专利名称：一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，主要涉及抗⑶19人鼠嵌合抗体Hm2E8b的研制及在制备B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗药物中的用途。
背景技术：
自1975年，Milstein和Kohler成功建立了制备单克隆抗体的方法以来，随着抗体工程技术的发展，单克隆抗体已经广泛用于基础研究和临床诊断及治疗。单克隆抗体分子量小，毒性小，特异性高，但是目前大多数高亲和力的单抗是鼠源性的，在临床导向治疗中可能发生血清病或产生人抗鼠免疫球蛋白抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有将其进行人源化的改造，将抗体分子中部分鼠源片段替换为人源片段，以大大降低或基本消除抗体的免疫原性。抗体与抗原的结合位点位于可变区Fv段，而免疫原性主要位于恒定区Fc段。最简单的改造就是弃Fc段，保留Fv段，但是由于天然走向的Fv抗体片段，VH 和VL容易发生自由解离，结构不稳定，故现在较为多见的就是构建单链抗体(single chain Fv antibody fragments， scFv)0ScFv是由一个携带了完整抗原结合位点的单基因编码而成，由抗体重链(VH)和轻链(VL)的可变区通过一段弹性短肽(Linker)相连而成，是最小的功能性抗体片段，仅有一个抗原结合位点，拥有与原代抗体相似的抗原结合力，分子量约27-30 kDa。与天然走向的Fv抗体片段相比，由于减少了 VH和VL的自由解离，更为稳定，局部浓度更高。Linker约 10-25个氨基酸，大多是由甘氨酸和丝氨酸组成，最常用的是(GlyJer)3，可以提供足够的弹性和抑制蛋白酶的作用。scFv分子量小，仅为完整抗体的1/6，与后者相比，它最大的优势就是对肿瘤的穿透率高，静脉给药分布更广泛，加速了与靶位的结合，可以携带药物和某些毒性物质快速到达组织和肿瘤部位。因为缺少恒定区和某些抗体的结合部位，单链抗体具有较低的免疫原性，能够较少非特异性的结合。另外单链抗体半衰期短，体内可以快速清除，因此可广泛应用于药物解毒实验和反射免疫治疗等。但与典型的抗体不同，scFv分子的最大缺陷就是与靶抗原的单价结合，即使其单价结合具有较高的亲和力，解离也总是很快发生，这使得在体内这样的非平衡环境中不能在靶位长时间停留。近年来许多设计通过交联的方法或者重组融合的方法将scFv改造成二聚体或其它多聚分子，这些多聚体可以与单一的靶抗原结合或同时和多种靶抗原结合， 分子量在60-120kDa，亲和力强，从细胞表面和多价抗原上解离的速度慢，半衰期长，并且保持了较强的肿瘤穿透力。其中一个有效的办法就是将scFv与Ig的Fc段结合，与免疫球蛋白超家族成员相比，scFv-Fc在肿瘤中的浓度较高，而且通过Fc受体的交联作用，可以延长scFv-Fc在体内的半衰期。、链的Fc段包含IgG的铰链区，CH2和CH3片段，其中铰链区包含了树木不等的半胱氨酸，参与重链间二硫键的形成，有助于二聚体的形成，而CH2片段可以和各种各样的效应细胞的Clq和Fc受体结合，与Clq发生反应后可以激活补体依赖细胞毒反应(CDC)，与Fc受体结合可以激活抗体依赖细胞毒反应(ADCC)和抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP) 以及通过与Fc新生受体结合控制IgG的分解代谢，通过ADCC和CDC效应，吞噬免疫复合物介导抗原递呈，释放细胞因子和促炎症因子。CD19是一种跨膜糖蛋白，约95kDa大小，属于免疫球蛋白超家族，存在于B细胞成熟的各个阶段，在大多数的非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas, NHL)和许多白血病包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)中高表达，而且CD19在造血干细胞以及其它非B系的正常组织中不表达，因此⑶19是淋巴细胞起源肿瘤的一个重要的靶位。在过去的20年中，通过⑶20嵌合抗体美罗华(rituximab)的联合化疗，许多 B-NHL和B淋巴细胞白血病成功得到了治疗。在美罗华的治疗过程中，部分B细胞肿瘤的病人会出现CD20抗原丢失，部分病人会出现耐药。而且相对于CD20来说，CD19在细胞表面出现较早且存在于整个B细胞的成熟期，在淋巴细胞恶性肿瘤中的表达谱也更广，因此对许多早期B细胞肿瘤来如ALL以及部分CD20—对美罗华不敏感的肿瘤来说，CD19抗体可作为理想的靶向治疗的药物。ZCH (Zhejiang Children's Hospital )_4_2E8 (简称 2E8)，为抗 CD19 单抗，属鼠 IgM亚类，要应用于临床，需要对其进行人源化的改造。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗CD19的人鼠嵌合型的抗体Hm2E8b，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所述。本发明的另一个目的是提供所述的一种抗CD19的人鼠嵌合型的抗体Hm2E8b在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤药物中的应用。CD19分子是B淋巴细胞特异性的信号转导表面受体，存在于B细胞成熟的各个阶段，在大多数的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和许多白血病包括急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)中高表达，目前已成为免疫治疗的一个重要靶位。目前针对B系恶性肿瘤的治疗，已经有一些⑶19特异性抗体治疗，包括非结合抗体，药物共轭抗体以及双特异性的抗体(CD19-CD3)，在体外实验、动物模型、以及早期的临床实验中取得较为理想的成果。但是也存在不少的问题，因此有必要对更多的CD19抗体进行优化。ZCH-4-2E8 单抗具有良好的识别B淋巴细胞肿瘤细胞膜CD19抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，体外实验表明，2E8免疫毒素对2E8阳性的急性B细胞性白血病细胞具有良好的选择性杀伤作用，而对2E8阴性的细胞却无作用，因此，该抗体具有潜在治疗B细胞性恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤的应用前景。但2E8是鼠源性的抗体，应用于人体会产生免疫反应其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗体)的Fc段对人体具有免疫原性，因此，有必要对鼠源性抗体进行人源化改造。本发明研制的嵌合抗体Hm2E8b，是通过一系列繁琐而复杂的分子生物学技术构建带有SCFv2E8-FC基因的分泌型真核表达载体，然后转染哺乳动物细胞CHO获得的。该抗体对2E8阳性的急性B细胞性白血病细胞具有良好的选择性杀伤作用，对临床B淋巴细胞性白血病及其它B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗产生十分重要的应用价值。


图1是2E8 1细胞的总RNA电泳图。图 2 是 PCR 产物 Leader_VH2E8 和 VL2E8 电泳图。图 3 是 PCR 产物 Leader_scFv2E8 电泳图。图 4 是 TA- Leader-scFv2E8 酶切鉴定图。图 5 是 TA- Leader-scFv2E8 测序结果。图 6 是 TA- Leader-scFv2E8 和 pHMCH3 双酶切电泳图。图7是pHMCH3-Hm2E8b双酶切鉴定电泳图。
图8是转染级纯pHMCH3-Hm2E8b质粒电泳。图9是筛选第14天未转染组CHO细胞(A)和转染组细胞(B)。图 10 是 CHO-Hm2Em3 RT-PCR 产物电泳图。图11是CHO (A)和CH0_Hm2E8b (B)细胞免疫荧光图。图12是Hm2Em3-CHO亚克隆流式筛选图。图 13 是 Ηι 2Ε^3 SDS-PAGE 图。图 14 是 Ηι 2Ε^3 Western-Blot 图。图15是流式间标法CH0-Hm2E8b细胞培养上清Hm2E8b嵌合抗体活性检测结果。图16是CH0-Hm2E8b细胞培养上清Hm2E8b嵌合抗体对直标单抗2E8-FITC的流式细胞阻滞结果。图 17 是 Hm2E8b 对 Nalm6 的 CDC 作用。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一真核表达载体pHMCH3-Hm2E8b的构建
抽提2E8杂交瘤细胞RNA，以此为模板，通过SOE的方法扩增Leader-SCFV2E8片段， 建立TA克隆，测序正确后插入PHMCH3载体(带有人IgGl的Fc片段)，构建真核表达载体 pHMCH3-Hm2E8b。1. 2E8杂交瘤细胞RNA的抽提和处理 1. 1总RNA的抽提
(1)计数细胞，共5XIO6个活细胞；
(2)常温下IOOOrpm离心15分钟，弃去上清；
(3)沉淀中加入无菌生理盐水IOOOrpm离心15分钟，洗涤2次；
(4)向沉淀中加入ImlTRIZOL (lml/5X IO6细胞)，立即用Iml移液枪反复吹吸数分钟，将溶液转入1. 5ml eppendorf管中，室温下静置5分钟；
(5)加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置5分钟；
(6)4° C下12000g离心15分钟，将水相转入新的1. 5ml的印pendorf管中，加入 0. 5ml异丙醇，立即摇勻，室温下静置5分钟；
(7)4°C 下，12000g 离心 10 分钟；
(8)弃去上清，加入1.5ml75%乙醇，混勻，4° C下，7500g离心5分钟，弃去上清；
(9)无菌操作台晾干，加入25μ 1无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80° C冰箱保存。
1.2总RNA凝胶电泳及浓度的测定
抽提2组2E8细胞总RNA，分别琼脂糖凝胶电泳，结果显示明显的28S、18S及5S 3条条带(参见图1，M为分子标志物，泳道1和泳道2均为抽提后的总RNA，其中泳道1加样品过多，泳道2加样品量适中，用于进一步实验。泳道1有杂带，泳道2条带清晰，纯度高，选用泳道2的RNA作为逆转录模板)。取出2 μ 1新抽提的总RNA，加入98 μ 1 DEPC水混勻，紫外分光光度计测定Α260=0. 273，Α280=0. 150，计算其浓度为0. 569 ( μ g/μ 1)。1. 3 RT合成cDNA (按照逆转录酶说明书进行)2. PCR 反应扩增 Leader_scFv2E8 片段
2. 1设计引物通过PCR，扩增出2E8的Leader-VH和VL片段，通过重叠延伸PCR的方法将Leader-VH和VL片段通过Linker (Gly4Ser) 3连接起来,构建Leader_scFv2E8，同时在两端引入酶切位点BamH I和EcoR I。(下划线部分为酶切位点) 重链 5，端引物(Pl) (SEQ ID NO 3) CGCGGATCCATGGATTGGCTGTGG 轻链 3，端引物(P2) (SEQ ID NO 4) ATACAGACAAGTAGGATGAAGATTGTGTCATCTGGATGTC 重链 5，端引物(P3) (SEQ ID NO 5) GACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTAT 轻链 3，端引物(P4) (SEQ ID NO 6) CCGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGG 。2. 2 PCR 反应体系
权利要求
1.一种人鼠嵌合型抗人⑶19抗体Hm2E8b，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
2.根据权利要求1所述的一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明提供抗一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b，是鼠源性单克隆抗体ZCH-4-2E8的单链抗体和人IgG的Fc片段结合的嵌合抗体。本发明提供的单抗具有良好的识别B淋巴细胞肿瘤细胞膜CD19抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，体外实验表明，该抗体对CD19阳性的细胞具有良好的选择性杀伤作用，因此，可在制备治疗B淋巴细胞性恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤药物中的应用。
文档编号A61P35/02GK102250250SQ20111019134
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月9日 优先权日2011年7月9日
发明者汤永民, 沈笛颖 申请人:浙江大学