专利名称：用于控制球虫病的方法和组合物的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求于2001年7月27日提交的第60/308,215号美国临时申请的优先权。
背景技术：
本发明涉及用于控制动物球虫感染的方法和组合物。特别是，本发明涉及含有酵母细胞和酵母细胞壁的制剂在控制哺乳动物和鸟类动物的球虫感染中的应用。
球虫病是哺乳动物和鸟类动物的原生动物寄生性感染，其由艾美球虫属(Eimeria)球虫引起，并导致肠损伤、腹泻、肠炎和死亡。艾美球虫属(E.tenella、E.maxima、和E.acervulina)是困扰家禽产业的三种最常见的球虫。这些球虫种类在作用方式上不同。E.tenella攻击盲肠，而E.maxima和E.acervulina则分别攻击肠道的中部和上部。
球虫病在家畜生产中是一种影响经济效益的疾病，即使不甚严重的感染，也会导致饲料转化效率下降和重量增加的减少，在现代的集约式动物生产中也可以体现出利润与损失之间的差别。球虫感染已知是其它综合征，特别是坏死性肠炎(一种在肠的各种部位导致肠内层坏死的细菌感染)的先导因素。
由于它们异常的繁殖能力，以及由于在相当长的时间里为其提供了异常生存能力的其卵囊壁的组成，球虫生物体得以在环境中生存下来。卵囊通过粪便和褥草传播，但也可以以空气传播的方式传播，例如通过尘埃的运动，和通过载体生物如蚯蚓、甲虫、苍蝇、以及其它害虫来传播。因为，例如，将褥草再利用是家禽行业的惯常做法，所以先前受感染的畜群的褥草中的球虫就成为将来感染的来源。
常规消毒剂对于球虫来说是相对无效的。对于保持适当的卫生和减少暴露给动物和鸟的卵囊的数量，房舍的彻底清洁和严格的生物安全措施是必要的。遗憾的是，由于潜在的寄主动物较快的周转(例如，在烤子鸡经营中鸡群的快速更替)，卵囊的持久贮主经常就会保留下来。甚至少量的卵囊就能够在几周内引发大规模的感染。因此，保持适当的卫生以外的其它控制措施就很有必要。
目前已知的球虫控制方法包括使用抗球虫药物和接种疫苗。就其预期目的来说，抗球虫药通常是有效的；将其放入饲料或经由饮用水可以方便地提供给受治疗的动物。典型的药物包括离子载体(莫能星、拉沙洛西)和化学抗球虫剂。目前用于治疗/对照球虫的药物的突出缺点是，随着时间的过去，治疗的生物体对特定药物会变的具有耐药性。因此，不同的药物必须以轮流或交错的方式(往复方案)加以使用。即使在实行往复方案的情况下，在抗球虫药物改变的过程中，抗球虫感染的效果被打折扣也是可能的。另外，某些药物，虽然在控制球虫病中是有用的，但是为了确保与肉、乳和蛋的销售有关的安全问题，在屠宰或消费动物产品之前，需要预先将药物从受治疗的动物中退出。
就其预期目的来说，目前使用的抗球虫生物体疫苗由于在受治疗的动物中产生了抗感染的活性免疫因而通常是有效的。然而，疫苗非常昂贵，并且具有这样的缺点，即必须含有适宜的、对涉及致病作用的每一种类的球虫生物体激起保护性免疫反应的抗原。例如，在家禽中，这就可能是感染鸡的七种艾美球虫当中的一种或全部。此外，疫苗接种可能会引起各种严重的亚临床感染，并因此在那些接种疫苗的动物中对生产率产生负面影响。
因此，在本领域中，仍然需要控制家畜球虫感染的可供选择的方法，而这种方法的益处是具有改进的生产率和经济效果，并且不会导致生物体耐药性的发生和/或屠宰前需要长期的药物退出时间。
发明概述本发明提供了用于预防、减轻或改善包括猪和家禽在内的家畜的球虫感染的方法和组合物。所述组合物一般可以被描述为含有酵母细胞或酵母细胞壁的制剂。在一个实施方案中，本发明组合物包含得自酵母细胞壁的制剂，其中所述制剂包含大量甘露低聚糖(mannanoligosaccharide)类，例如甘露低聚糖。本发明方法包括将一定量的含有酵母细胞壁或含有酵母细胞的组合物喂给动物，以在被喂给所述组合物的动物中预防或减轻球虫感染，或一旦发生球虫感染改善球虫感染的有害作用。可以将甘露低聚糖和/或含有酵母细胞壁或含有酵母细胞的组合物混合到动物的饲料配给中，或可以将该组合物作为添加剂提供给动物。本发明组合物可以由可食用的酵母制备，所述酵母包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(或其它糖酵母属(Saccharomyces)酵母)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)或有孢圆酵母属(Torulaspora)。作为本发明的具体实例，得自酵母的制剂由啤酒糖酵母NCYC 1026的细胞制得。当含有酵母细胞或酵母细胞壁的组合物还含有抗球虫离子载体(例如莫能星或拉沙洛西)和/或甾类表面活性剂(例如皂苷元)时，就能够进一步增强预防、减轻或改善球虫感染的效果。
从下面说明和描述本发明优选实施方案的说明中，通过最适合实施本发明的方式的一个举例说明，对于本领域的技术人员来说，本发明的其它目的将会变的显而易见。正如可以认识到的，本发明可以具有其它不同的实施方案，并且，在不背离本发明的前提下，可对其若干细节在各种明显的方面加以修改。因此，本文的描述就性质上来说应当被看作说明性的而不是限制性的。
发明详述本发明提供了预防、减轻或改善动物球虫感染的新方法。特别是，本发明提供了预防或改善动物球虫感染的方法，包括将有效量的得自酵母的制剂喂给动物，所述制剂合乎需要地含有包括甘露低聚糖在内的酵母细胞壁材料。用于本发明组合物和方法的得自酵母细胞的制剂可用多种可食用的酵母细胞制备，所述酵母包括但不限于糖酵母属、假丝酵母属、克鲁维氏酵母属或有孢圆酵母属。在具体举例说明的实施方案中，所述酵母是啤酒糖酵母主NCYC 1026。该菌株保存在American Type Culture Collection，Manassas，VA(保藏号46785)和Agricultural Research Service，Peoria，IL(保藏号NRRLY-11875)中。作为具体实例，得自酵母细胞的组合物可以从Alllech，Inc.，Nicholasville，KY(BIO-MOS)购得。该组合物含有酵母细胞壁材料和由酵母产生的甘露低聚糖。
如本文所述的本发明组合物可以作为添加剂喂给动物或混合到市售的饲料中。本领域技术人员能够认识到，喂给动物的组合物的量随动物的种类、动物的年龄、动物的大小以及加入组合物的饲料的类型或根据作为单独营养添加剂的应用而变化。
本发明方法以及所描述的组合物适用于预防或改善任何动物，包括但不限于牛、猪、鸟类、马、绵羊、兔和山羊的球虫感染。不是所有的兽群或鸟群都会感染球虫，也不是在所有的农业环境都有球虫感染。可以喂给含有酵母细胞壁的组合物以预防、减轻或改善球虫感染的鸟类包括家禽、鸽子和宠物鸟(金刚鹦鹉、长尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、金丝雀、雀类、鹦鹉等)。饲养供产蛋、肉或娱乐的鸟包括但不限于鹌鹑、松鸡、野鸡、小鸡、鹅鸭子、火鸡等。哺乳动物也能够受益于得自酵母的添加剂中，特别是那些在农业上非常重要的动物，例如猪、牛、野牛、马、绵羊、山羊等。
临床上的免疫攻击研究包括用口服特定剂量的球虫使幼鸟感染，然后测定感染的水平、肠内组织的损害、死亡率以及感染对生产率的影响(重量增加饲料转化)。
如在下文实施例中所举例说明的那样，用得自酵母细胞的组合物，特别是如下文所述制得的含有酵母细胞壁和甘露低聚糖的组合物喂给鸟类动物，减轻了损害比率、感染对重量增加的消极影响以及肠损害的严重程度。这些实施例不应当被解释为对本发明范围的限制。当含有酵母细胞或含有酵母细胞壁的组合物还含有抗球虫的离子载体如莫能星或拉沙洛西和/或抗球虫甾类皂苷元(见例如EP 1,082,909)时，在抗球虫效果方面的性能就可以得到进一步的提高。
当使用时，缩写和术语被认为在本领域内是标准的，并且常用于专业杂志例如在本文中引用的杂志。
在不与本公开相矛盾的程度上，本申请引用的所有参考文献引入本文以作参考。
实施例实施例1用360只Cornish Rock雄性烤焙小鸡进行28天的试验，来研究两种含药物的饲料对E.tenella有害作用的抑制效果(见表I&II)。
给一天大小的小鸡喂含有莫能星(60g/kg)或含有酵母细胞壁/甘露低聚糖组合物(BIO-MOS，Alltech，Inc.，Nichola sville，KY)(1kg/顿)的标准玉米大豆饲料。试验组包括1)阴性对照组(未药物治疗，未攻击)；2)阳性对照组(未药物治疗，攻击)；3)莫能星治疗，攻击组和4)BIO-MOS-治疗，攻击组。在每个治疗组中，将小鸡随机分配到的三个同样的围栏中。在14天大时，通过用管饲给予的E.tenella(50,000个卵囊/小鸡)将小鸡感染。测定的反应变量包括所描述的每周的体重增加和盲肠损害得分(Johnson和Reid.1970“Anticoccidial DrugsLesion Scoring Technique in Batteryand Floor Pen Experiments with Chickens.”Exp.Parasitol.2830-36)。把围栏用作试验单位，通过使用LDS方法和常规线性模型方法(SAS Institute，1985，Cary，NC)来评估治疗差异。模型报告仅包括治疗效果。当观察到显著差异时(P＜0.05)，应用最小有效差异(LSD)法来测定治疗之间的差异。
给药莫能星和BIT-MOST都显著(P＜.05)减轻了如盲肠损害得分所表示的E.tenella感染的严重程度(表I)。相对于E.tenella-攻击对照，接受BIO-MOS的小鸡，其改善的健康状况在平均重量增加的改善中得到了反映(表II)。接受BIO-MOS的小鸡，其平均重量增加与在未攻击的(健康的)对照组所观察到的相似，并且比在未药物治疗的E.tenella-攻击组所观察到的高5％。在接受标准的莫能星治疗的小鸡中没有看到重量增加的类似改善。
实施例2用360只Cornish Rock雄性烤焙小鸡进行28天的试验，来研究两种含药物的饲料对E.maxima感染的抑制作用。将每个治疗组三十只一天大小的小鸡放在并列式笼子里，并喂给标准的大豆玉米食物，该食物包含莫能星(60g/kg)或含有酵母细胞壁材料和甘露低聚糖的市售得自酵母细胞的组合物(BIO-MOS)(1kg/吨)。四个试验组包括1)阴性对照组(未药物治疗，未攻击)；2)阳性对照组(未药物治疗，攻击)；3)莫能星治疗，攻击组，和4)BIO-MOS-治疗，攻击组。如实施例1所述，把小鸡分配到各个治疗组和同样的围栏中。
在14天大时，通过用管饲给予的E.maxima(50,000个卵囊/小鸡)将小鸡感染。测定的反应变量包括每周的体重增加和盲肠损害得分。如实施例1所述，将这样的测定进行方差条件。
莫能星和BIT-MOS治疗分别显著减轻了与E.maxima感染有关的盲肠损害得分。莫能星将平均盲肠损害减轻了21％，而BIO-MOS将平均盲肠损害减轻了28％(表III)。这些结果证实，BIO-MOS食物添加剂改善了由E.maxima感染引起的盲肠损害的严重程度。
BIO-MOS治疗的小鸡2-4周的平均体重增加是阳性对照(未药物治疗，攻击)小鸡平均体重增加的27％(表IV)，并且在克服与球虫攻击有关的生长抑制方面比莫能星更有效。因此，在有E.maxima攻击的情况下，喂给BIO-MOS的小鸡能够保持作为生产率指标的体重增加。
实施例3用360只Cornish Rock雄性烤焙小鸡进行28天的试验，来研究两种含药物的饲料对于E.acervulina感染的抑制效果。
给一天大小的小鸡喂含有沙利霉素(6mg/kg)或BIO-MOS(1千克/吨)的标准玉米大豆食物。四个试验组是1)阴性对照，未药物治疗，未攻击组；2)沙利霉素治疗，攻击组；3)BIO-MOS治疗，攻击组，和4)BIO-MOS治疗，未攻击组。在每个治疗组中，将小鸡随机分配到的三个同样的围栏中。在14天大时，通过用管饲给予的E.acervulina(500,000个卵囊/小鸡)将小鸡感染。测定的反应变量包括每周的体重增加和盲肠损害得分。如实施例1所述，使用常规线性模型方法(SAS Institute，Cary，NC)将数据进行ANOVA分析。
与沙利霉素一样，BIO-MOS显著减轻了如盲肠损害得分所表示的盲肠损害。BIO-MOS将损害严重程度减轻49％，而沙利霉素将损害严重程度减轻了57％(表V)。BIO-MOS治疗的小鸡的平均体重增加比阳性对照小鸡高12％(表VI)。结果证实，添加酵母细胞壁制剂可以用来保持用E.acervulina进行攻击的小鸡的生产率。
实施例4进行20-天的试验，来确定酵母细胞组合物在用形成孢子的艾美球虫属感染的烤焙型小鸡(Cobb)中的抗球虫活性。将160只小鸡(一天大小)放到并列式笼子中(每个笼子10只小鸡，459平方厘米/小鸡)。每个治疗组有四个同样的笼子。提供标准玉米大豆食物，和可自由获得的水。试验组如下1)阴性对照组(未药物治疗，未攻击)；2)阳性对照组(未药物治疗，攻击)；3)BIO-MOS，1kg/吨(攻击)组；和4)沙利霉素60g/吨(攻击)组。
在14天大时，通过管饲法分别口服给予含有50,000 E.acervulina、5,000 E.maxima或40,000 E.tenella卵囊的攻击接种液。在9、14和20天大时，测定体重和饲料的消耗量。感染后六天，将全部小鸡处死，并用上文Johnson和Reid(1970)的方法给损害评分。在肠的上部(E.acervulina)、中部(E.maxima)和盲肠(E.tenella)部位评估损害得分。
对于BIO-MOS治疗和沙利霉素治疗的小鸡，与两个对照组比较，在肠的上部和中部，盲肠损害得分分别显著地(P＜0.05)减小(表VII)。两个治疗组盲肠损害得分的减小显示，与未药物治疗的、攻击的对照组比较，BIO-MOS和沙利霉素都能够控制球虫攻击。
在攻击对照组中，攻击后的重量增加显著(P＜0.05)低于(18.48％)未攻击对照组(表VIII)。在接受BIO-MOS的小鸡中，观察到不太严重的重量减少(11.6％)。
当用艾美球虫属进行攻击时，BIO-MOS能够减轻损害得分并使攻击后的重量增加得到改善。这些发现支持了这样的结论，即在有球虫感染的情况下，BIO-MOS能够减轻感染的严重程度并提高生产率。
实施例5进行20天的试验，以确定BIO-MOS在用形成孢子的艾美球虫属进行攻击的烤焙型小鸡(Cobb)中的抗球虫活性。将160只小鸡(一天大小)放到并列式笼子中(每个笼子10只小鸡，459平方厘米/小鸡)。每个治疗组有四个同样的笼子。提供标准玉米大豆食物，和可自由获得的水。试验组如下1)阴性对照组(未药物治疗，未攻击)；2)阳性对照组(未药物治疗，攻击)；3)BIO-MOS，1kg/吨(攻击)组；和4)沙利霉素60g/吨(攻击)组。
在14天大时，通过管饲法分别口服给予含有50,000 E.acervulina、5,000 E.maxima或40,000 E.tenella卵囊的攻击接种液。在0、14和20天大时，测定体重和饲料的消耗量。
感染后六天，将全部小鸡处死，并用上文Johnson和Reid的方法给损害评分。在肠的上部(E.acervulina)、中部(E.maxima)和盲肠(E.tenella)部位评估损害得分。
与对照组比较，在肠的全部区域，BIO-MOS治疗和沙利霉素治疗组的损害得分显著减小(表IX)。BIO-MOS将损害减轻了33％。BIO-MOS也能够用于保持小鸡的生产率，这在与阳性对照(未药物治疗的、进行了攻击的)组相比，攻击后104％的重量增加上得到了反映。该攻击后的重量增加反映了在有艾美球虫属感染的情况下，小鸡生产率的改善。
实施例6进行三个42天的实验，以评估AVATEC(拉沙洛西、Alpharma、Fort Lee、NJ)—一种抗球虫的离子载体(90.7g/吨)；杆菌肽Zn(50g/吨)和BIO-MOS(0.5kg/吨)对在循环褥草上饲养的烤焙型小鸡生长的影响。将6 0只(一天大小)Cornish Rock雄性烤焙型小鸡放到四个试验组中(重复三次)，其包括1)对照(未药物治疗的小鸡)组；2)BIO-MOS治疗组，3)AVATEC治疗组，和4)杆菌肽ZN治疗组。将松木刨花用做试验的循环褥草，其中此前用E.tenella、E.maxima、和E.acervulina感染的烤焙型小鸡已经在该循环褥草上生长过。试验开始之前，把含有该循环褥草的围栏分配到四个治疗组，并将一天大小的小鸡放入其中，用此相同的循环褥草进行三个连续依次试验。
为了符合1994 National Research Counil的要求，食物主要由补充以必要的维生素和矿物质的玉米和大豆组成。每周测量体重。在全部三个试验中，喂给添加以BIO-MOS的小鸡的平均体重显著地高于对照组的小鸡(P＜0.05)，并与喂给杆菌肽和AVATEC(拉沙洛西)的小鸡的体重相差不大(表XI)。由于感染的原因，全部治疗的小鸡的平均体重的平均值，随着褥草再使用的每一个循环而减轻。然而，对于全部三个试验，接受BIO-MOS的小鸡的平均体重比对照组的平均体重平均高出7％，这说明BIO-MOS在有球虫攻击的情况下，能够保持生产率。
实施例7
把200只(一天大小)小鸡放在十个微生物隔离室中。在15天大时，将150只小鸡随机平均分配到10个微生物隔离室中。五个对照室中的小鸡接受未处理的引酵物饲料；治疗室中的小鸡接受添加了0.1％BIO-MOS的相同饲料。在22天时，全部小鸡通过管饲法口服接受2.9×105个E.acervulina卵囊。在每一个隔离室的花纹铁丝网地板下面收集小鸡的粪便，并从21至35天计数虫卵的数量。在第26、27和29天时，治疗的小鸡粪便中的虫卵数量较低(P＜0.05)，说明BIO MOS在感染的高峰时能够显著减少卵囊的数量。这反映了在家禽的生产系统，BIO-MOS能够减少E.acervulina的繁殖。
实施例8在本文所述的试验中，得自酵母的组合物是用啤酒糖酵母株NCYC1026(American Type Culture Coltection，Manassas，VA，保藏号46885；Agricultural Research Service，Peoria，IL，保藏号NRRL Y-11875)的细胞制备的。用本领域通常已知的方法获得酵母细胞壁提取物(见Pepper，H.J.1979。酵母的生产和酵母产品，157页微生物技术&微生物工艺，Vol.1(第2版)，Academic Press)。简单地说，酵母生物可以按照与食品有关的发酵和饮料工业中使用的普通技术进行生长。可以使用供快速繁殖酵母细胞用的复合培养基。很多普通的含糖培养基，例如稀糖蜜，也可以用于细胞生长。其它可以使用的培养基组分包括玉米、木糖、亚硫酸盐废液和乳清。然后，将酵母细胞，例如，用离心法从用尽的培养基中分离出来，洗涤并再次收集，生成“酵母乳油”。
分离后，将酵母乳油中的细胞裂解。本领域里的很多常用方法都可以用来裂解酵母生物体，包括自溶、水解或机械方法(冻结-融化、挤出或超声)。作为具体实例，将酵母细胞悬浮液用水稀释至浓度为10-12％干燥固体，然后加热至140°F。将pH值用例如氢氧化钠调整至大约8.5。在溶解期间，可加入蛋白酶如木瓜蛋白酶或多种碱性或中性蛋白酶，以便加速酵母蛋白在破碎的细胞材料中的溶解。在用蛋白酶初步培养通常大约2小时后，将pH值调至约8.0，并将混合物的温度缓慢地增加至大约158°F。将该混合物在158 °F保持30分钟。用离心法收集含有酵母细胞壁的颗粒材料，以除去低分子量的细胞内组分，并将细胞壁提取物浓缩。将所得浓缩物干燥(用多种本领域已知方法，包括喷雾干燥或转鼓式干燥)以形成吸湿性、水溶性的粉末。该干燥粉末可以以约0.5-约20kg/吨的比例直接加到动物饲料中。
前述实施例证明了本发明方法，即将得自酵母的组合物提供给具有感染球虫危险的动物，能够有效地减轻球虫感染的病害作用。在代表性的现代家畜生产条件下，本发明可有效地减轻由常见的球虫生物体引起的球虫感染有害作用。此外，本发明方法和组合物比得上或优于包括用莫能星和沙利霉素治疗的现有的控制球虫感染的方法。有利的是，本发明方法和组合物能够改善球虫感染的有害作用，并且没有产生耐药性球虫生物体的危险，也不会在受治疗动物的蛋、肉或乳品销售之前，需要一个长期的屠宰前的药物退出阶段。
前面所述的本发明优选实施方案，是出于举例说明和描述的目的，而非意图穷尽本发明或将本发明限制于所公开的确切形式。根据上面的讲授，明显的改变或变化是可能的。选择和描述实施方案是为了提供本发明原理的最好的举例说明和实际应用，以使本领域的普通技术人员能够将本发明应用于各种实施方案，并按照预期的具体应用而做各种改变。当按照公平、合理和合法的尺度理解时，所有这样的改变和变化都在权利要求书所确定的本发明范围内。
权利要求
1.在患有球虫感染或容易受到球虫感染的动物中预防或减轻球虫感染的方法，所述方法包括将有效预防或减轻球虫感染的量的包含酵母细胞壁的组合物喂给所述动物的步骤。
2.权利要求1的方法，其中在喂给所述动物之前，将所述组合物与饲料掺和在一起。
3.权利要求1的方法，其中将所述组合物作为饲料添加剂喂给动物。
4.权利要求1的方法，其中所述组合物含有至少一种由酵母产生的甘露低聚糖。
5.权利要求1的方法，其中将所述组合物配制成用于喂给牛、猪、鸟、马、羊、兔和山羊的形式。
6.权利要求1的方法，其中所述组合物得自选自酵母属、假丝酵母属、克鲁维氏酵母属和有孢圆酵母属的物种。
7.权利要求6的方法，其中所述组合物得自啤酒糖酵母。
8.权利要求7的方法，其中所述组合物得自啤酒糖酵母株NCYC1026。
9.权利要求1的方法，其中所述组合物含有干燥的酵母细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述组合物还含有甘露低聚糖。
11.权利要求5的方法，其中所述动物是猪或鸟类动物。
12.权利要求11的方法，其中所述鸟类动物是小鸡、火鸡、鸭子、鹅、野鸡、鹌鹑或宠物鸟。
13.权利要求1的方法，其中所述组合物还含有至少一种抗球虫的离子载体。
14.权利要求1的方法，其中所述还含有至少一种抗球虫的甾类皂苷元。
15.权利要求14的方法，其中所述组合物还含有至少一种抗球虫的甾类皂苷元。
16.权利要求1的方法，其中在喂给含有酵母细胞壁的组合物的步骤之前或之后，对动物进行监测以确定球虫感染的存在。
全文摘要
给容易受到球虫感染或感染了球虫的动物，特别是暴露于致病艾美球虫属的家禽喂以含有酵母细胞壁的组合物，包括含有甘露低聚糖的组合物，结果使得与未被喂给这样的组合物的动物相比，家畜的生产率和身体状况得到改善。
文档编号A61K31/715GK1607955SQ02818854
公开日2005年4月20日 申请日期2002年7月26日 优先权日2001年7月27日
发明者K·A·道森, A·E·塞夫顿 申请人:全技术公司