专利名称：一种盐酸柔红霉素脂质体注射液及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种盐酸柔红霉素脂质体注射液及其生产工艺，具体地说是用硫酸铵浓度梯度法生产盐酸柔红霉素脂质体注射液。
背景技术：
盐酸柔红霉素是临床上常用的蒽环类广谱的抗肿瘤药物。目前主要应用于急慢性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，以及一些实体肿瘤，如神经母细胞瘤，肾母细胞瘤和Ewing肉瘤等。但是如同其他抗肿瘤化疗药物一样，盐酸柔红霉素在使用过程中对患者产生较大的毒副作用，主要限制剂量的毒副作用有骨膸抑制和心脏毒性，此外还有胃肠道反应、脱发，药量蓄积产生的对盐酸柔红霉素的耐药等。这些毒副作用极大地限制了盐酸柔红霉素的临床应用。而应用脂质体包裹盐酸柔红霉素则不失为一种非常理想的降低毒性的方法。
脂质体为磷脂双层膜结构，主要成分是磷脂和胆固醇，对人体无毒性、无免疫原性。由于其粒径大小、表面易被控制，容量大，具膜特性和生物兼容性等特点，近年来被用于一些抗肿瘤药物的包裹。当药物被投放到病灶部位后，药物从脂质体中缓慢释放出来，达到降低毒性提高疗效的目的。但是由于脂质体的组分容易与血浆蛋白(调理素)结合，随后被网状内皮系统吞噬，使其很快在血循环中被清除。药物稳定性及包封率较低，漏出率较高，脂质体的体循环时间较短。

发明内容
本发明的目的是提供一种毒性小、包封率高、稳定性好的盐酸柔红霉素脂质体注射液。
本发明的另一个目的是提供这种盐酸柔红霉素脂质体注射液的生产工艺。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种盐酸柔红霉素脂质体注射液，它由脂质体膜和包埋在其中水相的盐酸柔红霉素组成，盐酸柔红霉素和脂质体膜的药/脂比例(w/w)最高为0.2∶1。
所述脂质体膜中含有大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。我们对脂质体膜的成分进行了改造，加入大分子的多聚乙烯-乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSE-PEG2000)，这种新型脂质体可非常有效地躲避网状内皮系统的吞噬，稳定性及包封率得到提高，漏出率降低，使新型脂质体的体循环时间明显延长。此种脂质体在病灶组织中的浓度也显著提高，而在心脏骨髓等脏器的浓度降低，达到降低毒性的作用。
所述脂质体膜基本上由注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)组成。
一种盐酸柔红霉素脂质体注射液的生产工艺，它包括以下步骤(1)制备多层脂质体配制注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇及多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋转蒸发成膜，加入硫酸铵溶液水化；(2)制备小单层脂质体将步骤(1)得到的含有多层脂质体的硫酸铵溶液经挤压机挤压成均匀的小单层脂质体液，除去脂质体外的硫酸铵；(3)制备盐酸柔红霉素脂质体将注射用盐酸柔红霉素溶入浓度为5～15％蔗糖液中，在65℃条件下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入到小单层脂质体液中，水浴15～60分钟，使盐酸柔红霉素进入小单层脂质体中，冷却至室温，除去蔗糖和游离的盐酸柔红霉素得到成品。
所述步骤(1)中注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和DSPE-PEG2000三者的摩尔比为1.5～2.5∶0.5～1.5∶0.06～0.2。
所述步骤(1)中硫酸铵溶液的浓度为125～250mM，pH值为5～6。
所述的pH值优选5.5。
所述步骤(2)中除去脂质体外的硫酸铵是指用浓度为5～15％蔗糖pH 5～6平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
所述的pH值优选5.5。
所述步骤(3)中的蔗糖液的浓度优选为10％。
所述步骤(3)中除去蔗糖是指用经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。
本发明的优点是本发明提供的新型脂质体可非常有效地躲避网状内皮系统的吞噬，稳定性及包封率得到提高，漏出率降低，使新型脂质体的体循环时间明显延长。此种脂质体在病灶组织中的浓度也显著提高，而在心脏骨髓等脏器的浓度降低，达到降低毒性的作用。
使用本发明提供的方法制得的盐酸柔红霉素脂质体包封率高(95％以上)，渗漏率低，脂质体粒径均匀，稳定性好。4℃放置保存一年粒径无变化，包封率仍在90％以上。同时该方法便于灭菌及除去热原，可规模生产。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
实施例11、制备多层脂质体将注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)，胆固醇和DSPE-PEG2000分别溶于氯仿中，将三者混合，摩尔比为1.5∶0.5∶0.06。将上述混合液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在125mM，pH5硫酸铵溶液中。
2、制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压。挤压使用不同孔径的碳纤维膜。用5％蔗糖pH5平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3、制备盐酸柔红霉素脂质体将一定量的注射用盐酸柔红霉素溶于5％蔗糖液中，在65℃下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体液中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖，除去游离的盐酸柔红霉素。药/脂比为0.1∶1(w/w)。最后过0.22微米的微孔膜除菌、热原及其他杂质。即得到盐酸柔红霉素脂质体成品。
实施例21、制备多层脂质体将注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)，胆固醇和DSPE-PEGG2000分别溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，将三者混合，摩尔比为1.5∶0.5∶0.06。将上述混合液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在200mM，pH5.5硫酸铵溶液中。
2、制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压。挤压使用不同孔径的碳纤维膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3、制备盐酸柔红霉素脂质体将一定量的注射用盐酸柔红霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体液中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖，除去游离的盐酸柔红霉素。药/脂比为0.2∶1(w/w)。最后过0.22微米的微孔膜除菌、热原及其他杂质。即得到盐酸柔红霉素脂质体成品。
实施例31、制备多层脂质体将注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)，胆固醇和DSPE-PEG2000分别溶于氯仿中，将三者混合，摩尔比为2.5∶1.5∶0.2。将上述混合液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6硫酸铵溶液中。
2、制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压。挤压使用不同孔径的碳纤维膜。用15％蔗糖pH6平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3、制备盐酸柔红霉素脂质体将一定量的注射用盐酸柔红霉素溶于15％蔗糖液中，在65℃下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体液中混合，在65℃水浴中放置45分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖，除去游离的盐酸柔红霉素。药/脂比为0.15∶1(w/w)。最后过0.22微米的微孔膜除菌、热原及其他杂质。即得到盐酸柔红霉素脂质体成品。
实施例41、制备多层脂质体将注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)，胆固醇和DSPE-PEG2000分别溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，将三者混合，摩尔比为2.5∶1.5∶0.2。将上述混合液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在200mM pH5.5硫酸铵溶液中。
2、制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压。挤压使用不同孔径的碳纤维膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3、制备盐酸柔红霉素脂质体将一定量的注射用盐酸柔红霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体液中混合，在65℃水浴中放置60分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖，除去游离的盐酸柔红霉素。药/脂比为0.2∶1(w/w)。最后过0.22微米的微孔膜除菌、热原及其他杂质。即得到盐酸柔红霉素脂质体成品。
实施例51、制备多层脂质体将注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)，胆固醇和DSPE-PEG2000分别溶于氯仿中，将三者混合，摩尔比为2∶1∶0.1。将上述混合液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在200mMpH5.5硫酸铵溶液中。
2、制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压。挤压使用不同孔径的碳纤维膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3、制备盐酸柔红霉素脂质体将一定量的注射用盐酸柔红霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体液中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖，除去游离的盐酸柔红霉素。药/脂比为0.2∶1(w/w)。最后过0.22微米的微孔膜除菌、热原及其他杂质。即得到盐酸柔红霉素脂质体成品。
本方法是利用盐酸柔红霉素在硫酸铵梯度作用下与硫酸根形成胶样沉淀物，非常稳定地存在于脂质体水相中。由于大豆氢化卵磷脂是高相变温度磷脂(Tm＝52℃)，在65℃条件下形成液态，使盐酸柔红霉素进入脂质体水相中。在低于52℃条件下则形成结晶态，使包裹其中的盐酸柔红霉素不易渗漏。因此本方法制得的盐酸柔红霉素脂质体在4℃条件下保存一年后包封率仍在90％以上，脂质体粒径均匀无变化。
采用本发明工艺所制成的成品经检测盐酸柔红霉素的包封率为95％以上，回收率90％，磷脂，胆固醇及DSPE-PEG2000的回收率为85％左右。
以人白血病细胞系HL60进行的体外细胞毒试验表明作用48小时后，柔红霉素对细胞的半数致死量IC50＝0.056μg/ml，脂质体柔红霉素IC50＝0.077μg/ml。作用72小时后，柔红霉素对细胞的半数致死量IC50＝0.003μg/ml，脂质体柔红霉素IC50＝0.005μg/ml。因柔红霉素从脂质体中缓慢释放，二者无显著差别。但体内毒性试验表明，脂质体显著降低了柔红霉素的毒性。以昆明小鼠进行的毒理实验表明，柔红霉素的小鼠半数致死量LD50＝5.453mg/k0g，脂质体柔红霉素组在药量上升至18mg/kg时，仅有20％的小鼠死亡。此外，体内生物代谢实验表明，脂质体柔红霉素在血中的浓度约为游离药物的5倍。维持较高的血药浓度使脂质体柔红霉素更易到达肿瘤组织。体内治疗实验表明，脂质体柔红霉素较游离柔红霉素具有更好的抗肿瘤效应。
权利要求
1.一种盐酸柔红霉素脂质体注射液，它由脂质体膜和包埋在其中水相的盐酸柔红霉素组成，盐酸柔红霉素和脂质体膜的药/脂比例(w/w)最高为0.2∶1。
2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于所述脂质体膜基本上由注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)组成。
3.一种盐酸柔红霉素脂质体注射液的生产工艺，其特征在于它包括以下步骤(1)制备多层脂质体配制注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇及多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋转蒸发成膜，加入硫酸铵溶液水化；(2)制备小单层脂质体将步骤(1)得到的含有多层脂质体的硫酸铵溶液经挤压机挤压成均匀的小单层脂质体液，除去脂质体外的硫酸铵；(3)制备盐酸柔红霉素脂质体将注射用盐酸柔红霉素溶入浓度为5～15％蔗糖液中，在65℃条件下将盐酸柔红霉素蔗糖液加入到小单层脂质体液中，水浴15～60分钟，使盐酸柔红霉素进入小单层脂质体中，冷却至室温，除去蔗糖和游离的盐酸柔红霉素得到成品。
4.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述步骤(1)中注射用大豆氢化卵磷脂(HSPC)、胆固醇和DSPE-PEG2000三者的摩尔比为1.5～2.5∶0.5～1.5∶0.06～0.2。
5.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述步骤(1)中硫酸铵溶液的浓度为125～250mM，pH值为5～6。
6.根据权利要求5所述的生产工艺，其特征在于所述的pH值优选5.5。
7.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述步骤(2)中除去脂质体外的硫酸铵是指用浓度为5～15％蔗糖pH 5～6平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
8.根据权利要求7所述的生产工艺，其特征在于所述的pH值优选5.5。
9.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述步骤(3)中的蔗糖液的浓度优选为10％。
10.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述步骤(3)中除去蔗糖是指用经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。
全文摘要
本发明公开了一种盐酸柔红霉素脂质体注射液及其生产工艺。该注射液由脂质体膜和包埋在其中水相的盐酸柔红霉素组成，盐酸柔红霉素和脂质体膜的药/脂比例(w/w)最高为0.2∶1。该生产工艺包括(1)制备多层脂质体；(2)制备小单层脂质体；(3)制备盐酸柔红霉素脂质体。本发明的优点是按照本方法生产的盐酸柔红霉素脂质体注射液毒性小、包封率高、稳定性好。
文档编号A61K31/7028GK1504195SQ0215374
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月4日 优先权日2002年12月4日
发明者马洁, 曹利人, 马 洁 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所, 北京文卓医药生物制品技术开发有限公司