专利名称：具有抗癌与免疫增强活性的虎乳灵芝提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及具有显著抗肿瘤活性的药用菇类提取物及其制备方法和用途。属于生物工程技术和天然高分子领域。
背景技术：
二十世纪六十年代以来，生物学家和化学家在真菌多糖及糖复合物方面取得了极大的进展，发现多糖和糖蛋白可以作为免疫调节剂，免疫引发剂和生物反应修饰剂，通过调节免疫系统，激活免疫细胞实现对肿瘤和癌细胞的杀伤同时不会伤害正常细胞；有些多糖和糖蛋白还可以直接在体外杀死肿瘤细胞。很多北美、欧洲以及亚洲的科学家在研究多糖和糖蛋白活性及机理的同时还在寻找新的更有效的真菌，找出其中的活性成分的类型以及其化学构型和分子机理。虎乳灵芝，学名Polyporusrhinocerus Cooke[Lignosus rhinocerus(Cooke)Ryv.]，又名孤苓[1]。虎乳灵芝并非灵芝科中的种类，而是一种新品种的多孔菌，属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、虎乳灵芝(孤苓)属(或多也菌属)。香港特区国药商店出售此种新的药用菌。它是一种白色木腐菌，可仿照香菇、木耳等进行代料栽培。
我们实验室对虎乳灵芝进行了人工培养与栽培，该虎乳灵芝存放于香港中文大学植物样本室(Herbarium)，样本编号为CUHK-MUSH-001-2003-Sanming。至今没有专业文献报道它的活性成分和活性机理。本实验室经研究首次从虎乳灵芝中用不同方法得到一系列提取物，对其进行表征和活性测试，发现其对某些肿瘤细胞有很强的抑制作用，并提出其活性的机理。

发明内容
本发明的目的是提供具有显著抗肿瘤活性的虎乳灵芝提取物及其制备方法和用途，这些提取物的获得以人工培育的虎乳灵芝菌核为原料，制备方法简单，易进行工业化生产。
本发明的第一方面涉及虎乳灵芝提取物，其中含有55％-65％的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，所述提取物还含有45％-35％的多糖。
在本发明的另一实施方案中，所述多糖含有80％以上的葡萄糖，优选地，所述多糖含有80-97％的葡萄糖。
在本发明的另一实施方案中，所述提取物是通过以下方法制备的将虎乳灵芝与热水混合提取1-2小时；收集上清。
本发明的第二方面涉及虎乳灵芝提取物的制备方法，该方法包括将虎乳灵芝与热水混合提取1-2小时；收集上清。
本发明的第三方面涉及另一种虎乳灵芝提取物，其含有占该提取物95％以上重量百分比的多糖。
在本发明的一个实施方案中，所述另一种提取物是由碱和超声提取方法制备的，其包括将虎乳灵芝，优选虎乳灵芝菌核粉末浸泡在碱溶液中；超声提取；收集上清。
本发明的第四方面涉及所述另一种虎乳灵芝提取物的制备方法，包括将虎乳灵芝，优选虎乳灵芝菌核粉末浸泡在碱溶液中；超声提取；收集上清。
在本发明该方法的一实施方案中，可包括在超声提取之前用酸中和混合物的步骤。
本发明的第五方面涉及含有有效量本发明虎乳灵芝提取物的抗肿瘤细胞增殖的药物组合物或功能食品。
本发明的第六方面涉及含有有效量本发明虎乳灵芝提取物的增强免疫功能的药物组合物或功能食品。
本发明的第七方面涉及本发明虎乳灵芝提取物在制备含有其抗肿瘤药物组合物或功能食品中的用途。
本发明的第八方面涉及含有上述虎乳灵芝提取物在制备含有其增强免疫功能的药物组合物或功能食品中的用途。
本发明使用的虎乳灵芝可从商业途径购买得到，例如从香港特区国药店购买得到。也可将该菌种经人工栽培得到，例如由福建三明真菌研究所提供的或采自野外的菌种，经人工培养栽培得到。由于虎乳灵芝是木腐菌，可仿照香菇、木耳等进行代料栽培，也可参照黄年来(一种药用菌一虎乳灵芝学名的鉴定，食用菌学报1999，6(1)30-32)所述的方法以及其它方法进行栽培。
在本发明中优选使用香港中文大学人工培养栽培的虎乳灵芝菌核。
可以理解，本发明药物组合物或功能食品除含有本发明的虎乳灵芝提取物之外，还可含有药物可接受的载体或赋形剂等等；本发明功能食品除含有本发明的虎乳灵芝提取物之外，还可含有其它食品、食品添加剂或香料等等。
具体实施方案虎乳灵芝提取物的水提制备方法本发明所用的虎乳灵芝可以产自中国的台湾地区、香港地区、以及东南沿海地区，优选福建产的虎乳灵芝菌核。
将人工培养的虎乳灵芝，优选使用菌核粉末，与热水混合提取，或与凉水混合通过加热来提取，优选提取1-2小时。提取后冷却到室温，收集提取液的上清。所获得的上清即为本发明的虎乳灵芝提取物。优选地，将收集到的上清液进一步浓缩然后超滤直到总溶质(TDS)的数值在10以下。可选择地将由此获得的粗提产物冷冻干燥，得到的白色产物即为虎乳灵芝的水提取物冻干品。
本发明所述菌核粉末的制备是本领域公知，例如通过碾压过筛的方法制备，本发明中优选使用0.5mm的筛子得到的菌核粉末。
本发明所述热水一般指30℃以上的水，优选是超过60℃的热水，较优选为95-100℃。
收集上清的方法是本领域所属技术人员公知的，例如离心、过滤、倾析等，优选通过离心分离上清液。本发明的离心采用能够分离得到虎乳灵芝提取物中蛋白和多糖成分的分离条件，在混合物中分离蛋白和多糖的离心条件是本领域所述技术人员公知，例如优选9,000-10,000×g离心20-40分钟。
虎乳灵芝提取物的碱-超声制备方法将虎乳灵芝菌，优选上述制备的菌核粉末，以一定的重量体积比(虎乳灵芝∶碱重量体积比，w∶v)与一定摩尔浓度的碱溶液混合。浸泡一定时间，优选浸泡24-48小时使之溶胀，然后用酸溶液中和。随后利用超声提取上述混合物。可选择地在用酸中和之前进行上述超声步骤，然后再用酸中和。如上所述利用本领域所属技术人员公知的分离方法收集上清，优选通过离心收集上清液，即为虎乳灵芝提取物。优选地将收集到的上清液用蒸馏水透析得到所述虎乳灵芝提取物。可选择地对该提取物进行冻干，这样得到的提取物或白色粉末状产物即为所需要的提取物冻干品。
通常根据碱的摩尔浓度来确定混合的比例，例如当选用1M氢氧化钠时，虎乳灵芝与碱的混合比例(w∶v)为1∶20至1∶25的比例。
选择合适的碱溶液是本领域所述技术人员公知，该碱溶液可选择自诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙水溶液的无机碱。
可用的酸溶液包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、正磷酸、多磷酸等等，优选4M盐酸。
利用超声提取上述碱与虎乳灵芝的混合物时，优选在冰浴的条件下不停搅拌混合物，超声提取20-30分钟。
碱-超声提取中残渣的再提取可选择地，上述碱-超声提取方法中超声后的残渣(为便于描述，在本发明中称为“残渣I”)用蒸馏水洗涤至少三次除去残渣中的盐分，洗涤后，利用本领域公知的方法除去含盐的蒸馏水部分，例如在约5000×g的条件下约30分钟。除去盐分的残渣用于下一步的水提取，方法同水提取方法。可选择地将上述提取方法重复三次并将三次提取的上清液合并，剩余残渣记为II。将收集到的上清液对蒸馏水透析然后冻干。这样得到白色粉末状产物，标记为第一次的残渣提取物。
可选择地将水提取后的残渣继续用碱进行提取，方法同上述碱提取方法，但可选择地不进行超声提取的步骤。在此方法中，在0-4℃用4M的氢氧化钠水溶液进行浸泡。根据上述方法分离上清液。优选地，上述提取方法重复两次并将得到的上清液合并，剩余残渣记为III。上清液用4M盐酸中和，然后对蒸馏水透析得到提取液，可选择地冻干得到白色粉末状产物，即为第二次残渣提取物。
可对剩下的残渣III进行再一次的提取，除利用热碱、优选温度在95-100℃之外，其余步骤同上。将混合物冷却到室温后，根据上述方法分离上清液。优选地，上述提取方法重复两次并将所得上清液合并。然后将上清液用酸中和，优选用4M盐酸中和，对蒸馏水透析，冻干得到白色粉末状产物，即为第三次残渣提取物。
虎乳灵芝提取物的组成本发明提供的水提虎乳灵芝提取物中，通常含有55％-65％的蛋白质，还含有45％-35％的多糖。
对本发明的水提取物的多糖部分进行组成鉴定，所述多糖含有80.5-85.5％重量百分比的葡萄糖，11-13％重量百分比的甘露糖，2.0-3.0％重量百分比的半乳糖，1.0-2.0％重量百分比的核糖，和0.5-1.5％重量百分比的鼠李糖。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述碱-超声虎乳灵芝提取物通常含有超过95％重量百分比的多糖。
对所述碱-超声提取方法得到的多糖部分进行组成鉴定，所述多糖含有90-98％重量百分比的葡萄糖；1-2％重量百分比的葡萄糖胺。
在本发明的另一实施方案中，所述碱-超声提取物的多糖部分还含有痕量的甘露糖和木糖。
对所获得的提取物进行组成鉴定的方法是本领域公知的，这些方法例如质谱分析，高效液相等等。
虎乳灵芝水提取物的生物活性A.抗肿瘤活性将本发明上述方法获得的提取物分别与体外培养的肿瘤细胞株接触或孵育，从而验证其对肿瘤生长繁殖的抑制作用。根据目前通用的体外抗肿瘤试验选择适合的具有代表性的细胞株，例如实体瘤中的乳腺癌细胞(MCF-7)和HepG2肝癌细胞，以及血液癌症中的慢性白血病癌细胞(K562)进行体外试验。本领域所述技术人员应理解选择其它的肿瘤细胞株也会得到本发明提取物的活性的相似结果。
此外，还将本发明上述方法获得的提取物对活体的被植入肿瘤的动物给药，对上述提取物的体内抗肿瘤活性进行分析。
上述试验的给药剂量、动物或细胞株的选择、作用时间、肿瘤细胞增殖的分析以及其它反应肿瘤细胞增殖的直接或直接指标的选择是本领域所述技术人员公知的，例如可组织学分析、免疫组化的方法或MTT法(Mosmann，1983)分析肿瘤细胞的增殖，也可通过流式细胞仪(Loken andStall，1982)对肿瘤细胞的增殖周期或细胞凋亡进行分析，从而说明本发明提取物的肿瘤抑制作用。
通过上述方法证明本发明的虎乳灵芝提取物在体内和体外均对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用，尤其是水提取方法获得的提取物效果最佳。
B.免疫增强活性将本发明所述的虎乳灵芝提取物对动物给药，优选哺乳动物例如小鼠，一段时间后，检测给药的动物的免疫功能。免疫功能的检测包括体液免疫和/或细胞免疫，以及免疫器官的改变等等，例如分析参加免疫反应的诸如IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12和IL-13的细胞因子的表达，分析诸如脾脏的免疫器官的重量等等。
本领域所属技术人员应理解，检测具有代表性的上述指标即可反应免疫功能状态，只要能够反应本发明所述提取物对免疫功能的影响，本领域所属技术人员可根据试验条件和所用动物对检测指标作出不同的选择。检测免疫功能状态指标的方法也是本领域所属技术人员公知的(可参见例如Wang et al.，2002)。
通过以上分析，本发明的提取物，尤其是水提取物对免疫功能有明显的促进作用。
C.统计学分析数据以平均值±标准差表示，利用组间t(t-test)检验分析组间差异。
含有虎乳灵芝的药物组合物本发明所述药物组合物含有本发明的虎乳灵芝提取物，优选地含有本发明所述方法制备的虎乳灵芝提取物，另外还可含有药物可接受的载体或赋形剂、辅助成分等等。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物中虎乳灵芝提取物的含量约为0.01％至99.9％重量百分比。
通过常规的方式，利用一种或多种药物可接受的载体，可制备本发明的药物组合物。因此，本发明的虎乳灵芝提取物可组方成口服或肠道外(例如静脉内、肌肉内或皮下)的给药形式。
根据诸如给药途径、患者的年龄、体重、待治疗疾病的特性和严重程度以及其它治疗用药种类等因素，可确定本发明所述提取物的用量。对于本领域所属技术人员来说，为实现抑制肿瘤细胞增殖或最终杀灭肿瘤细胞的治疗目的，或者为实现提高机体免疫能力的目的，选择适合的治疗有效剂量是显而易见的。
在本发明的一个实施方案中，可将所述药物组合物制备成为口服给药制剂，所述制剂可为例如片剂或胶囊的形式，其通过常规方法用药物可接受的诸如结合剂(例如，预胶质化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)的赋形剂；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)来制备。可通过本领域公知的方法包被所述片剂。用于口服的液体制剂可以为溶液、糖浆或悬浮液、或者其可以为干品的形式在使用前与水或其它的适合载体组合。通过常规方法，利用药物可接受的诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇、甲基纤维素或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇)；及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)的添加剂来制备这种液体制剂。
在本发明的一个实施方案中，对于一般成人、治疗上述治疗或抑制肿瘤生长的口服或肠道外的剂量为500mg或2000mg，可例如每天给药1-4次。
7.含有虎乳灵芝的功能食品的制备对于口服的所述虎乳灵芝的功能食品可根据上述口服的药物组合物的制备方法进行制备，虎乳灵芝提取物的含量也可参考上述药物组合物中的含量。可选择地，所述功能食品可含有其它的抗肿瘤、提高免疫力的功能食品或中药提取物。此外所述的虎乳灵芝功能食品可制备成其它的多种形式的食品，例如颗粒、饮料、药酒等等，其中也可含有其它食品添加剂。
实施例实施例1虎乳灵芝的水提取物将人工培养的虎乳灵芝菌核(由福建省三明真菌研究所提供)剥皮后碾碎，然后通过0.5mm的筛子得到菌核粉末。将大约20克菌核粉末用95-100℃的热水(粉末与热水的重量体积比例为1∶25)提取2小时。冷却到室温后，混合物在10,000×g条件下离心30分钟分离上清液。将收集到的上清液超滤(孔径为10000 MWCO)后，浓缩到总溶质(TDS)的数值在10以下。这样得到的粗提产物冷冻干燥得到白色产物，标记为HWE1。
水提取方法的产率(重量百分比)为菌核干重的8.62％。
通过质谱分析对HWE1中的成分进行了分析。
结果表明，HWE1为多糖蛋白复合物，其中含61.5％的蛋白质和38.5％的多糖，其中该多糖由82.7％的葡萄糖组成，并含有12.1％的甘露糖，2.31％的半乳糖，1.84％的核糖和1.04％的鼠李糖，见表1。
实施例2利用与实施例1相同的方法，对另一批人工培养的虎乳灵芝菌核进行提取，所获得的提取物的蛋白质和多糖含量与实施例1类似，但多糖中的葡萄糖含量高达98.5％，而只有痕量的甘露糖、半乳糖、核糖和/或鼠李糖。
实施例3虎乳灵芝碱-超声提取物用与实施例1相同的方法制备菌核粉末。将大约20克菌核粉末以1∶25的比例(重量体积比，w∶v)浸泡在1M的氢氧化钠水溶液中使之溶涨48小时。然后将混合物转移到大烧杯中并用4M的盐酸中和直至pH7.0。在盛有混合物的大烧杯中放入超声头(Sonics，VCX600，600W)和机械搅拌棒(Stuart Scientific Stirrer，SS10，80W，50Hz)，在冰浴的条件下不停搅拌混合物，超声提取30分钟。然后混合物在10,000rpm条件下离心30分钟分离上清液，剩余残渣记为I。将收集到的上清液对蒸馏水透析(孔径为6000-8000MWCO)然后冻干。这样得到白色粉末状产物，标记为SonE。
SonE的产率为菌核干重的73.1％，利用质谱方法对其进行组分分析表明，它的多糖含量高达97％，其中98.55％由葡萄糖组成，还含有1.17％的葡萄糖胺，此外含有痕量的甘露糖和木糖(见表1)。
实施例4虎乳灵芝提取残渣的再提取超声提取后的残渣I用蒸馏水洗涤三次除去残渣中的盐分，每次均在5000rpm的条件下离心30分钟。除去盐分的残渣用于下一步的热水提取，方法为用95-100℃的热水提取2小时。冷却到室温后，混合物在10,000rpm条件下离心30分钟分离上清液。将上述提取方法重复三次并将三次提取的上清液合并，剩余残渣记为II。将收集到的上清液对蒸馏水透析(孔径为6000-8000MWCO)然后冻干。这样得到白色粉末状产物，标记为HWE2。
HWE2的产率占菌核干重的0.38％，其中糖类的总含量为59.7％，其中93.6％由葡萄糖组成，还含有3.21％甘露糖，1.79％的葡萄糖胺，此外有痕量的核糖和鼠李糖(见表1)。
水提取后的残渣继续用于以下提取残渣II浸于0℃ 4M的氢氧化钠水溶液中在不断机械搅拌的情况下提取2小时。混合物在10,000rpm条件下离心30分钟分离出上清液。上述提取方法重复两次并将得到的上清液合并，剩余残渣记为III。上清液用4M盐酸中和，然后对蒸馏水透析(孔径为6000-8000MWCO)，冻干得到白色粉末状产物，标记为CAE。
CAE的产率占菌核干重的0.86％，其中糖类的总含量为90.1％，其中95.4％由葡萄糖组成，还含有2.03％甘露糖，1.18％的葡萄糖胺，此外有痕量的核糖，阿拉伯糖和鼠李糖(见表1)。
剩下的残渣III用于最后一种提取物的提取残渣在95-100℃，4M的热碱中提取两小时。将混合物冷却到室温后，在10,000rpm条件下离心30分钟分离出上清液。上述提取方法重复两次并将所得上清液合并。然后将上清液用4M盐酸中和，对蒸馏水透析(孔径为6000-8000MWCO)，冻干得到白色粉末状产物，标记为HAE。
HAE的产率占菌核干重的1.89％，其中糖类的总含量为43.7％，其中96.8％由葡萄糖组成，还含有1.57％的葡萄糖胺，此外有痕量的甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖和鼠李糖(见表1)。
表1.虎乳灵芝提取物的产率，单糖组成、蛋白和糖类含量和产率

-未检测到实施例5虎乳灵芝提取物肿瘤抑制作用的生物活性分析(体外、体内)A.材料与方法虎乳灵芝提取物的用量将虎乳灵芝提取物(HWE1)调制为以下6种浓度12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml的HWE1，然后将其分别加入不同细胞株的各组中，来观察对培养细胞的影响。
细胞株的来源人体急性白血病细胞(HL-60)(CCL-240，ATCC)
人体慢性白血病细胞(K562)(CCL-243，ATCC)实体瘤(S180)(TIB-66，ATCC)人体乳腺癌细胞(MCF-7)(HTB-22，ATCC)人体肝癌细胞(HepG2)(HB-8065，ATCC)正常猴肾细胞(VERO)(CCL-81，ATCC)培养液主要有两种培养液RPMI-1640(Sigma，R-6540)和DMEM(GIBCO，12100-046)。在使用之前加入10％胎牛血清(GIBCO，26140-079)，1％青霉素-链霉素(GIBCO，P0781)及0.1％两性霉素B(GIBCO，15290-018)。
培养条件与检测方法各组细胞(HL-60，K562，S180)培养72小时后，加入等量的0.4％台盼蓝(Trypan blue)进行染色，在显微镜下计数活细胞，从而计算出细胞生长抑制率。
在细胞(MCF-7，HepG2，VERO)培养72小时后，以噻唑蓝(MTT)比色法作为测定方法。MTT被加进细胞后会放置在保温箱5小时，然后倒去所有培养液(包括MTT)，再加入异丙醇作为溶液，待其完全溶解后在酶联反应仪上测量于570nm波长的吸光度值，从而计算出细胞生长抑制率。
流式细胞仪的分析方法2×105cells/ml浓度的细胞与200μg/ml的HWE1一同培养，并于24，48，72时后以流动细胞分析仪(Beckman Coutler，XL-MCL，USA)检测并且用Multicycle Analysis AV software(Phoenix Flow Systems，San Diego，USA)作出分析。
动物实验由中文大学实验动物中心提供7-8星期的雄性小白鼠(每一组均由十只白鼠组成)。0.2毫升的无菌HWE1(20mg/kg)连续十天注射进小鼠腹腔。在杀死小鼠并且切除其肿瘤后，已注射HWE1的小鼠组别与对照组之肿瘤的重量会作出比较，从而计算出HWE1对实体瘤的抑制比率。
统计学方法数据以平均值±标准差表示，利用组间t检验(t-test)分析组间差异。
B.结果体外活性实验表明，该多糖蛋白复合物对人体乳腺癌细胞(MCF-7)和HepG2肝癌细胞无抑制作用，对慢性白血病癌细胞(K562)显示一定的抑制作用，而对人体急性白血病细胞(HL-60)和实体瘤(Sarcoma S-180)显示完全抑制作用(见表2)，而且对正常猴肾细胞(Vero)的增殖无毒副作用。体内活性实验表明，该多糖蛋白复合物对植入雄性小白鼠(BALB/c)体内的实体瘤(Sarcoma S-180)的生长具有明显抑制作用(见表3)，同时对照组显示该多糖蛋白复合物无毒副作用。
表2 虎乳灵芝提取物HWE1在不同浓度条件下的体外抗肿瘤活性(抑制％)

*p值小于0.05，与对照组比较有明显差别；-检测不到活性流动细胞仪检测该多糖蛋白复合物体外对HL-60肿瘤细胞周期的影响，发现与肿瘤细胞作用24小时后，细胞的增殖开始在G1阶段被阻断，72小时后细胞死亡率达78％(见表5)。
体外活性可能是因为它阻断肿瘤细胞周期的G1阶段从而导致细胞的凋亡。上述水溶性多糖蛋白复合物HWE1可作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
SonE的体外抗肿瘤活性不明显，但是体内活性实验表明该提取物对植入雄性小白鼠(BALB/c)体内的实体瘤(Sarcoma S-180)的生长具有明显抑制作用(79.4％)，同时对照组显示该提取物无毒副作用(见表3)。
表3虎乳灵芝提取物的体内抗S180活性

HWE2的体外抗肿瘤活性不明显，但是体内活性实验表明该提取物对植入雄性小白鼠(BALB/c)体内的实体瘤(Sarcoma S-180)的生长具有一定的抑制作用(64.3％)，同时对照组显示该提取物无毒副作用(见表3)。
CAE的体外抗肿瘤活性不明显，但是体内活性实验表明该提取物对植入雄性小白鼠(BALB/C)体内的实体瘤(Sarcoma S-180)的生长具有一定的抑制作用(43.7％)，同时对照组显示该提取物无毒副作用(见表3)。
HAE的体外抗肿瘤活性不明显，但是体内活性实验表明该提取物对植入雄性小白鼠(BALB/c)体内的实体瘤(Sarcoma S-180)的生长具有较好的抑制作用(53.5％)，同时对照组显示该提取物无毒副作用(见表3)。
实施例6虎乳灵芝提取物免疫力系统调控的生物活性分析A.材料与方法动物7-8星期大的雄性小白鼠由香港中文大学实验中心提供(每一组均由十只小鼠组成)，而它们并未被植入实体瘤及未有被注射LPS。
给药方法5mg/kg或50mg/kg的HWE1会连续十天被注射进小鼠腹腔内。
检测方法血清从血液分离后，会采用细胞因子芯片测试内含细胞因子水平，及后再以ELISA作量化。另外，被注射HWE1小白鼠的脾脏重量会与对照组作出比较，从而检视免疫系统有否因HWE1而提升。
B.结果采用细胞因子芯片测试发现，接受该多糖蛋白复合物注射的小鼠体内血清中与对照组相比含有较高水平的细胞因子，如白细胞介素(interleukin)IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12和IL-13等，其中尤以IL-13的增加最为明显(见表4)。
接受该多糖蛋白复合物(HWE1)注射的小鼠体内脾脏重量与对照组相比有显著地增加(见表4)。因此，该多糖蛋白复合物的体内活性可能是因为它调节免疫系统促进细胞因子水平的提高和脾脏的增大。
表4 水溶性提取物HWE1腹腔注射给药后，BALB/c小鼠体内白细胞介素(IL-13)含量和脾脏重量的变化

*增加百分率的计算[(给药组-对照组)/对照组]×100％#用ELISA方法测28.5-251表示，给药组(剂量50mg/kg)中个体小鼠体内IL-13增加的百分含量最少28.5％，最多251％；同样，11.5-154表示剂量为(5mg/kg)的给药组中个体小鼠体内IL-13增加的百分含量最少11.5％，最多154％。
表5.HWE1与肿瘤细胞HL-60和K562分别作用24，48，72小时后，不同细胞周期的百分比

*表示，统计分析的结果显示于对照组有明显差别，p值小于0.05。
总的来说，虎乳灵芝这五种提取物无毒副作用，都具有较好的体内抗S180肿瘤活性。SonE，CAE，HAE，HWE2这四种提取物的体外抗肿瘤细胞株的活性不明显。只有HWE1同时具有非常显著的体内体外活性，成份分析表明HWE1是一种多糖蛋白复合物，它在体内可以增强免疫系统的功能，提高细胞因子IL-13表达水平和脾脏的增大；在体外可以阻断肿瘤细胞(HL-60)周期的G1阶段从而导致肿瘤细胞的凋亡。这些多糖提取物，尤其是HWE1，可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品。
应该理解，本发明的实施例仅是为了更好地理解本发明而对本发明做出的非限制性说明。本领域的技术人员在没有偏离本发明的精神和范围内可对本发明做出各种修改、替换和变更，这些修改、替换和变更仍属于本发明的保护范围。
参考文献[1]黄年来，食用菌学报，1999，6(1)30-32[2]Mosmann，T.(1983).细胞生长和活存的快速比色分析在增殖与细胞毒性分析中的应用(Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicity assay).J.Immunol.Methods.63，55-63. Wang，C.C.Huang，R.P.Lisoukov，H.Sommer，M.Huang，R.Lin，Y.andBurke，J.(2002).人细胞因子与趋化因子的阵列为寄基础的多元筛选与定量(Array-based multiplex screening and quantitation of human cytokines andchemokines).J.Proteome Res.1，337-343. Loken，M.R.and Stall，A.M.(1982).免疫学中流式细胞仪作为分析和制备的工具(Flow cytometry as an analytical and preparative tool in immunology).J.Immunol.Methods.50.R85-R112.
权利要求
1.虎乳灵芝提取物，含有占所述提取物55％-65％重量百分比的蛋白质。
2.如权利要求1所述的提取物，还含有占所述提取物45％-35％重量百分比的多糖。
3.如权利要求2所述的提取物，其中所述的多糖含有80-97％的葡萄糖。
4.如权利要求2所述的提取物，其中所述多糖含有80.5-85.5％重量百分比的葡萄糖，11-13％重量百分比的甘露糖，2.0-3.0％重量百分比的半乳糖，1.0-2.0％重量百分比的核糖，和0.5-1.5％重量百分比的鼠李糖。
5.如权利要求1-4中任一权利要求的虎乳灵芝提取物，其中所述提取物由下列方法制备，包括将虎乳灵芝与热水混合提取1-2小时；收集上清。
6.如权利要求5所述的提取物，其中所述虎乳灵芝与热水的比例为1∶25。
7.如权利要求5-6中任一权利要求所述的提取物，其中所述的热水的温度为95-100℃。
8.如权利要求5-7中任一权利要求所述的提取物，其中所述上清是通过离心方法获得的。
9.如权利要求8所述的提取物，其中所述的离心方法为9,000-10,000×g离心20-40分钟。
10.权利要求1-9中任一权利要求所述提取物的制备方法，包括将虎乳灵芝与热水混合提取1-2小时；收集上清。
11.虎乳灵芝提取物，含有占所述提取物95％以上重量百分比的多糖。
12.如权利要求11所述的提取物，其中所述多糖含有占所述多糖95％以上重量百分比的葡萄糖。
13.如权利要求11所述的提取物，其中所述多糖含有90-98％重量百分比的葡萄糖；和1-2％重量百分比的葡萄糖胺。
14.如权利要求11-13中任一权利要求所述的提取物，其中所述提取物是由以下方法制备的，包括将虎乳灵芝菌核粉末浸泡在碱溶液中24-48小时；进行超声处理；收集上清。
15.如权利要求14所述的提取物，其中所述方法还包括在所述超声处理之前用酸中和混合物。
16.如权利要求14或15所述的提取物，其中所述虎乳灵芝菌核粉末与所述碱溶液的重量体积比例为1∶20至1∶25。
17.如权利要求14-16任一权利要求所述的提取物，其中所述超声处理是在冰浴下搅拌进行的。
18.如权利要求14-17任一权利要求所述的提取物，其中所述超声处理进行20-30分钟。
19.如权利要求14所述的提取物，其中所述碱溶液为1M的氢氧化钠水溶液。
20.如权利要求15所述的提取物，其中所述酸为4M盐酸。
21.如权利要求14-20任一权利要求所述的提取物，其中所述上清是通过离心收集的。
22.如权利要求21所述的提取物，其中所述离心为9,000-10,000×g条件下离心20-40分钟。
23.如权利要求14-22中任一权利要求所述的提取物，还包括将所述上清中的盐去除。
24.权利要求13-23中任一权利要求所述的提取物的制备方法，包括将虎乳灵芝菌核粉末浸泡在碱溶液中24-48小时；进行超声处理；收集上清。
25.抗肿瘤细胞增殖的药物组合物或功能食品，其含有有效量的权利要求1-9或权利要求11-23中任一权利要求所述的虎乳灵芝提取物。
26.增强免疫功能的药物组合物或功能食品，其含有有效量的权利要求1-9或权利要求11-23中任一权利要求所述的虎乳灵芝提取物。
27.乳灵芝提取物在制备含有其抗肿瘤细胞增殖的药物组合物或功能食品中的用途，其中所述虎乳灵芝提取物选自权利要求1-9或权利要求11-23中任一权利要求所述的虎乳灵芝提取物。
28.虎乳灵芝提取物在制备含有其增强免疫功能的药物组合物或功能食品中的用途，其中所述虎乳灵芝提取物选自权利要求1-9或权利要求11-23中任一权利要求所述的虎乳灵芝提取物。
全文摘要
本发明公开了一种药用菇类－虎乳灵芝提取物的制备方法和其组成特征。这些提取物对癌细胞显示很强的抗增殖作用，可以调节免疫系统功能。本发明涉及的以上提取物的药学组合物在癌症预防和治疗方面很有效，也可以作为免疫增强剂使用。本发明还提供了一种以含有有效剂量的上述提取物为活性成分的功能食品。
文档编号A61P35/00GK1951403SQ200510114299
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者张志强, 黎建明, 张玫, 招志明, 黄荣春 申请人:香港中文大学