专利名称：使间充质干细胞分化为神经细胞的方法
技术领域：
本发明涉及通过在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养它们，使骨髓中的间充质干细胞分化为神经细胞的一种方法，以及含有神经细胞作为有效成分用于治疗神经疾病的组合物。
背景技术：
干细胞具有在培养中无限分裂的能力并且在特异性的分化刺激物的刺激下产生构成组织的特化细胞。
根据它们的分化潜能，干细胞分为胚胎干细胞(ES细胞)和组织特异性干细胞。ES细胞是在胚泡期从胚胎内细胞团(ICM)分离而来，并且是多潜能的，即它们实际上能够分化为在生物中发现的全部类型的细胞。
相反，组织特异性干细胞在胚胎发育过程中器官形成的阶段出现，并且它们是器官特异性的和多能的，即它们通常定向产生构成特定器官的细胞。这些组织特异性干细胞在大多数成年人器官中保留并履行不断补充正常或病理性发生的细胞损失的关键任务。代表性的组织特异性干细胞包括在骨髓中存在的造血干细胞和间充质干细胞。造血干细胞产生各种血细胞如红细胞和白细胞；间充质干细胞产生结缔组织细胞，例如成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞。
近来，由于人胚胎干细胞的成功分离，干细胞的临床应用已经吸引越来越多的兴趣。干细胞最值得注意的潜在应用是它们作为用于细胞置换治疗的细胞供应的理想来源。几乎不可治愈的疾病，例如神经变性疾病如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，由骨髓损伤，白血病，中风，幼年发作性糖尿病，心梗塞和肝硬变引起的四肢麻痹，是由于构成器官的细胞的破坏和永久性功能失调所导致，其中从外部补充细胞的损失的细胞置换治疗已经作为一种有效治疗出现。
然而，尽管细胞置换治疗的明显益处，在它的临床应用中存在许多限制。具体地，其中将从供体组织分离的完全分化的细胞移植于患者中的常规方法，有难以获得足够量的提供给患者的细胞的问题。为了解决该问题，在细胞置换治疗中可使用从分离的胚胎干细胞分化而来的特定组织的细胞或从分离的和增殖的组织特异性干细胞分化而来的细胞。
到目前为止，已经证明小鼠胚胎干细胞在培养皿上可以分化为各种细胞如造血细胞，心肌细胞，分泌胰岛素的胰细胞和神经细胞。另外，几个报道已经证明，从干细胞分化的细胞的移植在由细胞损失导致的疾病的治疗中有效。例如，当将从胚胎干细胞分化的合成髓鞘质的少突胶质细胞移植于小鼠中时，小鼠中的髓鞘质的合成增加(Brustle等，Science，285754-756，1999)。通过将从胚胎干细胞分化的分泌胰岛素的细胞移植于糖尿病小鼠模型中调节血糖水平(Soria等，Diabetes，49157-162，2000)。另外，通过将由胚胎干细胞分化的神经细胞移植于有骨髓损伤的小鼠中显著地治疗了由骨髓损伤导致的运动障碍(McDonald等，Nat.Med.，5(12)1410-1412，1999)。
然而，由于只是最近才成功分离出人胚胎干细胞，并且没有关于胚胎干细胞在培养皿上分化为除了神经细胞以外的其它特化细胞的报道，由胚胎干细胞分化的特异性的组织细胞在细胞置换治疗中的临床应用还保持在一个可能性的水平上。
另外，由于从胚胎干细胞分化为靶细胞的效率低，在移植中有由和靶细胞混合的其它细胞导致的有害副作用的风险。因此，为了从胚胎干细胞分化的细胞更安全的临床应用，存在开发一种精确分化方法的需要。
另一方面，在当组织特异性干细胞被用于细胞置换治疗中的情形下，在长期培养中，可能出现细胞增殖能力降低或分化为不利的细胞的问题。另外，为了治疗神经变性疾病如帕金森氏病需要移植神经细胞。因为直接从患者获得神经干细胞是困难的，它们通常通过培养从死胎脑组织分离的神经干细胞并且使它们分化为神经细胞而获得。然而，胎脑的使用引起伦理问题并且被不充足的供应所限制，并且可能导致免疫排斥。另外，大部分的神经干细胞易于分化为星形胶质细胞而不是神经元。
因此，如果可能使在患者自身骨髓中的间充质干细胞分化为在细胞置换治疗中使用的神经细胞，可以很容易地供应神经细胞并且象免疫排斥的问题在治疗中将不会出现。
到目前为止，已认为一种类型的干细胞只分化为属于一个特定系统的组织细胞。据报道在各种生长因子如血小板衍生生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，转化生长因子-β(TGF-β)和表皮生长因子(EGF)的存在下，间充质干细胞体外形成集落(Kuznetsov等，Br.J.Haematol.，97561，1997；和van den Bos C.等，Human Cell，1045，1997)，并且大约三分之一的原始贴壁细胞具有多潜能性，从而分化为结缔组织细胞如成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞(Pittenger MF等，Science，284143，1999)。另外，Ferrari G.等报道骨髓是形成新肌的生肌前体细胞的来源(Science，2791528，1998)。
最近的研究报道间充质干细胞还能分化为神经系统的细胞。例如，Sanchez-Ramos等报道间充质干细胞在视黄酸和脑衍生神经营养因子(BDNF)的存在下经培养分化为神经元和星形胶质细胞(Exp.Neurology，164247-256，2000)。Dale Woodbury等报道在骨髓中的间充质干细胞在抗氧化剂如β-巯基乙醇和二甲基亚砜(DMSO)的存在下分化为神经细胞(J.Neuro.Res.，61364-370，2000)。然而，强分化诱导试剂如DMSO的使用在临床应用中可能导致问题。
本发明者已努力发现高度安全和能够使骨髓中的干细胞分化为神经细胞的物质，并且已发现HGF促进骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，还发现将EGF和bFGF加入培养基中，与HGF一起，不但显著地促进干细胞分化为神经细胞，而且增强产生的神经细胞的扩增。
已报道当将它们加入到用于培养从脑组织分离的神经干细胞的无血清培养基中时，EGF和bFGF刺激神经干细胞分化为神经元或星形胶质细胞(Melissa等，Exp.Neurology，158265-278，1999)。
已报道HGF增强在海马和中脑中的神经元的生存力，并且诱导在新大脑皮质移植(neocortical explant)中轴突的生长(Hamanoue M等，J.Neurosci.Res.，43554-564，1996)。另外，在周围神经系统中，它作为运动神经元的生存因子起作用(Ebens A等，Neuron，171157-1172，1996)，并且参与感觉神经元和副交感神经元的生长和生存(Fleur Davey等，Mol.Cell Neurosci.，1579-87，2000)。
然而，尚未报道通过在含有EGF，bFGF和HGF的培养基中培养它们，能够使间充质干细胞分化为神经细胞。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供一种使骨髓中的间充质干细胞或单核细胞分化为神经细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供通过所述方法分化的神经细胞和一种包括神经细胞作为有效成分的用于治疗神经疾病的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗哺乳动物中神经疾病的方法，其包括将通过上述方法生产的神经细胞施用于需要其的受治疗者。
因此，依照本发明的一个方面，提供一种用于使骨髓中的间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其包括在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养间充质干细胞。


本发明上述和其它的目的和特征从结合下述附图的本发明的下述描述中将变得明显，其中所述附图分别表示图1来源于在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培养基上培养4周的骨髓单核细胞的贴壁细胞的显微照片(×100；以下，使用相同的放大率)；图2从在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培养基上培养8周的骨髓单核细胞分化来的神经细胞的显微照片；图3A和3B分别为神经元和星形胶质细胞显微照片，其是从图2的神经细胞分离而来；图4A到4C图2分化的神经细胞的免疫细胞化学染色结果，其中图4A是NSE-阳性细胞；图4B，NeuN-阳性细胞和图4C，GFAP-阳性细胞
图5A至图5C分别为从间充质干细胞分化的成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞的显微照片；图6在其接种在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培养基上之后即刻拍摄的间充质干细胞的显微照片；图7由在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培养基上培养8周的间充质干细胞分化的神经细胞的显微照片；图8A至8C图7分化的神经细胞的免疫细胞化学染色结果，其中图8A是NSE-阳性细胞；图8B，NeuU-阳性细胞和图8C，GFAP-阳性细胞。
发明详述本发明提供一种使从骨髓分离的间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其包括在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养间充质干细胞。
另外，还提供通过所述方法分化的神经细胞和一种包括神经细胞作为有效成分用于治疗神经疾病的药物组合物。
如在此使用，术语“神经细胞”指包括神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞的类神经细胞(nerve-like cell)。
为了使间充质干细胞分化为神经细胞，优选在细胞培养基中培养间充质干细胞超过一周时间，所述培养基含有1-1,000ng/ml，优选5-10ng/ml的EGF，1-1000ng/ml，优选10-20ng/ml的bFGF和1-1000ng/ml，优选5-20ng/ml的HGF。更优选培养干细胞超过4周时间。在培养开始大约4周后，形成几个细胞组成的神经细胞集落，在大约8周后，通过神经细胞集落的连续生长和增殖产生大量的神经细胞。
相反，如果在相同但缺少HGF的培养基中培养间充质干细胞，细胞不能分化为神经细胞。另外，如果只用HGF处理它们，早期分化发生，因而抑制增殖。该结果暗示在培养间充质干细胞以获得神经细胞的本发明的方法中，EGF和bFGF刺激细胞增殖，HGF刺激干细胞分化为神经细胞。另外，当只使用所述因子的一种时不能获得充足量的神经细胞。
在8-周的培养后一旦神经细胞完全分化和增殖，即使在只用EGF和bFGF处理的时候，它们也可以进一步增殖而不丢失它们作为神经细胞的独特特征。在另一方面，如果只用HGF随后处理完全分化和增殖的神经细胞，细胞继续分化而不增殖，因此，细胞量减少。因此，在培养8周后，优选通过在含有EGF和bFGF的培养基中进一步培养它们以使神经细胞增殖。
依照使用EGF，bFGF和HGF的本方法，大于80％的总分化细胞是神经细胞，基于细胞量，其包含60-80％，优选65-75％的神经元和20-40％，优选25-35％的星形胶质细胞，并且不含有小胶质细胞。
在本发明中，间充质干细胞优选从人骨髓获得。源于骨髓的单核细胞包含造血干细胞和间充质干细胞，当培养它们1-2周时，造血干细胞容易地分化为成熟血细胞。因此，此后增殖的干细胞是间充质干细胞，其在20代的传代培养后继续增殖。间充质干细胞分化为包括成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞的各种结缔组织细胞。
此外，当在本发明方法中使用包含间充质干细胞的骨髓单核细胞代替分离的间充质干细胞时，还可以实现神经细胞的大量生产。
由于神经细胞是通过使用在人体内存在的特异的蛋白质，即EGF，bFGF和HGF，而未使用有害的分化诱导物如DMSO，由间充质干细胞分化而来，本方法特别在安全方面是有利的。另外，因为从患者自身骨髓可以产生对于疾病治疗足够量的神经细胞，由于神经细胞迅速的有效性和降低的免疫排斥风险，它的临床应用将是可行的。
依照本发明从间充质干细胞分化的神经细胞可以作为一种细胞组合物的活性成分使用，该组合物用于神经疾病的细胞置换治疗。可以通过使用本发明的神经细胞治疗的神经疾病的非限制性实施例包括神经变性疾病如帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，皮克病，亨廷顿舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化和局部缺血性脑病。本发明的神经细胞还可以用于由神经细胞的异常损失导致的各种疾病以及由脊髓损伤导致的运动障碍的治疗。
通过将用本发明方法分化的神经细胞和药用赋形剂或载体混和，或通过按照任何常规程序使用药用稀释剂将其稀释，可以制备用于预防或治疗神经疾病的细胞组合物。合适载体，赋形剂和稀释剂的实例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯类，羟基苯甲酸丙酯类，滑石，硬脂酸镁和矿物油。制剂可另外包括填料，抗凝集剂，润滑剂，湿润剂，香料，乳化剂，防腐剂等。可通过使用本领域熟知的任何程序来配制本发明的药物组合物，以便在将它们对哺乳动物给药后，提供活性成分的迅速，持续或延迟的释放。因此，制剂可以是无菌的注射液，混悬液，乳剂，溶液等形式，其中无菌注射液是优选的。
因此，本发明还提供一种在哺乳动物中治疗神经疾病的方法，其包括以治疗疾病有效的量对需要其的受试者给药用本发明方法生产的神经细胞。
通过任何常规方法可以将通过本发明方法生产的神经细胞注射于患者内。例如，可使用Douglas Kondziolka的方法(D.Kondziolka等，Neurology55556-569，2000)。具体地，将患者的颅骨切除以产生一个具有大约1cm直径的孔，将含有神经细胞的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)注射于大约3个位点。注射是通过用于将所需的细胞溶液在正确位置注射于脑的深层部分的具有长针头和立体定位支架的注射器进行的。可以通过包括透皮，皮下，静脉内和肌内输入，外科定向输入，通过血管导管插入术的损害内的输入的各种途径给药本发明的细胞组合物。
神经细胞的典型单位剂量可从1×106细胞至1×109细胞变化，并且可每周或每月给药。然而，应该理解实际给药的活性成分的量应该根据各种相关因素确定，所述因素包括待治疗的疾病，患者症状的严重程度，选择的给药途径，个体患者的年龄，性别和体重；因此，上述剂量不应该是想以任何方式限制本发明的范围。
下列实施例是打算进一步举例说明本发明而不限制其范围。
另外，下面给出的对于固体在固体混合物中，液体在液体中和固体在液体中的百分比是分别基于重量/重量(wt/wt)，体积/体积(vol/vol)和重量/体积(wt/vol)，并且除非特别另外说明，所有的反应在室温下进行。
实施例1分离骨髓中的单核细胞从每个健康志愿者的骨盆取大约10ml的骨髓，并保存在含肝素的玻璃管中。将30ml磷酸缓冲盐水(PBS)加至10ml骨髓中，将20ml得到的混合物缓慢转移至10ml Ficoll-PaqueTM plus溶液(1.077g/ml，Amersham Pharmacia Biotech)之上，并在2000rpm进行密度梯度离心20分钟。回收位于顶层和Ficoll-PaqueTM plus层之间界面的单核细胞层，并在1800rpm进行离心5分钟以获得单核细胞。
实施例2单核细胞的培养将实施例1中获得的单核细胞以1×106细胞/cm2的密度接种于含有基本培养基的培养瓶中。在37℃，5％的CO2下孵育培养瓶。在4小时后，用新鲜基本培养基洗涤培养瓶以去除未贴壁细胞。基本培养基为含有3.5μM氢化可的松(Sigma)，以相等的摩尔比与无脂肪酸的牛血清白蛋白(Gibco BRL)混合的50ng/ml的亚油酸(Sigma公司)，0.1μM CuSO4·5H2O(Sigma)，50pM ZnSO4·7H2O(Sigma公司)，3ng/ml H2SeO3(Sigma)，1.05mg/ml NaHCO3(Sigma公司)，1.19mg/ml HEPES(Sigma)，100U/ml青霉素(Gibco BRL)，10mg/ml链霉素(Gibco BRL)和25mg/ml两性霉素(Gibco BRL)的Williams’E培养基(Gibco BRL)。
实施例3单核细胞分化为神经细胞为了证实实施例2获得的单核细胞是否能分化为神经细胞，在37℃，5％的CO2下在基本培养基中培养单核细胞，所述培养基含有10ng/ml表皮生长因子(Gibco BRL)，20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(R&D系统)和20ng/ml肝细胞生长因子(R&D系统)(“分化培养基”)。一周两次补充分化培养基。
大约4周后，神经细胞集落出现并不断增殖(参见表1和图1)。
大约8周后，观察到由长突出物如轴突和短突出物如树突组成的神经元状细胞和只包括短树突的星形胶质细胞状的细胞(参见图2和3)。另外，在8周后，即使在只含有EGF和bFGF的基本培养基上培养，细胞增殖而它们的形状不变(参见表2)。
然而，当在只含有EGF和bFGF的培养基中培养间充质干细胞时，细胞不分化为神经细胞。另外，当在只含有HGF的培养基中培养间充质干细胞时，细胞早期分化，因此它们既不生长也不增殖(参见表1)。
表1.间充质干细胞培养8周后细胞数/ml培养物

表2.通过在含有EGF，bFGF和HGF的培养基上培养8周从间充质干细胞分化的神经细胞培养4或8周后细胞的增殖(接种细胞数1×105)

实施例4免疫细胞化学使实施例3中获得的神经细胞以1×104细胞/cm2的密度附着在1cm2的盖玻片上，所述神经细胞是通过在含有EGF，bFGF和HGF的培养基上培养8周从骨髓的单核细胞分化而来。用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤细胞5分钟，用含有4％低聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液固定15分钟，并用0.1M磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次。用含1％BSA和2％Triton X-100的0.1M PBS处理细胞5分钟，然后使其与第一抗体小鼠抗人神经元特异性的烯醇化酶(NSE)(Chemico公司)，小鼠抗人神经元特异性的核蛋白(NeuN)(Chemicon公司)，小鼠抗人β-微管蛋白III(Sigma公司)和小鼠抗人胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)(Sigma公司)反应16小时。
在与第一抗体的反应完成后，除去残余抗体并用含有0.5％BSA的0.1M PBS洗涤细胞两次，每次15分钟。另外加入第二抗体，兔抗鼠IgG(Sigma公司)并孵育30分钟。用含0.5％BSA的0.1 M PBS洗涤细胞，一次5分钟。通过使用含有抗生物素蛋白-生物素的Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratory公司)进行反应30分钟。用0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，每次5分钟，另外加入DAB(脱水3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐，Sigma公司)作为显色底物，使混合物反应5分钟。通过用0.1M磷酸盐缓冲液处理反应物5分钟并用该缓冲液洗涤它们两次，每次5分钟来终止反应。将得到的反应物干燥，并用蒸馏水洗涤5分钟。通过依次使用蒸馏水，70％，80％，95％和100％的乙醇处理将细胞脱水和固定。
上述免疫细胞化学染色的结果在图4A至4C中显示，其中，对于神经元标记NeuN，NSE和β-微管蛋白III，以及星形胶质细胞标记GFAP，分化的细胞显示阳性结果。这些结果显示细胞分化为神经元和星形胶质细胞，其是通过它们的生物化学以及形态特征来判断。然而，对于小胶质细胞标记OX-42细胞显示阴性，证明单核细胞不分化为小胶质细胞。
检验神经元(对NeuN和NSE为阳性)和星形胶质细胞(对GFAP为阳性)在细胞中的比例并在在表3中显示，所述细胞是通过在含有EGF+bFGF+HGF或EGF+bFGF的培养基中培养8周从骨髓的单核细胞分化而来。
表3

从表3可见，当在含有EGF+bFGF+HGF的培养基上培养8周时约80％的总分化细胞是神经细胞。神经细胞由约70％的神经元和约30％的星形胶质细胞组成。
实施例5间充质干细胞的分离和培养为了了解在骨髓的单核细胞中的间充质干细胞是否将分化为神经细胞，培养单核细胞并从中分离间充质干细胞。如下检验间充质干细胞分化为各种细胞的能力。
将如在实施例2中培养的单核细胞以1×103细胞/cm2的密度接种于含有用10％FBS(胎牛血清)补充的DMEM(Gibco BRL)的培养瓶中。
将细胞在5％CO2的气氛下37℃培养。在1～2周后，将增殖的细胞进行传代培养，在20代传代培养后增殖继续。
由骨髓获得的单核细胞包括成熟白细胞，淋巴细胞，成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，成纤维细胞，脂肪细胞以及将分化为这些细胞的干细胞，所述干细胞分为造血和间充质干细胞。产生血细胞如红细胞，白细胞和淋巴细胞的造血干细胞不能增殖，但在普通的培养基中容易分化为成熟血细胞。因此，可以看到如上继续增殖的细胞是间充质干细胞。
为了证实增殖的细胞的确是间充质干细胞，用各种细胞因子和化学试剂处理细胞，并依照Pittenger等，Science，284143-147，1999的方法检验它们分化为包括成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞的各种结缔组织细胞。
为了使干细胞分化为成骨细胞，使用100mM地塞米松和10mM β-甘油磷酸(β-glycerol phosphate)和50nM抗坏血酸-2-磷酸酯和10％FBS处理细胞。
另外，为了证实干细胞分化为成软骨细胞的能力，将培养的干细胞离心以获得细胞沉淀，用不含血清的100nM地塞米松和10ng/ml TGF-β3处理。
通过用0.5mM 1-甲基3-异丁基黄嘌呤，1mM地塞米松，10g/ml胰岛素，100nM吲哚美辛(indomethacine)和10％FBS处理干细胞诱导干细胞分化为脂肪细胞。
通过碱性磷酸酶染色(Jaiswal等，J.Cell Biochem.，64(2)295-312，1997)检验成骨细胞；通过II型胶原的RT-PCR(Mackay等，Tissue Eng.，4(4)415-428，1998)和用甲苯胺蓝染色检验成软骨细胞；通过用油红O染色检验脂肪细胞。
结果，从图5A，5B和5C可见，在光学显微镜下在所有样品中观察到阳性结果。这些结果证明体外培养和增殖的间充质干细胞还保持能够分化为各种结缔组织细胞如成骨细胞，成软骨细胞和脂肪细胞的干细胞性能。
实施例6间充质干细胞分化为神经细胞为了检验实施例5中分离的间充质干细胞是否能分化为神经细胞，在用EGF，bFGF和HGF补充的培养基中，按照实施例3的方法培养间充质干细胞。
结果，与源于骨髓的单核细胞的神经细胞分化类似，在4周后形成神经细胞集落，并且神经细胞继续生长和增殖直至第8周。图6和图7举例说明了分别在接种后和在8周培养后即刻拍摄的细胞的显微照片。
在第8周后，即使只用EGF和bFGF处理，细胞继续增殖而保持神经细胞的形态特征。
同样，按照实施例4的方法，对分化细胞进行免疫细胞化学染色。
结果，与源于骨髓的单核细胞的神经细胞获得的结果类似，对于神经元标记(neural marker)NeuN，NSE和β-微管蛋白III以及星形胶质细胞标记GFAP，分化细胞显示阳性结果。因此，证实了间充质干细胞不仅分化为神经元而且分化为星形胶质细胞(参见图8A至8C)。图8A至图8C显示免疫细胞化学染色的结果，图8A代表NSE-阳性细胞；图8B，NeuN-阳性细胞；和图8C，GFAP-阳性细胞。
虽然关于上述具体的实施方案已经描述了本发明，但应承认那些本领域的技术人员可以对本发明进行各种修改和改变，这些修改和改变也属于如后附的权利要求所限定的本发明的范围内。
权利要求
1.一种使间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其包括在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养所述间充质干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞在含有1-1000ng/mlEGF，1-1000ng/ml bFGF和1-1000ng/ml HGF的培养基中培养超过一周的时间。
3.权利要求2的方法，其中所述培养进行超过4周的时间。
4.权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞在含有EGF，bFGF和HGF的培养基中培养超过一周时间，并且使产生的分化神经细胞在含有EGF和bFGF的培养基中增殖。
5.权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞从人的骨髓分离。
6.权利要求1的方法，其中将从骨髓分离的并且包含间充质干细胞的单核细胞用作间充质干细胞的一种来源。
7.权利要求1的方法，其中所述神经细胞包含神经元和星形胶质细胞。
8.通过权利要求1至7任何一项的方法生产的一组神经细胞。
9.权利要求8所述的神经细胞组，其基于细胞数，含有60-80％神经元和20-40％星形胶质细胞。
10.一种治疗神经疾病的细胞组合物，其包含权利要求8的神经细胞。
11.权利要求10的细胞组合物，其中所述神经疾病是一种神经变性疾病或由于脊髓损伤导致的运动障碍。
12.权利要求11的细胞组合物，其中所述神经变性疾病选自帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，皮克病，亨廷顿舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化和局部缺血性脑病。
13.一种用于在哺乳动物中治疗神经疾病的方法，其包括以治疗所述疾病有效的量对需要其的受试者给药通过权利要求1的方法生产的神经细胞。
全文摘要
一种使骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法，其包括在含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养间充质干细胞，并且由此生产的神经细胞可用于神经疾病的治疗。
文档编号A61P25/16GK1549856SQ02808391
公开日2004年11月24日 申请日期2002年4月19日 优先权日2001年4月19日
发明者金炫寿, 尹熙勋 申请人:金炫寿