 20mg/ml糖原水溶液，20μl 3M醋酸钠水溶液和400μl乙醇，以沉淀核苷酸。所得溶液在4℃下以12000rpm离心分离10分钟。向沉淀物中加入200μl乙醇，重新离心分离。排掉上层清液，将沉淀物空气干燥，再溶解于1μl纯水中。
向0.6μl如此得到的溶液中加入1μl预先用EcoRI水解了的入gtllDNA(1μg/μl，层基因)0.5μl 10X络合化缓冲液，0.5μl10mM ATP，0.4μl T4连接酶和2μl纯水，在4℃下恒温培养过夜。用Gigapack II Gold Packaging Kit(层基因)，将所得λgtll DNA重组体包裹起来。
4.3克隆抗原多肽的DNA密码大肠埃希杆菌(E.Coli)的Y 1090r菌株全环被培植在添加3ml10mM MgSO4，0.2％麦芽糖和50μg/ml α-氨基苄青霉素的LB培养基中，(在1升水中含5g NaCl，10g多胨和5g酵母提取物)，于37℃，振摇下恒温培养过夜，然后以2000rpm离心分离10分钟。向沉淀物(E.coli)中加入9ml 10mM的MgSO4水溶液并混合。量出所得E.coli悬浮液的一部分(0.35ml)。向此悬浮液中加入0.1-10μl的λgtll(DNA库)悬浮液，在37℃下恒温培养20分钟，用λgtll感染E.coli。向2.5ml预先在47℃放置的液体LB琼脂培养基中加入上述λgtll感染的E.coli。立即从LB琼脂培养基上将此培养基刮出。上层琼脂培养基变硬后，细胞在42℃恒温培养3-4小时。当观察到斑块，将在10mM IPTG水溶液中浸渍的硝化纤维过滤器(φ82mm)置于上层琼脂培养基的上面，细胞进一步在37℃下恒温培养12小时。用装有黑墨水的注射器针头贯穿，在硝化纤维过滤器上标上三个不对称的点。然后从琼脂培养基上移走硝化纤维，用含有150mM NaCl和0.1％Tween 20的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5，下文称为″TTBS″缓冲液″)洗涤3次。将琼脂培养基置于冷藏箱中。
硝化纤维过滤器被浸渍在含150mM NaCl并添加0.1％牛血清清蛋白的20mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.5，下文称为″TBS缓冲液″，在37℃下摇动1小时完成中断反应。然后用TTBS缓冲液洗涤硝化纤维两次，浸于5-10μg/ml对肺炎衣原体有特异性的单克隆抗体(AY6E2E8)的TTB溶液，在37℃下振摇1小时。用TTBS缓冲液洗涤硝化纤维3次，然后在TTBS缓冲液中的过氧化物酶标记的(50ng/ml)抗一小鼠IgG抗体溶液中于37℃下振摇1小时。用TTBS缓冲液洗涤硝化纤维3次，再用TBS缓冲液洗涤3次。然后将过滤层浸上成色溶液中(其制备是向100ml TBS缓冲液中加入60μl 30％的过氧化氢水溶液和20ml 0.3％的4-氯-1-萘酚甲醇溶液)，在室温下放置约30分钟。当得到足够的颜色时，从溶液中将滤层回收出来，用纯水洗涤并进行空气干燥。
找出并辩认与硝化纤维上的色点对应的琼脂培养基上的斑点。用Pasteur′s吸管贯穿在这些位置的琼脂来回收斑块。在含有0.1M NaCl，8mM硫酸镁和0.01％明胶的50mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5，下文称为″SM缓冲液″)中滴入一滴氯仿后，把回收的斑块放入其中；将混合物放置过夜，提取斑块中的λ噬菌体。重复上述过程直到所有的斑块变成与上述单克隆抗体可反应。于是，克隆了抗原多肽的DNA密码。
结果是得到了能表达肺炎衣原体属特异性的抗原多肽的λ噬菌体，该抗原多肽已与肺炎衣原体特异性单克隆抗体反应。
4.4培养得到的λ噬菌体，提纯DNA用与上述4.3基本相同的方法制备斑块。回收其中一个斑块，放入100μl SM缓冲剂中，在4℃下放置过夜，提取λ噬菌体。预先将250μl E.coli菌件Y1090 r-在LB培养液中恒温培养过夜，加入λ噬菌体溶液(5-10μl)，在37℃下放置20分钟，从而用λ噬菌体感染E.coli。预先将含有10mM硫酸镁的LB培养基加热至37℃，把感染了的细胞放在其中培养，细胞于摇动下于37℃恒温培养5-7小时，直到入噬菌体引起E.coli溶解。然后加入250μl氯仿，以3000rpm离心分离10分钟以去掉E.coli细胞残渣。于是得到λ噬菌体悬浮物。用WizardλPreps Kit(Promega)提纯λ噬菌体DNA。
4.5放大肺炎衣原体抗原多肽的DNA密码在600μl微管中，放入61.5μl纯水，10μl 10X反应缓冲液(Tris-HCl缓冲液，pH8.3，含有500mM KCl，15mM MgCl2和0.01％明胶)，1μl 20mM dNTP，0.1μl得到的λ噬菌体DNA溶液，1μl 20nMλgtll正向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，1μl 20nMλgtll反向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和0.5μl AmpliTaq DNA聚合酶，然后将2-3滴矿物油在其顶端铺成层。在以下条件下恒温培养，94℃，30秒，55℃，30秒，73℃ 2分钟，重复30次，从而放大DNA。反应完成后，对反应混合物进行低温熔化琼脂糖胶体电泳。将放大的DNA剪断，用Wizard PCR Prep Kit(Promega)提纯。
4.6分析DNA基础序列通过荧光标记的终止剂循环序列方法，用Taq DNA聚合酶分析DNA基础序列，用PCR放大的DNA作样板，将反应产物供给Model373A DNA Sequencer(Applied Biosystems)。将所得的DNA基础序列剪辑，结扎，用DNA序列软件″DNASIS″(Hitachi SoftwareEngineering)测定它们的氨基酸翻译区位。
结果是，发现所得的λ噬菌体DNA，是肺炎衣原体的53K道尔顿抗原蛋白的氨基酸序列的密码。
由此可知杂交瘤细胞系AY6E2E8产生的单克隆抗体将肺炎衣原体的53随尔顿抗原蛋白识别为抗原。
实施例5制备荧光标记的抗体按照前述Ivan Lefkovits等人的方法，用FITC分别给杂交瘤细胞系CP-11和AY6E2E8产生的单克隆抗体标记。
将FITC-Celite(Sigma，Cat，No.F1628)溶解在DMSO中，制备10mg/ml溶液。
另一方面，使用NAP-10柱，用0.1M NaHCO3缓冲液(pH8.2-8.6)代替溶有单克隆抗体的缓冲液。
向1.5ml得到的单克隆抗体溶液(单克隆抗体含量2mg)，加入50μl FITC溶液，在4℃下静置8小时。
所得反应溶液通过PD-10柱，用PBS平衡。用PBS去掉未反应的FITC。于是得到FITC标记的单克隆抗体。
实施例6制备冷冻干燥制剂将1.9mg FITC标记的单克隆抗体，7.6mg Evans blue(WakoPurechemical Co.，Ltd.)，1.9g牛血清清蛋白(GIBCO BRL)和1.9ml 10％NaN3(Wako Purechemical Co.，Ltd.)溶解在PBS(-)(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)中至总体积为100ml。
所得溶液被分配在1ml小瓶中，在-80℃下放置1小时，然后在冷冻干燥器中(Iwaki & Co.，Ltd.)冷冻干燥过夜。如此得到冷冻干燥制剂(即CP-11制剂和AY6E2E8制剂)。
另一方面，用与上述类似的方法，用杂交瘤细胞系CP-11和AY6E2E8的FITC标记的单克隆抗体制备混合的冷冻干燥制剂。实施例7用直接荧光抗体技术给肺炎衣原体包含体染色将每一个由实施例6制备的冷冻干燥制剂溶解在2ml纯水中。在点有肺炎衣原体菌株YK-41的载玻片上放上8μl所得溶液，使所有的点上部位全部被此溶液盖住。然后，将载玻片放在湿箱子里，反应在其中于37℃下进行30分钟。洗涤载玻片并空气干燥。反应产物用100μl包埋溶液[50％(v/v)甘油-PBS]包埋，用荧光显微镜检测。结果列于表3中。
表3制剂 染色强度*CP-11制剂 +AY6E2E8制剂 +混合制剂 ++*极强的反应性 ++强的反应性+-如表3所示，无论CP-11制剂还是AY6E2E8制剂均呈现强的反应性，使肺炎衣原体的检测成为可能。与单一制剂相比，混合制剂呈现出极强的反应性，用该试剂能够很好地检测肺炎衣原体。
本发明的对肺炎衣原体的主要外膜蛋白具有特异性反应的单克隆抗体在特别检测肺炎衣原体中非常有用，因为此单克隆抗体对微生物中大量含有的MOMP具有特异性反应。另外，用少量的此抗体即能完成检测。
本发明的单克隆抗体的特征还在于它对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不呈现任何反应性，适于将肺炎衣原体感染与结膜炎衣原体感染区分开来，后者在临床上经常是单独分开的。故，此抗体对准确诊断出肺炎衣原体感染非常有用。
此外，本发明的标记了的抗体使得能够利用以此标记的物质检测和测定肺炎衣原体。因此，这些抗体对临床测试中快速处理大量试样非常有用。
本发明的对肺炎衣原体的53K道尔顿抗原蛋白具有反应性、并作了标记的单克隆抗体对准确诊断肺炎衣原体感染很有用，因为此抗体能够检测出作为肺炎衣原体属的特异性抗原的53K道尔顿抗原蛋白。
产生上述单克隆抗体的细胞系能用于连续、大量地制备这些抗体。这些细胞系也可用作抗体基因的来源。
本发明的用这些细胞系制备单克隆抗体的方法能够用以连续和大量地制备上述的单克隆抗体。
本发明的检测和测定肺炎衣原体的方法以及检测和测定肺炎衣原体的试剂可用在非常精确地检测和测定肺炎衣原体的方法中。
本发明的肺炎衣原体感染的诊断方法和肺炎衣原体感染的诊断试剂可用在非常精确地诊断肺炎衣原体的方法中。
根据本发明制备产生单克隆抗体的细胞系的方法，能够制备有效产生抗那些蛋白的单克隆抗体的细胞系，而用常规的方法却难以完成抗那些蛋白的单克隆抗体的制备。本发明产生抗体的细胞系所产生的单克隆抗体能用于特别检测目标蛋白的各种诊断方法和诊断试剂中，它们也可以用作药物。
上述产生抗体的细胞系能用以连续和大量地产生这些单克隆抗体，还能用作抗体基因的来源。
用上述细胞系制备单克隆抗体的方法能用以连续和大量地制备上述单克隆抗体。
权利要求
1.一种对肺炎衣原体的主要外膜蛋白具有特异反应性的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不具有反应性。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其对肺炎衣原体的初级体具有反应性。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不具有反应性。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中的抗体是被标记的。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的。
7.如权利要求6所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
8.一种单克隆抗体，对肺炎衣原体的53KDa抗原蛋白具有反应性且是被标记的。
9.如权利要求8所述的单克隆抗体，其对结膜炎衣原体和鹦鹉衣原体的包含体不具有反应性。
10.如权利要求8所述的单克隆抗体，其中的抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
11.一种产生对蛋白质具有特异反应性的单克隆抗体的产生抗体细胞的制备方法，该方法包括给动物免疫接种天然和变性蛋白的一种，并用其他蛋白加强剂量，得到一种产生抗体的细胞，并用骨髓瘤细胞融合该产生抗体的细胞。
12.如权利要求11所述的方法，包括给动物免疫接种一种天然蛋白并用一种变性蛋白加强剂量，得到一种产生抗体的细胞，并用骨髓瘤细胞融合该产生抗体的细胞。
13.如权利要求11所述的方法，其中的变性蛋白是用洗涤剂或还原剂处理天然蛋白得到的。
14.如权利要求11所述的方法，其中的蛋白是衣原体的主要外膜蛋白。
15.如权利要求11所述的方法所制备的产生单克隆抗体的细胞。
16.一种产生单克隆抗体的细胞，该细胞能产生如权利要求1所述的单克隆抗体。
17.如权利要求16所述的产生单克隆抗体的细胞，是杂交瘤细胞包系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
18.一种制备单克隆抗体的方法，包括培养如权利要求15所述的产生单克隆抗体的细胞。
19.一种制备单克隆抗体的方法，包括培养如权利要求16所述的产生单克隆抗体的细胞。
20.用如权利要求1所述的单克隆抗体检测和/或测定肺炎衣原体的方法。
21.如权利要求20所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
22.如权利要求8所述的单克隆抗体检测和/或测定肺炎衣原体的方法。
23.如权利要求22所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
24.一种检测和/或测定肺炎衣原体的试剂，其中包括如权利要求1所述的单克隆抗体。
25.如权利要求24所述的试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
26.一种检测和/或测定肺炎衣原体的试剂，其中包括如权利要求8所述的单克隆抗体。
27.如权利要求26所述的试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
28.一种用如权利要求1所述的单克隆抗体诊断肺炎衣原体感染的方法。
29.如权利要求28所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
30.一种用如权利要求8所述的单克隆抗体诊断肺炎衣原体感染的方法。
31.如权利要求30所述的方法，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
32.一种诊断肺炎衣原体感染的试剂，其中包括如权利要求1所述的单克隆抗体作为活性成分。
33.如权利要求32所述的诊断试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)产生的，且随后被标记。
34.一种诊断肺炎衣原体感染的试剂，其中包括如权利要求8所述的单克隆抗体作为活性成分。
35.如权利要求34所述的诊断试剂，其中的单克隆抗体是杂交瘤细胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)产生的，且随后被标记。
全文摘要
本发明涉及对来自肺炎衣原体的主要外膜蛋白和初级体具有特异性反应，但对结膜炎衣原体的主要外膜蛋白不具任何反应性的单克隆抗体；对肺炎衣原体的53K道尔顿抗原蛋白具有反应性，但对结膜炎衣原林、鹦鹉衣原体的包含体不具任何反应性的单克隆抗体；制备这些单克隆抗体的方法；产生它们的细胞系；用它们检测和测定肺炎衣原体的方法；含有它们的检测和测定肺炎衣原体的试剂；用它们诊断肺炎衣原体感染的方法；以它们作为活性成分的诊断肺炎衣原体感染的试剂。
文档编号A61K39/395GK1133192SQ9511582
公开日1996年10月16日 申请日期1995年8月3日 优先权日1994年8月3日
发明者黑岩保幸, 马场宪三, 川越清隆, 井口晃史, 守川俊英, 井筒浩, 中尾义喜, 山木光男, 永山朱美, 中野博子, 斋藤茂 申请人:日立化成工业株式会社