专利名称：一种脑蛋白水解物及其冻干粉针的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体的说，涉及一种脑蛋白水解物及其冻干粉针。
背景技术：
脑蛋白水解物是一种大脑所特有的肽能神经营养药物。能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。常见用于颉脑外伤、脑血管病后遗症伴有记忆减退及注意力集中障碍的症状改善。现有技术公开了多种脑蛋白水解物的制备方法及其制剂，如:中国专利ZLOl 130523.1公开了一种脑蛋白水解物注射液生产工艺，具体为:新鲜猪脑去除表面的粘膜及血溃等，加2倍体积的水匀浆，用双层纱布过滤，滤液先用胃蛋白酶水解，用盐酸调PH到1.5-1.6，水浴温度40-45°C，时间为6_8小时，再用氢氧化钠调PH到7.6-7.7，加胰酶(胰酶先溶解于0.02N的氯化钙溶液中于4°C下活化30分钟)水解，40-45°C水浴水解4-6小时，得到水解液，加盐酸调PH值2.5-3.0，-20 _10°C下静置10-30小时；在室温条件下，用双层纱布过滤，再加入1/2体积的水，加氢氧化钠调PH值到中性，用孔径为0.5-1.0um的微孔滤膜过滤澄清，取澄清液，依次用截流分子量为7万和I万的超滤膜超滤，得到的超滤液再用截流分子量为1000的超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液加热到100°C沸腾15分钟，然后迅速冷却到25°C以下，再依次经过0.5-lum孔径的微孔滤膜和截流分子量为7万和I万的超滤膜，得到的超滤液再经121°C蒸气灭菌30分钟得到的除菌溶液称为脑蛋白水解的混和多妝、氣基酸溶液精制品。中国专利ZL200610065169.0公开了一种脑蛋白水解物的生产方法，该方法包括如下步骤:(I)取经检验 合格的新鲜或冻存健康猪脑，用胶体磨匀浆，收集匀浆液；(2)将匀浆液分别用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，进行过滤，收集滤出液；(3)将滤出液用羟基磷灰石层析柱进行吸附分离纯化，调配肽图，收集目标物；(4)采用对分子截留为8KD的滤膜进行超滤，收集滤出液，进行定氮、氨基酸分析；(5)按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的编号为WS1-XG-25-2000药品标准计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓配液，0.22 μ m滤膜进行精过滤，即得注射用脑蛋白水解物的原液。中国专利ZL200410022091.5公开了一种脑蛋白水解物制剂的制备方法。具体用新鲜或冻存猪脑去除表面的包膜及血管，加I 2倍体积的纯化水匀浆，隔水蒸汽加热至80 85°C，15分钟，快速降温至40 45°C时，用盐酸调pH至1.5 2.0，用胃蛋白酶酶解3 12小时或沉淀分离取上清，调温至40 42°C后，用氢氧化纳调pH至7.7 8.0，用胰酶多酶在38 42°C条件下，酶解2 4小时，然后再用盐酸调pH值2.5 3.0，-20 -10°C下静置冷冻12 48小时；在室温条件下，过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为0.2
1.0um的微孔无机膜过滤澄清，取澄清液，用截流分子量为I万的超滤膜超滤，收集透过液，再用截流分子量为100 1000的纳滤膜进行纳滤浓缩，弃透过液，得到的浓缩液经121°C蒸汽灭菌30分钟，该除菌溶液为脑蛋白水解物精制品；调配L-色氨酸、L-酪氨酸，根据所需药液量，计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成半成品，再经115 121°C蒸汽灭菌30分钟，制成无菌制剂。虽然上述技术方案都能得到一种脑蛋白水解物及其制剂，但普遍存在提取率低，均质程度差的缺陷，间接影响了患者的用药安全，限制了其的推广应用。

发明内容
本发明第一目的在于提供一种脑蛋白水解物，该提取物采用特殊的方法制备得至IJ，该制备方法避免了高温对脑蛋白中有效成分的破坏，提高了脑蛋白水解物制剂的疗效。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种脑蛋白水解物，所述提取物采用如下方法制备而成:(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至5 10Pa，保持压力5 15min，后通入二氧化碳至压力为10 18MPa，保持压力20 25min ；(2)在转速300 500rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量5 8倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌20-60min，降温至-70 _80°C，保持2 4h,然后5 IOmin将温度升温至40 50°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中 加入2-4倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.5 1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30 40°C下水解3 4h，得酶解物；(4)将酶解物离心，取上清液，按上清液重量0.1-0.5%加入药用活性碳，室温下搅拌10_20min,用0.4 0.5 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.22 0.30 μ m微孔滤膜过滤即得。进一步地，本发明优选所述提取物采用如下方法制备而成:(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至8Pa，保持压力lOmin，后通入二氧化碳至压力为15MPa，保持压力22min ；(2)在转速400rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量6.5倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌40min，降温至_75°C，保持3h，然后8min内将温度匀速升温至45°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入3倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物；(4)将酶解物离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌15min，用0.25 μ m微孔滤膜过滤即得。其中，步骤(4)所述离心为转速2500rpm下离心20_30min,优选25min。本发明通过将新鲜脑组织先经二氧化碳饱和，后冻融、酶解处理，得到一种脑蛋白水解物。该提取方法能够避免高温提取对活性成分的破坏，采用温和简单的提取条件但同样能够使活性成分充分地提取处理，显著提高了现有方法的收率，同时降低了生产成本。此外，本发明所述的方法，除作出特别限定的外，都可以选择本领域常规技术手段来实现，如步骤I中的去脂匀质，步骤2和3中的搅拌，以及步骤4中的过滤等。任意能够实现相应目的的技术手段都可以用于实现本发明，具体选择为本领域技术人员所掌握。本发明第二目的在于提供含有上述脑蛋白水解物的冻干粉针。所述冻干粉针中脑蛋白水解物以总含氮量计，每支为20-80mg，优选每支为30mg或60mg。含氮量的测定采用现有技术公知的测定法。
本发明进一步提供了上述冻干制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤:
(I)在配液罐中加入60-70%的注射用水，加入处方量的脑蛋白水解物搅拌均匀；
(2)用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.2-7.35，补水至处方量；
(3)从稀配罐取样检测可见异物合格后，进行中间体检测:检测合格后，经双级0.22 μ m微孔滤膜过滤至灌装间待灌装；
(4)冷冻干燥，即得。
其中，所述注射用水的量为每1000瓶(30mg)2500ml或每1000瓶(60mg)5000ml。
其中，所述的冷冻干燥为:
(4.1)先将制品温度降至-45°C以下，保温3-5小时；
(4.2)加热板层，3-5小时内升温至-25°C，再6-9小时内升温至0°C，然后6_8小时升温至20°C，最后3-5小时内升温至40°C并保温4-16小时。
作为本发明的优选技术方案，所述的冷冻干燥为:
(4.1)先将制品温度降至-45°C以下，保温4小时；
(4.2)加热板层，4小时内匀速升温至_25°C，再8小时内匀速升温至0°C，然后7小时内匀速升温至20°C，最后4小时内匀速升温至40°C并保温6或12小时。
本发明所提供的脑蛋白水解物有效成分含量高，故治疗效果优于现有技术产品。同时，本发明提供了特殊的冻干工艺，使制备的冻干粉针具有显著优于现有技术的稳定性，进一步确保了用药安全。
具体实施方式
以下用实施例对本发明的技术方案作更详细的解释说明，但其并非是对本发明的限制。
实施例1脑蛋白水解物的制备
(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至8Pa，保持压力lOmin，后通入二氧化碳至压力为15MPa，保持压力22min ；
(2)在转速400rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量6.5倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌40min，降温至_75°C，保持3h，然后8min内将温度匀速升温至45°C，将二氧化碳气化；
(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入3倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物；
(4)将酶解物离心，转速2500rpm下离心25min，取上清液，按上清液重量0.3%加入药用活性碳，室温下搅拌15min，用0.45 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.25 μ m微孔滤膜过滤即得。
实施例2脑蛋白水解物的制备
(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至5Pa，保持压力15min，后通入二氧化碳至压力为IOMPa,保持压力25min ；
(2)在转速300rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量5倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌60min，降温至_70°C，保持2h，然后5min将温度升温至50°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入2倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.5%的木瓜蛋白酶，40°C下水解3h，得酶解物；(4)将酶解物离心，转速2500rpm下离心26min取上清液，按上清液重量0.1%加入药用活性碳，室温下搅拌20min，用0.4 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.22 μ m微孔滤膜过滤即得。实施例3脑蛋白水解物的制备(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至10Pa，保持压力5min，后通入二氧化碳至压力为18MPa,保持压力20min ；(2)在转速500rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量8倍的液体二氧化碳中，加 毕，搅拌20min，降温至_80°C，保持4h，然后IOmin将温度升温至40°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入4倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量1%的胃蛋白酶，30°C下水解4h，得酶解物；(4)将酶解物离心，转速2500rpm下离心25min取上清液，按上清液重量0.5%加入药用活性碳，室温下搅拌lOmin，用0.5 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.30 μ m微孔滤膜过滤即得。实施例4脑蛋白水解物的制备(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至8Pa，保持压力8min，后通入二氧化碳至压力为12MPa，保持压力24min ；(2)在转速350rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量6倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌50min，降温至-72°C，保持3h，然后6min将温度升温至40°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入3倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.6%的木瓜蛋白酶，32°C下水解4h，得酶解物；(4)将酶解物离心，转速2500rpm下离心20min取上清液，按上清液重量0.4%加入药用活性碳，室温下搅拌12min，用0.45 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.22 μ m微孔滤膜过滤即得。实施例5脑蛋白水解物的制备(I)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至6Pa，保持压力15min，后通入二氧化碳至压力为16MPa，保持压力22min ；(2)在转速380rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量6倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌28min，降温至_72°C，保持3h，然后7min将温度升温至48°C，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入2倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.5%的胃蛋白酶，36°C下水解4h，得酶解物；(4)将酶解物离心，转速2500rpm下离心30min取上清液，按上清液重量0.3%加入药用活性碳，室温下搅拌16min，用0.4 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.28 μ m微孔滤膜过滤即得。本发明进一步提供以上述脑蛋白水解物为活性成分制备的冻干粉针，所述冻干粉
针的处方为:
权利要求
1.一种脑蛋白水解物，其特征在于，所述提取物采用如下方法制备而成: (1)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至5 lOPa，保持压力5 15min，后通入二氧化碳至压力为10 18MPa，保持压力20 25min ； (2)在转速300 500rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量5 8倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌20-60min，降温至-70 _80°C，保持2 4h，然后5 IOmin将温度升温至40 50°C，将二氧化碳气化； (3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入2-4倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.5 1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30 40°C下水解3 4h，得酶解物； (4)将酶解物离心，取上清液，按上清液重量0.1-0.5%加入药用活性碳，室温下搅拌10_20min,用0.4 0.5 μ m微孔滤膜过滤除碳,再用0.22 0.30 μ m微孔滤膜过滤即得。
2.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物，其特征在于，所述提取物采用如下方法制备而成: (1)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至8Pa，保持压力lOmin，后通入二氧化碳至压力为15MPa，保持压力22min ； (2)在转速400rpm下，将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量6.5倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌40min，降温至_75°C，保持3h，然后8min内将温度匀速升温至45°C，将二氧化碳气化； (3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入3倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物； (4)将酶解物离心，取上 清液，按上清液重量0.3%加入药用活性碳，室温下搅拌15min，用0.45 μ m微孔滤膜过滤除碳，再用0.25 μ m微孔滤膜过滤即得。
3.根据权利要求1或2所述的脑蛋白水解物，其特征在于，步骤(4)所述离心为转速2500rpm 下离心 20_30min。
4.含有权利要求1 3任意一项所述脑蛋白水解物的冻干粉针。
5.根据权利要求4所述的冻干粉针，其特征在于:所述冻干粉针中脑蛋白水解物以以总含氮量计，每支为20-80mg。
6.根据权利要求4所述的冻干粉针，其特征在于:所述冻干粉针中脑蛋白水解物以以总含氮量计，每支为30mg或60mg。
7.权利要求4所述冻干粉针的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)在配液罐中加入60-70%的注射用水，加入处方量的脑蛋白水解物搅拌均匀； (2)用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.2-7.35，补水至处方量； (3)从稀配罐取样检测可见异物合格后，进行中间体检测:检测合格后，经双级0.22 μ m微孔滤膜过滤至灌装间待灌装； (4)冷冻干燥，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述的冷冻干燥为: (4.1)先将制品温度降至-45°C以下，保温3-5小时； (4.2)加热板层，3-5小时内升温至-25°C，再6-9小时内升温至0°C，然后6_8小时升温至20°C，最后3-5小时内升温至40°C并保温4-16小时。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于:所述的冷冻干燥为:(4.1)先将制品温度降至_45°C以下，保温4小时； (4.2)加热板层，4小时内匀速升温至-25°C，再8小时内匀速升温至0°C，然后7小时内匀速 升温至20°C，最后4小时内匀速升温至40°C并保温6或12小时。
全文摘要
本发明公开了一种脑蛋白水解物及其制备方法，所述提取物采用如下方法制备而成(1)取新鲜健康猪脑，去除脂肪，匀浆，然后抽真空至5～10Pa，保持压力5～15min，后通入二氧化碳至压力为10～18MPa，保持压力20～25min；(2)将二氧化碳饱和的去脂脑浆缓慢加入到体积为去脂脑浆重量5～8倍的液体二氧化碳中，加毕，搅拌0.5-2h，降温至-70～-80℃，保持2～4h，然后5～10min将温度升温至40～50℃，将二氧化碳气化；(3)向步骤2得到的冻融脑浆中加入2-4倍重量的注射用水，搅拌均匀，再加入相当于冻融脑浆重量0.5～1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30～40℃下水解3～4h，得酶解物；(4)将酶解物离心，取上清液，活性炭吸附，脱碳，过滤即得。
文档编号A61P25/28GK103142991SQ201310102329
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者李立忠, 王勇, 解晓荣, 李润宝, 苏志强, 姚荷云, 闫洁, 胡成伟 申请人:山西普德药业股份有限公司