专利名称：一种可诱导免疫应答的具有lamp导向的bap31疫苗载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于DNA疫苗技术领域，涉及一种可诱导免疫应答的具有LAMP导向的 BAP31疫苗载体及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。在第18届国际抗癌症联盟大会上，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。为应对上述严峻形势，报告呼吁各国制订反癌症的全国计划和具体实施方案，并特别强调对癌症预防、早期检查和早期治疗的重要意义。一直以来，特异性免疫治疗是众多研究人员力图清除肿瘤微小残留病的有效方法。DNA疫苗能在真核细胞中获得持久的表达，抗原和MHC-I类分子结合后被呈递到细胞表面，被⑶8+T细胞的受体识别而产生⑶8+细胞毒性T淋巴细胞反应。BAP31即B细胞受体相关蛋白31，最初由Kim等人于1994年鉴定，由于其选择性地与膜型IgD结合，故认为它是B细胞受体相关蛋白家族的一个成员，命名为BAP31。成熟的BAP31分子量为^kDa,共有246个氨基酸残基，在进化中高度保守，人和小鼠在核酸水平和氨基酸水平上分别有91%和95%的同源性。应用免疫组织化学染色的方法，Manley等人系统研究了 BAP31在人体多种正常组织中的表达分布情况。研究结果显示，BAP31在胸腺、小脑、腺垂体、甲状腺、肾脏和卵巢组织中均有表达，但均局限于少数细胞，在骨骼肌中未见表达。胸腺组织中BAP31在淋巴细胞和基质细胞中均有表达；小脑中主要表达于蒲肯野细胞的树突上，轴突和胞核为阴性；腺垂体中的内分泌细胞高表达BAP31 ；卵巢组织中颗粒细胞和卵泡膜细胞中可见BAP31的表达，间质细胞为阴性；BAP31在甲状腺组织中主要表达于滤泡的立方上皮细胞；肾脏组织中近曲小管的立方上皮细胞中有BAP31分子的表达；而在肾上腺组织中，BAP31主要表达于皮层细胞。研究结果还显示，BAP31在正常宫颈组织的立方上皮细胞、卵巢组织的颗粒细胞、 结肠组织和直肠组织的腺上皮细胞上有微弱表达；而在乳腺组织、食道组织、肝脏组织、肺组织中未见表达。BAP31在宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、结肠癌、直肠癌和肺癌组织均见高水平表达，阳性率在58. 0% 87. 5%之间，阳性产物主要定位于胞浆。因此， BAP31是一个肿瘤相关抗原，可做为DNA疫苗研究的理想靶点。溶酶体是酸性的、富含多种蛋白水解酶的带膜亚细胞器，也是外源性抗原加工途径MHCII类分子器室(MIIC)的重要组成部分。外源性抗原就是在MIIC中被蛋白酶水解成合适大小的肽段，然后在内质网正确折叠组装、并与MIIC的MHCII类分子结合，所形成的 MHCII/抗原肽复合物，最后表达在细胞膜上，并进一步被CD4+T细胞的抗原识别受体(TCR)所识别，诱导特异性免疫应答。研究发现，溶酶体膜蛋白成分介导着非常重要的功能，包括溶酶体内腔的酸化，氨基酸、脂肪酸及碳水化合物的转运等。溶酶体相关膜蛋白(LAMP)是溶酶体膜上主要的蛋白成分，包括LAMP-I (⑶107a) 和LAMP-2(⑶107b)，属I型穿膜蛋白N端溶酶体内腔部分(lumen)、疏水穿膜部分 (transmembrane)及C末端短胞浆尾(cytoplasmic! tail)，并且该保守的C末端短胞浆尾， 在LAMP分子生物合成后被靶向到溶酶体过程中起着非常重要的作用。LAMP分子胞浆尾具有靶向作用，可通过其穿膜-胞浆区定向地结合亚细胞结构-内吞体/溶酶体，并翻转进入其中。将编码目的抗原的基因插入LAMP分子编码溶酶体内腔部分和胞浆尾基因之间构成嵌合体，由于LAMP分子的导向作用，可将LAMP融合蛋白中的目的抗原直接携带进入MIIC， 从而可实现DNA疫苗所表达蛋白从内源性抗原的MHC-I类加工途径向外源性抗原的MHC-II 类加工途径的转化。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体及其应用，该疫苗载体能够高效诱导特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，可作为抗肿瘤的DNA疫苗应用。本发明是通过以下技术方案来实现一种可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体，是将如SEQ. ID. NO. 1 SEQ. ID. NO. 3其中之一所示的核苷酸序列连接在LAMP插入到lumen结构域和 transmembrane/cytoplasmic! tail所述的疫苗载体是P43-LAMP-hBAP31，是将SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列通过 XhoI I和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。所述的疫苗载体是P43-LAMP-hABAP31，是将SEQ. ID. N0. 2所示的核苷酸序列通过Β ο I和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。所述的疫苗载体是P43-LAMP-mABAP31，是将SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列通过Β ο I和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。所述的可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体应用于抗肿瘤DNA疫苗的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明将肿瘤相关基因BAP31或优势表位所对应的截短基因ΔΒΑΡ31插入到LAMP 序列的lumen结构域和transmembrane/cytoplasmid tail之间(内腔和穿膜/胞浆尾之间)，构建包含BAP31的重组疫苗载体，在载体被表达之后形成融合蛋白，位于LAMP分子 lumen结构域下游的BAP31被导向到溶酶体当中，进行MHCII/抗原肽复合物的加工、装配， 实现DNA疫苗内源性抗原MHCI加工/递呈向MHCII加工/递呈的转化。进而通过将重组疫苗载体免疫小鼠，能够高效诱导抗肿瘤特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，能够特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16黑素瘤细胞，且在小鼠体内具有很强的抑制肿瘤细胞生长的能力，显示出作为抗肿瘤DNA疫苗进行抗肿瘤应用的广阔前景。本发明构建的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体所诱导特异性体液免疫应答，产生针对肿瘤相关抗原BAP31特异性的抗体，其抗体效价可达1 1，000，000;所诱导特异性细胞免疫应答包括增强细胞因子(包括IFN-Y和IL-4)的分泌，提高免疫脾细胞的细胞毒活性，能够特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16黑素瘤细胞；在对小鼠恶性黑色素瘤模型免疫之后，与对照相比，能够显著的降低其肿瘤体的体积，具有明显的抗肿瘤效果，显示出作为抗肿瘤DNA疫苗进行抗肿瘤应用。本发明构建的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体具体将人BAP31全长基因、人BAP31截短基因和小鼠BAP31截短基因构建成P43_LAMP_hBAP31疫苗载体、 P43-LAMP-hABAP31疫苗载体、P43-LAMP_mΔBAP31疫苗载体。所述载体在表达之后，位于 LAMP分子lumen结构域下游的BAP31/ Δ ΒΑΡ31均可被LAMP导向到MIIC，而且在免疫之后均能引起特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。


图1为LAMP导向的BAP31疫苗载体的双酶切鉴定结果图。图2为对照疫苗载体的双酶切鉴定结果图。图3为间接ELISA检测Π1ΔΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后血清中mΔ BAP31特异性抗体的效价的结果图。图4为间接ELISA检测hABAP31DNA疫苗免疫后血清中h Δ BAP31特异性抗体的效价的结果图。图5为间接ELISA检测hBAP31 DNA疫苗免疫后血清中hBAP31特异性抗体的效价的结果图。图6为ELISP0T检测mΔBAP31 DNA疫苗免疫后脾细胞的m Δ BAP31抗原特异性细胞因子分泌的结果图。图7为ELISP0T检测h Δ ΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后脾细胞的h Δ ΒΑΡ31抗原特异性细胞因子分泌的结果图。图8为ELISP0T检测hBAP31 DNA疫苗免疫后脾细胞的hBAP31抗原特异性细胞因子分泌的结果图。图9为Π1ΔΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后免疫脾细胞特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16 黑素瘤细胞的效/靶比的曲线图。图10为hABAP31 DNA疫苗免疫后免疫脾细胞特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16 黑素瘤细胞的效/靶比的曲线图。图11为hBAP31 DNA疫苗免疫后免疫脾细胞特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16黑素瘤细胞的效/靶比的曲线图。图12为mABAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的肿瘤重量对比图。图13为hABAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的肿瘤重量对比图。图14为hBAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的肿瘤重量对比图。
具体实施例方式本发明将肿瘤相关基因BAP31或优势表位所对应的截短基因ΔΒΑΡ31插入到LAMP 序列之后，构建包含BAP31的重组疫苗载体，该载体被表达后显示出特异性的免疫诱导效果，具有抗肿瘤的特性。下面结合BAP31的重组疫苗载体的构建、DNA疫苗的免疫及其免疫效果和抗肿瘤效果的检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下详细介绍克隆人BAP31或ΔΒΑΡ31(截短基因)疫苗载体的构建过程1、人ΒΑΡ31全长及截短基因的克隆消化收集5 X IO6个Hela细胞，加入Iml Trizol溶液，室温孵育5min，以提取总 RNA0然后加入0. 2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育3min ；4°C, < 12000Xg，离心15s，将上层水样层取出，加入0. 5ml异丙醇，混勻，室温孵育lOmin。4°C，12000 X g，离心15s，弃上清。75%乙醇洗涤沉淀，4°C，7500 Xg离心15s，弃尽上清，开盖置室温5 IOmin JnDEPC 水溶解，取少量样品稀释后，紫外分光光度计测定RNA浓度。以总RNA为模板，Oligo dT为引物，AMV逆转录酶逆转录合成cDNA。其中，上游引物为atgagtctgc agtggactg ；下游弓丨物为:ttactcttcc ttcttgtcca t ；PCR扩增人BAP31基因全长74Ibp，收集并纯化PCR扩增产物之后AT克隆入 PMD-18T载体中并测序，将克隆入的BAP31基因测序结果与NCBI数据库收录的人BAP31序列比对，序列一致。以测序正确的包含人BAP31全长基因的pMD-18T-BAP31为模板，设计扩增引物，扩增人BAP31基因463-741bp (其对应的氨基酸为15fea_M6aa)的截短基因h Δ BAP31，所设计的引物为上游弓 I物为:gaccagctca agaagggagc ；下游弓丨物为:ttactcttcc ttcttgtcca t ；PCR扩增长度为279bp的人BAP31基因的截短基因h Δ BAP31，收集并纯化PCR扩增产物之后AT克隆入pMD-18T载体中并测序，测序结果与NCBI数据库收录的人ΒΑΡ31序列比对，对应的序列一致。2、小鼠ΒΑΡ31截短基因(ι ΔΒΑΡ31)的克隆消化收集5 X IO6个小鼠黑色素瘤Β16细胞，Trizo法提取总RNA，以总RNA 为模板，Oligo dT为引物，AMV逆转录酶逆转录合成cDNA，克隆小鼠BAP31基因 463-738bp(155aa-245aa)的截短基因ι ΔΒΑΡ31，所设计的引物为上游弓 I物为:gatcagctaa agaagggagc ；下游弓丨物为ttactcctcc ttcttgactg ；PCR扩增长度为276bp的小鼠BAP31截短基因πιΔΒΑΡ31，收集并纯化PCR扩增产物之后AT克隆入pMD-18T载体中并测序，测序结果与NCBI数据库收录的小鼠ΒΑΡ31序列比对，对应的序列一致。3、疫苗载体的构建3. ILAMP导向的ΒΑΡ31疫苗载体的构建以测序正确的PMD-18T载体为模板，设计特异性引物，在ΒΑΡ31基因(包括人全长 hBAP31基因、人463-741bp截短hABAP31基因、小鼠463_738bp截短ι ΔΒΑΡ31基因)上下游分别加入》ιο I和EcoR I限制性内切酶位点(下划线所标注)，所设计的引物为人全长hBAP31基因上游弓丨物为:ttctcRaRat gagtctgcag tggactg ；
下游弓I物为:ttgaattctt actcttcctt cttgtccat ；人463-74Ibp 截短 h Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物为:ttctcgagga ccagctcaag aagggagc ；下游弓I物为:ttgaattctt actcttcctt cttgtccat ；小鼠463_738bp 截短 m Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物为:ttctcgagga tcagctaaag aagggagc ；下游弓I物为:ttgaattctt actcctcctt cttgactg ；PCR扩增相应片段，经Β ο I和EcoR I双酶切后克隆入P43-LAMP载体中，构建重组BAP31疫苗载体。P43-LAMP载体中LAMP元件为表达Lamp分子的全长基因，而BAP31基因通过LAMP 序列的 lumen 结构域禾口 transmembrane/cytoplasmid tail 之间的 Xho I 禾口 EcoR I 多克隆位点插入，在载体表达之后形成融合蛋白，这样目标基因BAP31所表达的蛋白就可被LAMP 导向至MIIC，以加强其抗原递呈；P43-LAMP载体具体由美国霍普金斯大学August教授惠赠。对构建的重组载体用Bio I和EcoR I双酶切后，10g/L琼脂糖电泳鉴定，鉴定结果如图ι所示，其中，泳道1为Marker、泳道2为P43_LAMP/hBAP31载体酶切结果、泳道3为 P43-LAMP/hABAP31载体酶切结果、泳道4为P43_LAMP/mΔBAP31载体酶切结果，可以看到泳道2、3、4中均出现了目标条带，说明ΒΑΡ31或ΔΒΑΡ31插入到正确的位置；而且将测序结果与NCBI数据库收录的相应序列比对，所对应的序列一致。将插入SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2、SEQ. ID. NO. 3 所示的 hBAP31、 h Δ BAP31、m Δ ΒΑΡ31基因所构建的疫苗载体分别命名为P43_LAMP_hBAP31疫苗载体、 P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31 疫苗载体、P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31 疫苗载体。3. 2不含LAMP的对照疫苗载体的构建以测序正确的PMD-18T载体为模板，设计特异性引物，在BAP31基因(包括人全长 hBAP31基因、人463-741bp截短hABAP31基因、小鼠463_738bp截短ι ΔΒΑΡ31基因)上下游分别加入Nhe I和Kpn I限制性内切酶位点(下划线标注)，所设计的引物为人全长hBAP31基因上游弓丨物为:ttRctaRcat gagtctgcag tggactg ；下游弓I物为:ttRRtacctt actcttcctt cttgtccat ；人463_741bp 截短 hABAP31 基因上游弓 I物为:ttgctagcga ccagctcaag aagggagc ；下游弓I物为:ttRRtacctt actcttcctt cttgtccat ；小鼠463_738bp 截短 m Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物为:ttgctagcga tcagctaaag aagggagc ；下游弓I物为:ttRRtacctt actcctcctt cttgactg ；PCR扩增相应片段，经Nhe I和Kpn I双酶切后克隆入P43载体中，构建不含LAMP 的对照疫苗载体。将构建的对照疫苗载体用Nhe I和Kpn I双酶切后，10g/L琼脂糖电泳鉴定插入片段，检测结果如图2所示，其中，泳道1为Marker、泳道2为P43_hBAP31载体酶切结果、泳道3为P43-h Δ ΒΑΡ31载体酶切结果、泳道4为P43_m Δ ΒΑΡ31载体酶切结果，可以看到泳道 2、3、4中均出现了目标条带，说明ΒΑΡ31或ΔΒΑΡ31插入到正确的位置；而且将测序结果与 NCBI数据库收录的相应序列比对，所对应的序列一致。以上所构建的P43-LAMP-hBAP31疫苗载体、P43_LAMP_h Δ ΒΑΡ31疫苗载体、 P43-LAMP-mABAP31疫苗载体作为疫苗载体进行免疫后，均可在小鼠体内诱导特异性免疫应答并对小鼠黑色素瘤有显著治疗效果。以下以P43-LAMP-mABAP31疫苗载体为例详细介绍该疫苗在小鼠体内诱导特异性免疫应答的能力，并分别给出3种疫苗载体对小鼠黑色素瘤的治疗效果。4、LAMP分子导向的小鼠Δ ΒΑΡ31疫苗载体能够诱导小鼠Δ ΒΑΡ31特异性体液免疫应答和细胞免疫应答4. 1免疫方案将小鼠分为实验组(P43-LAMP_mABAP31)禾Π对照组 (P43-m Δ ΒΑΡ31、PBS)，DNA 疫苗载体(P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31、P43_m Δ ΒΑΡ31)以 50 μ g/ 只的剂量尾根部皮下免疫8周龄雌性C57BL/6小鼠，每次间隔4周，共免疫3次。初次免疫前采集正常小鼠血清，第3次免疫后1周经尾静脉取血，分离免疫血清，-20°C保存。4. 2.免疫小鼠血清中m Δ ΒΑΡ31特异性抗体的检测采用间接ELISA法检测ΒΑΡ31特异性抗体效价，具体操作为将重组表达的Π1ΔΒΑΡ31蛋白包被ELISA板，4°C过夜。次日洗板并加入系列稀释 (1 100、1 200、1 500、1 1, OOOU 10，000、1 100，000、1 1,000,000)的质粒DNA免疫过的小鼠免疫血清(一抗)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠IgG (二抗)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih后洗板，ABTS显色10 30min。然后将 ELISA板置于酶标仪测定波长410nm处各孔OD值，阳性孔的最大稀释度即为免疫小鼠血清中的抗体效价。特异性抗体效价的检测结果如图3所示，在第3次免疫后，P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31组、 Ρ43-πιΔΒΑΡ31组的免疫血清当中包含特异性针对ΔΒΑΡ31蛋白的抗体，其抗体效价高低为 P43-LAMP-mABAP31 组> Ρ43_πιΔΒΑΡ31 组> PBS 组，而 P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31 组抗体效价可达 1 1，000，000。用相同的免疫方案和抗体检测方法，疫苗载体P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的特异性抗体效价的检测结果如图4、图5所示，均能检测出相应的抗体，而且高于相应的对照组。4. 3ELISP0T法检测细胞免疫应答在第三次免疫后2周分别取各组免疫小鼠2只，分离脾细胞进行ELISP0T检测用IFN- γ或IL-4捕获抗体以5 μ g/mL包被96孔PVDF滤膜板，4°C过夜。次日用不含血清RPMI 1640洗涤2遍，然后用10% FCS的RPMI1640封闭，200 μ L/孔，室温浊；分离小鼠脾细胞后，调整细胞浓度为1. 0 X IO7个/mL，100 μ L/孔，加入板内；加入重组表达的小鼠ΔΒΑΡ31蛋白(1 μ g/mL)，100 μ L/孔，三个复孔，同时设ConA(终浓度为5mg/L)阳性对照和完全培养基阴性对照，37°C、5% CO2孵育Mh。洗板，拍干后，每孔加入1 μ g/mL生物素化IFN- γ或IL-4检测抗体100 μ L，室温孵育池；洗板拍干后，加入HRP-链霉亲和素 100 μ L/孔，室温孵育Ih ；加入AEC (BD公司)底物显色，室温避光静置15 45min，待斑点形成后，自来水冲洗，终止显色过程，晾干，ELISP0T自动读板仪计数。
检测结果如图6所示，在DNA质粒免疫之后，免疫脾细胞分泌IFN- γ和IL_4的水平为P43-LAMP-mABAP31 组> Ρ43_πιΔΒΑΡ31 组> PBS 组。P43-LAMP_mΔ ΒΑΡ31 组脾细胞分泌IFN- γ和IL-4的频率分别为323/1 X IO6个细胞和119/1 X IO6个细胞，远高于对照组 (P < 0. 01)，且P43-LAMP-mABAP31组远高于Ρ43_πιΔΒΑΡ31组；这表明所构建的DNA疫苗载体所表达的LAMP分子，能够增强抗原特异性细胞因子的分泌。用相同的免疫方案和ELISP0T检测，疫苗载体P43-LAMP_hABAP31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的检测结果分别如图7、图8所示，表现出相近的效果，均能够增强抗原特异性细胞因子的分泌。4. 4、乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行细胞毒活性检测采用Cyt0I10x 96试剂盒对DNA疫苗载体免疫后的C57BL/6小鼠T细胞的CTL功能进行检测无菌条件下分离免疫后C57BL/6小鼠的脾细胞作为效应细胞，计数后用含10% FCS的RPMI 1640调整细胞浓度为1. OX IO7AiL备用。将高水平表达BAP31分子的小鼠黑素瘤细胞B16作为靶细胞，调整靶细胞浓度lX106/mL。设置效应细胞(免疫鼠脾细胞)和靶细胞(小鼠黑素瘤细胞B16细胞)的比例分别为50 1、25 1、和12.5 1，每个效靶比设置3复孔，同时设置效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、培养液背景对照和体积校正对照，37°C ,5% CO2孵箱培养4h。加入SubstrateMix显色系统， 检测LDH的释放，490nm波长测定吸光度(A)值。杀伤率(％ )=(试验孔A值-效应细胞自发释放孔A值-靶细胞自发释放孔A值)/ (靶细胞最大释放孔A值-靶细胞自发释放孔 A 值)X100%。细胞毒活性检测结果如图9所示，在效靶比为50 1时，P43-LAMP_mABAP31组可诱导良好的CTL杀伤活性，64%的B16细胞被杀伤，而P43-m Δ ΒΑΡ31组杀伤率仅为40% ； 这表明经过LAMP分子导向之后，目标蛋白能够被有效的递呈，在小鼠被免疫之后，脾细胞中特异性CTL的细胞毒活性显著提高，能够特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16黑素瘤细胞。用相同的免疫方案和细胞毒活性检测方法，疫苗载体P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的CTL功能检测结果分别如图10、图11所示，表现出相近的效果， 在被免疫之后，脾细胞的细胞毒活性显著提高，能够特异性杀伤高表达BAP31的B16黑素瘤细胞。4. 5、重组BAP31疫苗载体作为DNA疫苗的体内抗肿瘤效果以小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16接种C57BL/6小鼠背部皮下，接种肿瘤细胞系后1天，将p43-LAMP-mABAP31载体和对照载体(p43_mΔ BAP31)分别免疫(以50 μ g/ 只的剂量行尾根部皮下免疫)，并设立PBS对照组，每间隔1周加强免疫1次，共免疫5 次。末次免疫后两周，取出小鼠体内的肿瘤称重，具体结果如图12所示，可以明显看出免疫P43-LAMP-m Δ ΒΑΡ31和P43_m Δ ΒΑΡ31载体的实验组肿瘤重量分别为2. 02 士 0. 23g和 3. 98士0. 37g，均比对照组(15. 62士2. 61g)低，而P43-LAMP_mΔBAP31组效果更显著，这表明重组ΒΑΡ31疫苗载体可以作为抗肿瘤的DNA疫苗。用相同的免疫方案和肿瘤重量检测方法，疫苗载体P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的肿瘤重量检测结果分别如图13、图14所示，表现出相近的效果， 这表明P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31、P43_LAMP_hBAP31疫苗载体均可以作为抗肿瘤的DNA疫苗。
权利要求
1.一种可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体，其特征在于，是将如SEQ. ID. NO. 1 SEQ. ID. NO. 3其中之一所示的核苷酸序列插入到LAMP序列的lumen结构域和 transmembrane/cytoplasmic! tail
2.如权利要求1所述的可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体，其特征在于，所述的疫苗载体是P43-LAMP-hBAP31，是将SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列通过Β ο I 和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。
3.如权利要求1所述的可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体，其特征在于，所述的疫苗载体是P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31，是将SEQ. ID. NO. 2所示的核苷酸序列通过)(ho I和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。
4.如权利要求1所述的可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体，其特征在于，所述的疫苗载体是P43-LAMP-mABAP31，是将SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列通过)(ho I和EcoR I酶切位点插入到P43-LAMP载体当中。
5.权利要求1所述的可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体应用于抗肿瘤DNA疫苗的制备。
全文摘要
本发明公开了一种可诱导免疫应答的具有LAMP导向的BAP31疫苗载体及其应用，将肿瘤相关基因BAP31或优势表位所对应的截短基因ΔBAP31插入到LAMP序列的lumen结构域和transmembrane/cytoplasmid tail之间，构建包含BAP31的重组疫苗载体。在载体被表达之后形成融合蛋白，可使位于LAMP分子内腔和穿膜/胞浆尾之间的BAP31被导向到溶酶体当中，进行MHCII/抗原肽复合物的加工、装配，进而通过将重组疫苗载体免疫小鼠，能够高效诱导抗肿瘤特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，能够特异性杀伤高表达BAP31小鼠B16黑素瘤细胞。
文档编号A61K39/00GK102210875SQ201110147000
公开日2011年10月12日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者孙元杰, 宋朝君, 李海涛, 杨琨, 金伯泉, 魏玉英 申请人:中国人民解放军第四军医大学