专利名称：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
本发明涉及注射液的制备方法，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞抗肝纤维化 注射液及其制备方法。肝纤维化是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程的代偿反 应，是细胞外基质在肝内过渡沉积的病理改变的结果，也是慢性肝病发展为肝硬化的重 要中间环节。目前这个阶段的肝脏病变是可逆转的，但若没有得到及时有效的治疗，则 最终往往导致肝硬化、上消化道出血、肝腹水、肝癌和肝功能衰竭等，是引起人类死亡 的主要原因之一，因而逆转或延缓肝纤维化过程是肝病治疗的一个重要环节。引起肝纤 维化的病因很多，在国内以病毒性肝炎，尤其是慢性乙型和丙型肝炎所致的肝纤维化最 为常见。在我国，乙型肝炎病毒表面抗原的检出率约为10%，其中慢性无症状乙型肝炎 病毒感染者或慢性无症状HBV携带者就超过1.3亿，现慢性乙肝患者约3000万人。慢 性感染患者中40%可能发生肝硬化或者肝癌，是正常人群的100-200倍。在国外，特别 是北美、西欧则以酒精性肝纤维化为最多。此外某些遗传和代谢疾病、化学毒物或药物 损伤、血吸虫感染、各种原因导致的肝脏淤血、胆汁淤积、自身免疫性肝病都可以出现 肝纤维化。因此，肝纤维化的治疗成为现今人们关注的焦点。如何有效地防治肝纤维化， 阻断其进展，对改善慢性肝病的预后有重要的意义，不仅为国家节省大量的资源，还促 进了社会更加和谐发展。然而，现代医学并无治疗肝纤维化的特异性药物，多采用休 息、加强营养、补充维生素等对症治疗方式，严重者需被迫停止用药，以免加重肝纤维 化。尽管中医药对肝纤维化有一定的促再生和修复作用，但效果仍不是十分理想。目前也有利用干细胞移植的方法治疗肝纤维化，但多采用骨髓间充质干细胞， 细胞来源有限。且输注前细胞处理过程比较简单，不能保证使用过程中细胞的稳定性， 不能较长时间保持细胞活性，因此不适于远距离运输。且间充质干细胞表面表达多种黏 附分子，主要参与细胞_细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程，影响细胞迁移。因 此，在干细胞输注过程中极易促使细胞聚集成团，形成细胞栓，增加了间充质干细胞临 床治疗的危险性。对此问题，目前尚无极好的解决办法。本发明采用人脐带组织分离出来的间充质干细胞，加入肝素钙、人血白蛋白、 勃脉力A，制备成注射液形式。稳定性高，较好的解决了细胞聚集成团的问题，增加了 注射液保存及运输过程稳定性、提高了临床使用安全性，进而更好的保持了注射液的疗 效，为临床使用干细胞开辟了新的道路。本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种人脐带间充质干细胞抗肝 纤维化注射液及其制备方法，其具有稳定性高、疗效好、安全性高、便于储存和运输，适应临床大规模使用，应用前景广阔的特点，本发明可为肝纤维化患者带来福音，为临 床上干细胞的使用开辟了新的道路。
本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，由10%-50%人血白蛋 白原液、49.5% 89.50%的勃脉力A液和0.5%肝素钙组成，其中所述人血白蛋白原液的浓 度为10%，Iml注射液中含有人脐带间充质干细胞6X 105-7X IO5个。肝素钙是一种含有 多糖类化合物，并具有防止细胞聚集成团功能的制剂。所述注射液由20%人血白蛋白原液和79.5%勃脉力A液以及0.5%肝素钙组成， 其中该注射液中的人脐带间充质干细胞的浓度为6.8 X IO5个/ml。所述注射液使用静脉输注方式，按照人脐带间充质干细胞0.5X IO6-I X IO6个细 胞/公斤体重注入患者体内。本发明又提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，包括提 供间充质干细胞保存液，预冷、备用，所述的间充质干细胞保存液包括人血白蛋白原 液、勃脉力A液和肝素钙；提供人脐带间充质干细胞；将获得的人脐带间充质干细胞加 入到间充质干细胞保存液中；通过重悬的方式，调整加入到间充质干细胞保存液中的人 脐带间充质干细胞数量为6 X IO5-IX IO5个细胞/1ml。所述间充质干细胞保存液是由10% -50%的浓度为10%的人血白蛋白原液 49.50% -89.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙混勻组成。所述间充质干细胞保存液由20%人血白蛋白原液和79.5%勃脉力A液、0.5%肝 素钙组成。所述人脐带间充质干细胞通过如下的方式制备(1)取放有第3-7代人脐带间充 质干细胞的培养瓶；(3)吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用IOml的D-hank’ s平衡盐液 缓冲液清洗两次，吸弃洗液；(4)每瓶中加入Iml胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5_7分 钟；(5)在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞完 全消化下来；(6)每瓶中加入0.2ml血清终止消化；每瓶中加入IOml的D-hank，s平衡 盐液，反复吹打，制得细胞悬液；(7)将细胞悬液移入离心管中，以900rpm的离心速度 离心5秒，离心结束，吸弃上清，获得人脐带间充质干细胞。通过如下的方式调整干细胞保存液中的细胞量(8)用间充质干细胞保存液重 悬人脐带间充质干细胞，用微量加样枪吸取少许细胞悬液，用做细胞计数及细胞活力检 测，舍弃死细胞，并计数活细胞；如活细胞数浓度为6X 105-7X 105个细胞/lml，进行 步骤(10)；否则继续用步骤(9)再进行调整；(9)然后以900rpm的离心速度离心5秒， 吸弃上清，加入保存液，使细胞浓度为6 X 105-7 X IO5个细胞/lml，再进行步骤(10)； (10)将调整后的6X 105-7X IO5个细胞/lml的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液进 行封装保存。吸弃培养瓶中原有培养基前需对培养瓶进行消毒处理，具体为用酒精棉球擦拭 培养瓶盖口四周，然后旋开瓶盖。所述细胞计数及细胞活力检测具体为将细胞悬液和0.4%的台盼兰溶液按 1 1进行混合；轻轻混勻，1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥 台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞。本发明与现有技术相比，具有以下优点
本发明打破了肝纤维化的传统治疗方法，巧妙的运用人脐带来源的间充质干细 胞(简称MSCs，英文全称mesenchymal stem cells)，并将其与其他成分组合制备成注
射液形式，即人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其稳定性高，解决了现有技术在 干细胞输注过程中细胞容易聚集成团的问题，并且延长了待使用细胞的保质时间，24h内 细胞活率仍维持在90%以上，疗效好、使用更安全，适于较长时间的保存及运输，用后 无任何毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。本发明提供的注射液可分化成有功能 的肝细胞；具有再生修复实质器官和发挥免疫调节的双向作用，提高免疫功能，改善肝 脏的微环境以及降低炎性细胞因子分泌的能力，减轻炎症反应；抑制肝星状细胞活化、 阻止细胞外基质的生成，逆转肝纤维化；激活卵原细胞，促进肝细胞再生，修复实质器 官和慢性肝损害，间接地提高了抗病毒治疗疗效。且本发明注射液中的人脐带间充质 干细胞由于来源广泛，不受伦理限制、免疫原性低使其成为肝纤维化治疗的新的有效手 段，应用前景十分广阔。

图1为本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法的流程 图。图2为本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液和与本发明提供的 人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液成分相同但不加入肝素钙的细胞溶液静置12h后 显微镜下的照片。其中A、B为本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液静 置12h后显微镜下照片，其中A为4倍镜下的照片，B为10倍镜下的照片；C、D为含 有与本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液成分相同但不加入肝素钙的细 胞溶液静置12h显微镜下照片，其中C为4倍镜下的照片，D为10倍镜下的照片。为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附 图及较佳实施例，对依据本发明提出的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备 方法，其具体实施方式
、结构、特征及其功效，说明如后。本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，由10% -50%的人血白 蛋白原液和49.5%-89.5%的勃脉力A液、0.5%肝素钙组成，所述人血白蛋白原液的浓度 为10%，注射液中人脐带间充质干细胞的浓度为6X 105-7X IO5个/ml。本发明实施例的 注射液由20%的浓度为10%的人血白蛋白原液和79.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙组成， 其中该注射液中的人脐带间充质干细胞的浓度为6.8X IO5个/ml。所述注射液使用静脉输 注方式，按照人脐带间充质干细胞0.5X 106-1 X 106个细胞/公斤体重注入患者体内。本 发明注射液中的人血白蛋白原液是哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司生产的国药准 字为S10920005的人血白蛋白原液，该原液浓度为10%。本发明提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，如图1所 示，包括四步骤1、提供间充质干细胞保存液，预冷、备用，所述的间充质干细胞保存液包括人 血白蛋白原液、勃脉力A液、肝素钙；
2、提供人脐带间充质干细胞；3、将获得的人脐带间充质干细胞加入到间充质干细胞保存液中；4、通过重悬的方式，调整加入到间充质干细胞保存液中的人脐带间充质干细胞 数量为6X 105-7X 105个细胞/lml。本发明实施例的间充质干细胞保存液是由10% -50%的浓度是10%的人血白蛋 白原液和49.5% -89.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙混勻组成。本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，具体 包括以下步骤1、提供间充质干细胞保存液，预冷、备用，该间充质干细胞保存液由20%的人 血白蛋白原液和79.5%的勃脉力A液、0.5%肝素钙组成，其中该人血白蛋白原液的浓度 为 10%。2、由下述步骤(1)至(7)制备并获得本发明注射液所需的人脐带间充质干细 胞(1)取放有第3-7代人脐带间充质干细胞的培养瓶；(2)用酒精棉球擦拭培养瓶盖口四周，然后旋开瓶盖；(3)吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用IOml的D-hank’ s平衡盐液缓冲液(该 D-hank，s 平衡盐液缓冲液含有 0.8% 的 NaCl，0.04% 的 KC1，0.006% 的 Na2HPO4 · H2O 和0.006%的KH2PO4)清洗两次，吸弃洗液；(4)每瓶中加入Iml胰酶-EDTA(EDTA的中文全称乙二胺四乙酸钠，英文全 称ethylenediamine traacetic acid)，放入 37°C 孵箱中 5-7 分钟；(5)在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞 完全消化下来；(6)每瓶中加入0.2ml血清终止消化；每瓶中加入IOml的D_hank，s平衡盐液，
反复吹打，制得细胞悬液；(7)将细胞悬液移入离心管中，以900rpm的离心速度离心5秒，离心结束，吸
弃上清，获得人脐带间充质干细胞。3、将获得的人脐带间充质干细胞加入到间充质干细胞保存液中。4、通过重悬的方式，调整加入到间充质干细胞保存液中的人脐带间充质干细胞 数量为6 X 105-7 X IO5个细胞/lml，具体调整过程为(8)用间充质干细胞保存液重悬人脐带间充质干细胞，用微量加样枪吸取少许细 胞悬液，用做细胞计数及细胞活力检测，舍弃死细胞，并计数活细胞；如活细胞数浓度 为6X 105-7X 105个细胞/lml，进行步骤(10)；否则继续用步骤(9)再进行调整；所述 细胞计数及细胞活力检测具体为将细胞悬液和0.4%的台盼兰溶液按1 1进行混合； 轻轻混勻，1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥台盼兰，染成蓝 色的细胞是死细胞；(9)然后以900rpm的 离心速度离心5秒，吸弃上清，加入保存液，使细胞浓度 为6X 105-7X 105个细胞/lml，再进行步骤(10)；(10)将调整后的6X 105-7X IO5个细胞/lml的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化
注射液进行封装保存。
下面以间充质干细胞保存液为50ml，制得人脐带间充质干细胞浓度为6.8X105 个细胞/Iml为例，进行具体详细的说明本发明注射液的制备过程(1)、吸取人血白蛋白原液10ml，0.25ml肝素钙，剩余部分用勃脉力A液补充至 50ml,混勻制得间充质干细胞保存液，预冷、备用；(2)、取装有第3-7代人脐带间充质干细胞的培养瓶；
(3)、用酒精棉球擦拭培养瓶盖口四周，旋开瓶盖；(4)、吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用IOml的D-hank’ s缓冲液清洗两次， 吸弃洗液；(5)、每瓶中加入Iml胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5-7分钟；(6)、在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细 胞完全消化下来；(7)、每瓶中加入0.2ml血清终止消化；(8)、每瓶中加入IOml的D-hank’ s缓冲液，反复吹打，制得细胞悬液；(9)、将细胞悬液移入若干离心管中，以900rpm的离心速度离心5秒，离心结
束，吸弃上清，制得人脐带间充质干细胞；(10)、取出所需间充质干细胞保存液，将获得的人脐带间充质干细胞加入到间 充质干细胞保存液中；(11)、用20ml间充质干细胞保存液重悬人脐带间充质干细胞，并合并到50ml离 心管中；(12)、用微量加样枪吸取少许细胞悬液，用做细胞计数及细胞活力检测，舍弃 死细胞，并计数活细胞；所述细胞计数及细胞活力检测具体为将细胞悬液和0.4%的台 盼兰溶液按1 1进行混合；轻轻混勻，1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞， 活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞；(13)、如活细胞数浓度为6.8 X IO5个细胞/lml，进行步骤(15)；否则继续用步 骤(14)再进行调整；(14)、然后以900rpm的离心速度离心5min，吸弃上清，加入保存液，使细胞浓 度为6.8 X IO5个细胞/lml，再进行步骤(15)；(15)、将调整后的6.8X IO5个细胞/lml的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射 液进行封装保存。制备好的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液需要在4_8°C避光环境下保存和 运输，自分装之时起有效期为12小时。本发明的注射液适用于静脉输注，按患者体重公 斤数计算，推荐用量为0.5 X IO6-I X IO6个细胞/公斤体重。将本发明提供的注射液和不含肝素钙的注射液二者均置于4°C的温度环境下保 存。在保存24小时后取样，并在显微镜下观察两种注射剂中细胞的聚集情况。如图2 所示，在同等保存条件下，本发明提供的注射液在24h内细胞稳定性良好，没有聚集成 团现象，而未加入抗聚集剂的细胞溶液聚集成团现象严重。因此，加入抗聚集剂大大提 高了细胞溶液稳定性，降低了临床使用风险。按本发明所述方法配制四份含有不同浓度人血白蛋白的人脐带间充质干细胞抗 肝纤维化注射液，其中人血白蛋白原液加入比例分别为5%、10%, 20%, 50%,所用人血白蛋白原液的浓度为10%，勃脉力A含量分别为94.5%、89.5%, 79.5%, 49.5%,肝 素钙含量均为0.5%，注射液中的人脐带间充质干细胞的浓度均为6.8X IO5个/ml。将以 上制备好的四份样品置于4°C温度下保存，在保存12小时时取样，并测定细胞存活率。测定方法将细胞悬液0.5ml加入试管中；加入0.5ml浓度为0.2%的台盼兰染 液；将细胞悬液吸出10 μ 1，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；静置1分 钟；随机选取几个视野，共计数300个细胞，并计数其中死细胞数目，计细胞活力，重 复计数5次取平均值。如表格1-3所示，为选用三根不同脐带进行的试验。0.05的ρ值 通常被认为是可接受错误的边界水平。
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权利要求
1.一种人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其特征在于，由10%-50%人血白蛋 白原液和49.5%-89.5%的勃脉力A液、0.5%肝素钙组成，其中所述人血白蛋白原液的浓 度为10%，Iml注射液中含有人脐带间充质干细胞6 X 105-7 X IO5个。
2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其特征在于，所述注 射液由20%人血白蛋白原液和79.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙组成，其中该注射液中的 人脐带间充质干细胞的浓度为6.8 X IO5个/ml。
3.如权利要求2所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其特征在于，所述注 射液使用静脉输注方式，按照人脐带间充质干细胞0.5X IO6-I X IO6个细胞/公斤体重注 入患者体内。
4.权利要求1所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征在 于，包括提供间充质干细胞保存液，预冷、备用，所述的间充质干细胞保存液包括人血白蛋 白原液、勃脉力A液和肝素钙；提供人脐带间充质干细胞；将获得的人脐带间充质干细胞加入到间充质干细胞保存液中；通过重悬的方式，调整加入到间充质干细胞保存液中的人脐带间充质干细胞数量为 6X 105-7X 105 个细胞/lml。
5.如权利要求4所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特 征在于，所述间充质干细胞保存液是由10% -50%的浓度为10%的人血白蛋白原液和 49.5% -89.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙混勻组成。
6.如权利要求5所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征在 于，所述间充质干细胞保存液由20%人血白蛋白原液和79.5%勃脉力A液、0.5%肝素钙 组成。
7.如权利要求6所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征在 于，所述人脐带间充质干细胞通过如下的方式制备(1)取放有第3-7代人脐带间充质干细胞的培养瓶；(3)吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用IOml的D-hank’s平衡盐液缓冲液清洗两次， 吸弃洗液；(4)每瓶中加入Iml胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5_7分钟；(5)在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞完全 消化下来；(6)每瓶中加入0.2ml血清终止消化；每瓶中加入IOml的D_hank，s平衡盐液，反 复吹打，制得细胞悬液；(7)将细胞悬液移入离心管中，以900rpm的离心速度离心5秒，离心结束，吸弃上 清，获得人脐带间充质干细胞。
8.如权利要求7所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征在 于，通过如下的方式调整干细胞保存液中的细胞量(8)用间充质干细胞保存液重悬人脐带间充质干细胞，用微量加样枪吸取少许细胞 悬液，用做细胞计数及细胞活力检测，舍弃死细胞，并计数活细胞；如活细胞数浓度为6X 105-7X 105个细胞/lml，进行步骤(10)；否则继续用步骤(9)再进行调整；(9)然后以900rpm的离心速度离心5秒，吸弃上清，加入保存液，使细胞浓度为 6X 105-7X 105个细胞/lml，再进行步骤(10)；(10)将调整后的6X105-7X IO5个细胞/lml的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射 液进行封装保存。
9.如权利要求8所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征在 于，吸弃培养瓶中原有培养基前需对培养瓶进行消毒处理，具体为用酒精棉球擦拭培养 瓶盖口四周，然后旋开瓶盖。
10.如权利要求9所述的人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，其特征 在于，所述细胞计数及细胞活力检测具体为将细胞悬液和0.4%的台盼兰溶液按1 1 进行混合；轻轻混勻，1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞。
全文摘要
本发明公开了人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法，该注射液由10％-50％人血白蛋白原液和49.5％-89.5％的勃脉力A液、0.5％肝素钙组成，其中人血白蛋白原液的浓度为10％，1ml注射液中含有人脐带间充质干细胞6×105-7×105个；其制备方法包括提供间充质干细胞保存液，预冷、备用，该间充质干细胞保存液包括人血白蛋白原液和勃脉力A液、肝素钙；提供人脐带间充质干细胞并将其加入到间充质干细胞保存液中；通过重悬的方式，调整加入到间充质干细胞保存液中的人脐带间充质干细胞数量为6×105-7×105个细胞/1ml。本发明注射液疗效显著，稳定性高，便于保存和运输，使用安全，可为肝纤维化患者带来福音。
文档编号A61K35/44GK102008507SQ20101055172
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月21日 优先权日2010年11月21日
发明者刘广洋, 刘拥军, 徐萌, 朱德琳, 谢姜 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司