专利名称：红旱莲总黄酮及其提取方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及红旱莲黄酮及其提取方法与应用
背景技术：
红旱莲为藤黄科金丝桃属植物(Hypericum ascyron L),别称黄海棠等,有平肝、止血、清热解毒功效。用于治疗出血、跌打损伤、疮疖肿痛等症。目前对红旱莲的功效成分研究尚少，申请号200610038949公开了一种提取红旱莲中总黄酮类成分的方法，包括40 95%醇提、浓缩、AB-8, HPD- 100大孔树脂或过聚酰胺柱、洗脱、浓缩干燥等步骤。

发明内容
本发明目的在于提供一种快速高效提取红旱莲总黄酮的方法。本发明的技术方案为
红旱莲总黄酮，依照下列步骤来制备
(1)取红旱莲全草原料经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎；
(2)取红旱莲全草粉末，按1:3(Γ50的固液比加入体积分数为5(Γ60%的乙醇，以60(T800W的微波功率辅助提取3. 5^4. 5分钟；
(3)真空浓缩直至无醇味，用NKA- 9型大孔树脂对红旱莲总黄酮进行静态分离纯化，其工艺条件为上样浓度3 - 4 mg/mL、吸附pH5 - 7、吸附温度30 - 40°C、解吸乙醇浓度60 - 70%、解吸液料比10-20:1 ;收集解吸液；
(4)将解吸液真空浓缩，干燥。红旱莲总黄酮的提取方法，其特征在于包含下列步骤
(1)取红旱莲全草原料经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎；
(2)取红旱莲全草粉末，按1:3(Γ50的固液比加入体积分数为5(Γ60%的乙醇，以60(T800W的微波功率辅助提取3. 5^4. 5分钟；
(3)真空浓缩直至无醇味，用NKA- 9型大孔树脂对红旱莲总黄酮进行静态分离纯化，其工艺条件为上样浓度3 - 4 mg/mL、吸附pH5 - 7、吸附温度30 - 40°C、解吸乙醇浓度60 - 70%、解吸液料比10-20:1 ;收集解吸液；
(4)将解吸液真空浓缩，干燥。前述静态分离纯化可以用蒸馏水将黄酮浓缩液稀释至上样浓度3 - 4 mg/mL，调节PH5 - 7 ;以树脂湿重上样量为1:2(Γ25的比例配制黄酮与树脂的吸附溶液，将溶液置于3(T40°C的恒温振荡器上振荡充分吸附，吸附结束后将溶液过滤，Γ3倍体积蒸馏水冲洗树月旨，并加入60 - 70%的乙醇并置于振荡器上充分解吸，收集解吸液。为了达到更好的提取效果，红旱莲原料粉碎后过4(Γ80目筛。为了达到更好的解吸效率及保护总黄酮的活性，解吸过程可以在振荡器上实行，2小时即可达到较好的解吸效果。采用真空浓缩及真空冷冻干燥。本发明还涉及到一种药物组合物，包含所述的红旱莲总黄酮和药学上可接受的辅料。所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、丸剂、浸膏剂、口服液或糖浆剂等常规的药学剂型。本发明还涉及到红旱莲总黄酮作为抗氧化剂的应用。本发明的有益效果
(I)提取时间短，效率高，节约能源。本发明在红旱莲总黄酮提取上采用微波提取
3.5^4. 5分钟即可达到常规回流提取3小时左右、或超声辅助提取20分钟左右相近的提取率，大大节约了时间。微波提取通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，无温度梯度升温快速均匀，热效率高。常规回流提取需要在90°C下回流提取3小时左右，热效率较低，并需要大量的冷却水冷却。超声辅助提取需要在75°C左右下提取22分钟，热效率不高 并需要配备加热设备，相比之下微波提取在节约能源上更具优势。(2)选择性好在微波场中，不同物质对微波能的吸收程度不同，这样就使得原料中的某些区域或某些组分被选择性加热，从而选择性的提取原料中有效成分。实验中发现超声提取液很难过滤，回流提取液颜色较深。(4)本发明在红旱莲总黄酮纯化上使用NKA - 9型大孔树脂，所得红旱莲总黄酮纯化物的纯度高达75 - 82%，纯化效果好，纯化工艺简单，生产成本低，易实现工业化；黄酮的回收率能达到75 - 85%，吸附量大、回收率高。(5)本发明方案提取纯化后的红旱莲总黄酮活性保护好，抗氧化实验展示出良好的抗氧化能力。
具体实施例方式下面结合实例对本发明做进一步说明。总黄酮含量测定方法及黄酮得率计算
(I)总黄酮含量测定方法采用NaNO2- Al(NO3)3- NaOH比色法测定总黄酮含量。具体操作如下取I mL提取液于10 mL比色管中，用95%的乙醇定容至5 mL。加入5% NaNO2溶液O. 5 mL,摇勻，放置6 min后加入10% Al (NO3) 3溶液O. 5 mL,摇勻，放置6 min后加入4%NaOH溶液4 mL摇匀，静置15 min后，以相应溶液空白为参比，于500 nm处测定其紫外吸光度A。(2)黄酮得率的计算以芦丁为对照，取质量浓度为O. 098 mg/mL的芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0、1、2、3、4、5 mL于10 mL比色管中，后续操作同样品。得芦丁含量C (mg/mL)与吸光度(A)的回归方程·Λ = 10. 093C + O. 002，R2 = O. 9996，线性范围为O. 098 - O. 490 mg/mL。通过回归方程得黄酮得率计算式
半*Π,日 ι/η 八(J-0.002)x IOx ICr3 V 1ΛΛ
黄酮得率(％) = ----X — XlUO
'10.093W
式中A :紫外吸光值 V:提取液体积(mL) W:样品质量(g)
实施例I
取红旱莲全草原料，经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎。取粉末20 g，加入800 mL60%的乙醇溶液，放入微波炉中以640W的功率微波辅助提取4 min。提取结束后冷却至室温，真空过滤并测定黄酮的得率为5.9%。滤液在50°C下进行真空浓缩直至无醇味。用蒸馏水将黄酮浓缩液稀释至3. 5 mg/mL并用稀盐酸调节pH至6。以树脂湿重上样量为1:25的比例配制黄酮与树脂的吸附溶液。将溶液置于35°C的恒温振荡器上振荡吸附6 h。吸附结束后将溶液过滤，用2倍体积的蒸馏水冲洗树脂，并加入200 mL的60%的乙醇并置于振荡器上解吸2 h。解吸结束后过滤解吸液去除树脂，计算的黄酮的回收率为85%。将滤液在50°C下真空浓缩成浓稠的膏状物。将膏状物于_80°C下预冻6 h，_60°C下真空冷冻干燥12 h。最终黄酮的纯度为81%。实施例2
取红旱莲全草原料，经5(T60°C干燥至含水量10 15%，粉碎。取粉末20 g，加入1000 mL50%的乙醇溶液，放入微波炉中以800W的功率微波辅助提取3. 5 min。提取结束后冷却至室温，真空过滤并测定黄酮的得率为5.6%。滤液在50°C下进行真空浓缩直至无醇味。用蒸馏水将黄酮浓缩液稀释至3 mg/mL并用稀盐酸调节pH至5。以树脂湿重上样量为1:25的比例配制黄酮与树脂的吸附溶液。将溶液置于40°C的恒温振荡器上振荡吸附6 h。吸附 结束后将溶液过滤，用2倍体积的蒸馏水冲洗树脂，并加入100 mL的70%的乙醇并置于振荡器上解吸2 h。解吸结束后过滤解吸液去除树脂，计算的黄酮的回收率为81%。将滤液在45°C下真空浓缩成浓稠的膏状物。将膏状物于_80°C下预冻6 h，_60°C下真空冷冻干燥12 h。最终黄酮的纯度为77%。实施例3
取红旱莲全草原料，经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎。取粉末20 g，加入600 mL50%的乙醇溶液，放入微波炉中以640W的功率微波辅助提取4. 5min。提取结束后冷却至室温，真空过滤并测定黄酮的得率为5.5%。滤液在45°C下进行真空浓缩直至无醇味。用蒸馏水将黄酮浓缩液稀释至4 mg/mL并用稀氢氧化钠调节pH至7。以树脂湿重上样量为1:25的比例配制黄酮与树脂的吸附溶液。将溶液置于30°C的恒温振荡器上振荡吸附6 h。吸附结束后将溶液过滤，用2倍体积的蒸馏水冲洗树脂，并加入200mL的70%的乙醇并置于振荡器上解吸2 h。解吸结束后过滤解吸液去除树脂，计算的黄酮的回收率为76%。将滤液在50°C下真空浓缩成浓稠的膏状物。将膏状物于_80°C下预冻6h，_60°C下真空冷冻干燥12 h。最终黄酮的纯度为75%。实施例4红旱莲黄酮抗氧化能力的测定
取实施例I纯化的红旱莲总黄酮，配成不同浓度，进行抗氧化能力测定的实验。通过测定红旱莲黄酮对DPPH自由基、羟基自由基、总还原能力、总抗氧化能力以评价红旱莲总黄酮的抗氧化能力。结果表明，同等条件下，红旱莲总黄酮清除DPPH自由基的EC5tl为O. 00797mg/mL, VC为O. 00371 mg/mL,由此看出，红旱莲总黄酮有较好的清除DPPH自由基的能力。红旱莲总黄酮清除羟基自由基的EC5tl为O. 145mg/mL,VC为O. 190 mg/mL,由此看出，红旱莲总黄酮有较好的清除羟基自由基的能力(优于VC)。此外，I mg/mL的红旱莲总黄酮的总还原能力与O. 4 mg/mL的VC的总还原能力相当；与VC的总抗氧化能力相比较，红旱莲总黄酮也呈现出一定的抗氧化性。由此可见，红旱莲黄酮是一种比较好的天然抗氧化剂。实施例5微波提取与常规提取红旱莲总黄酮对比试验
(I)溶剂回流法
取红旱莲全草粉末20 g，加入600 mL 60%的乙醇溶液，常规回流提取最佳工艺条件为乙醇浓度60%，固液比1:30，提取温度90°C，提取时间180分钟。此条件下红旱莲总黄酮的提取率为6. 3%。
(2)超声辅助提取法
取红旱莲全草粉末20 g，加入600 mL 60%的乙醇溶液，超声辅助提取的最佳工艺条件为超声功率90W，超声温度75°C，超声时间22分钟，乙醇浓度60%，固液比1:20。此条件下红旱莲总黄酮的提取率为5. 4%。实施例1、2、3提取率与上述常规提取结果相比，可见微波提取在提取时间上，能耗上，都有非常好的效果。实施例6红旱莲黄酮提取物不同剂型的制备
a)丸剂取红旱莲黄酮提取物、淀粉、交联羧甲基纤维素钠分别粉碎过100目筛，混合均匀，用水泛丸，干燥，每丸含红旱莲黄酮提取物O. I - 100 mg，检验合格，包装即得。b) 口服液取红旱莲黄酮提取物，加水溶解，加矫味剂适量，加活性炭5 g，加热 30分钟，滤过，加水至1000 ml，滤过，灌封，灭菌，每ml红旱莲黄酮提取物O. I - 100 mg，检验合格，包装即得。c)糖浆取红旱莲黄酮提取物，加水溶解，加蔗糖500 g及防腐剂适量，煮沸使溶解，滤过，加水至1000 ml，滤过，灌封，灭菌，每ml含红旱莲黄酮提取物O. I - 100 mg，检验合格，包装即得。d)散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、浸膏剂均按常规工艺制备，每片或每颗胶囊中含红旱莲黄酮提取物O. I - 100 mg ;散剂或颗粒剂每小袋为I g含红旱莲黄酮提取物0.1-100 mg，经检验合格后，包装即得。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.红旱莲总黄酮，其特征在于依照下列步骤来制备 (1)取红旱莲全草原料经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎； (2)取红旱莲全草粉末，按1:3(Γ50的固液比加入体积分数为5(Γ60%的乙醇，以60(T800W的微波功率辅助提取3. 5^4. 5分钟； (3)真空浓缩直至无醇味，用NKA- 9型大孔树脂对红旱莲总黄酮进行静态分离纯化，其工艺条件为上样浓度3 - 4 mg/mL、吸附pH5 - 7、吸附温度30 - 40°C、解吸乙醇浓度60 - 70%、解吸液料比10-20:1 ;收集解吸液； (4)将解吸液真空浓缩，干燥。
2.如权利要求I所述的红旱莲总黄酮的提取方法，其特征在于包含下列步骤 (1)取红旱莲全草原料经5(T60°C干燥至含水量1(Γ15%，粉碎； (2)取红旱莲全草粉末，按1:3(Γ50的固液比加入体积分数为5(Γ60%的乙醇，以60(T800W的微波功率辅助提取3. 5^4. 5分钟； (3)真空浓缩直至无醇味，用NKA- 9型大孔树脂对红旱莲总黄酮进行静态分离纯化，其工艺条件为上样浓度3 - 4 mg/mL、吸附pH5 - 7、吸附温度30 - 40°C、解吸乙醇浓度60 - 70%、解吸液料比10-20:1 ;收集解吸液； (4)将解吸液真空浓缩，干燥。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于静态分离纯化为用蒸馏水将黄酮浓缩液稀释至上样浓度3 - 4 mg/mL,调节pH5 - 7 ;以树脂湿重上样量为1:20^25的质量比配制黄酮与树脂的吸附溶液，将溶液置于3(T40°C的恒温振荡器上振荡充分吸附，吸附结束后将溶液过滤，蒸馏水冲洗树脂，并加入60 - 70%的乙醇并置于振荡器上充分解吸，收集解吸液。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于所述的干燥为真空冷冻干燥。
5.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求I所述的红旱莲总黄酮和药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、丸剂、浸膏剂、口服液或糖浆剂。
7.权利要求I所述的红旱莲总黄酮作为抗氧化剂的应用。
全文摘要
本发明涉及红旱莲总黄酮及其提取方法与应用，属于医药领域。本发明通过原料干燥，粉碎，提取，NKA–9型大孔树脂纯化等步骤对红旱莲总黄酮进行了提取，本方案提取速度快，效率高，得到总黄酮纯度高，回收率高，适合工业化生产。
文档编号A61P39/06GK102805759SQ20121031599
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月31日 优先权日2011年12月2日
发明者张国文, 周佳, 胡明明, 潘军辉 申请人:南昌大学