专利名称：新型血吸虫疫苗肽的制作方法
技术领域：
本发明属于有机化合物。
血吸虫病在世界范围内严重危害人类健康，控制疾病流行的重要策略之一是研制有效的抗血吸虫病疫苗。为了解决传统照射减弱活疫苗制备中虫体来源困难以及保证疫苗的安全性、避免致病性，目前人们正积极致力于分子疫苗的研究，如基因上程疫苗、合成多肽疫苗的研究。其中，合成多肽疫苗的意义在于用含蛋白质抗原表位的多肽片段代替整个蛋白质作疫苗抗原，可以避免使用母体蛋白引起的副作用，且可以用化学方法大量合成，易于制得化学纯，接种量小，无灭活不完全造成的致病危险，有实际应用前景。
然而，合成多肽一般是小分子半抗原，在体内易被迅速降解、排泄，传统的解决方法是将多肽与蛋白质载体偶联形成多肽-载体复合物。本发明的目的在于用J.P.Tam新近提出的多抗原肽(multiple antigen peptide,MAP)概念制备含血吸虫抗原肽的MAP化合物作为血吸虫病疫苗抗原。其优点在于可以将两种不同的抗原肽结合在同-疫苗分子中，产生协同效应，所合成的新型多抗原肽疫苗能够诱导实验动物产生显著抵抗血吸虫感染的保护性免疫力，同时避免了使用在体内引起毒副作用的蛋白质载体，因而能够用于人类临床，且具有确定的化学结构，性质稳定，便于贮存、运输和发放。
本发明所涉及的有机化合物-多抗原肽，由多个血吸虫抗原肽和作为核心基质的寡聚赖氨酸组成，即n级聚合的核心基质由2n-1个赖氨酸组成，可连接2n个多肽片段，其特征在于化学结构如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A为H或RCO-形式的基团，在这里，R是H或C1-5烷基。
Ag和Ag′分别是下列两种不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一个从1至10的整数，最好是2或3。
B可以是天然氨基酸残基，或D-构型的氨基酸残基，最好是-Gly,-Ala-，或-β-Ala-。
X可以是NHR或OR，在这里，R是H或C1-5烷基。
本发明涉及的多抗原肽及其与免疫佐剂形成的复合物，在体外活性检测和动物实验中，表明均有有价值的生物活性。特别是在抗血吸虫病方面，能够诱导昆明小鼠和BALB/C小鼠产生抵抗血吸虫感染的保护性免疫力。如用(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH和(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH免疫昆明小鼠，以血吸虫正常尾蚴攻击感染，与对照组相比，减虫率分别为40.1％和34.4％；减卵率分别为48.4％和47.4％。用(P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH和(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH免疫BALB/C小鼠，减虫率分别为73.6％,68.4％,47.9％和32.6％；减卵率则分别为75.9％,66.7％,45.4％和38.7％。
本发明涉及的多抗原肽可以用已知的固相多肽合成法来合成，如下述实施例。
实施例1(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH的制备称150mgt-Boc-Gly-OCH2-Pam树脂(0.34mol/lg resin)，置多肽合成反应器中，加入二氯甲烷充分溶胀。用50％TFA/DCM脱去t-Boc保护基后，再用10％DIPEA/DCM中和。以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入相当于树脂氨基当量3倍的Nα,Nε-di-t-Boc-赖氨酸二环己基胺盐，以BOP试剂为偶联剂，上接第一级赖氨酸，得到[Boc-Lys(Boc)]-Gly-OCH2-Pam树脂。用同样的方法接上第二级赖氮酸，得到[Boc-Lys(Boc)]2Lys-Gly-OCH2-Pam树脂。第三级赖氨酸的α和ε-氨基分别用对酸稳定的Fmoc和对碱稳定的t-Boc选择性地保护，得到四个Boc和四个Fmoc保护的末端氨基。TFA脱去t-Boc保护基后在4个ε-NH2上用下述的Boc化学依次接上第一种抗原肽的氨基酸。
Boc-氨基酸的侧链保护基为Glu(OBzl),Lys(2-Cl-Cbz),Ser(Bzl),Thr(Bzl)。重复如下步骤直至完成全部肽链的合成(1)在盛Boc保护寡聚赖氨酸-树脂的反应器中加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)洗涤2分钟；(2)加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)反应20分钟，脱去t-Boc保护基；(3)DCM洗涤，1min/次×3；(4)MeOH洗涤，1min/次×3；(5)10％DIPEA/DCM中和，2min/次×2；(6)DCM洗涤，1min/次×6，抽干；(7)称取相当于树脂氨基当量3倍的保护氨基酸、DCC和HOBt加入反应器中，以DMF作溶剂，室温振摇反应；(8)DCM洗涤，1min/次×3；(9)MeOH洗涤，1min/次×3；(10)DMF洗涤，1min/次×3；(11)MeOH洗涤，1min/次×3；(12)DCM洗涤，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法检测偶联反应完成情况，若阴性，接下一个氨基酸；若阳性，则重复7～13步，直至检测结果为阴性。
在t-Boc-氨基酸肽链合成结束后，用哌啶脱去赖氨酸α-NH2上的Fmoc保护基，再用Fmoc保护氨基酸逐步合成第二种抗原肽。Fmoc-氨基酸的侧链保护基为Arg(Tos),Asp(O-t-Bu),Glu(O-t-Bu),Lys(t-Boc),Ser(t-Bu),Thr(t-Bu)。Fmc-氨基酸肽链的合成步骤如下(1)DMF洗涤，1min/次×3；(2)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)洗涤1min；(3)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脱保护，20分钟；(4)DOM洗涤，1min/次×3；(5)MeOH洗涤，1min/次×3；(6)DMF洗涤，1min/次×3，抽干；(7)称取相当于树脂氨基当量3倍的Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt加入反应器中，以DMF作溶剂，室温振摇反应；(8)DMF洗涤，1min/次×3；(9)MeOH洗涤，1min/次×3；(10)DCM洗涤，1min/次×3；(11)DMF洗涤，1min/次×3；(12)DCM洗涤，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法检测偶联反应完成情况，若阴性，接下一个氨基酸；若阳性，则重复7～13步，直至检测结果为阴性。
Fmoc-氨基酸肽链合成结束后，用哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脱去Nα-Fmoc保护基，再用TFA/DCM(1∶1,Vol/Vol)脱去Nα-Boc保护基。low-high HF法脱去侧链保护基并切下树脂，肽-树脂混合物用10％醋酸溶液抽提，冷冻干燥得粗品肽，经SephadexG-50凝胶渗透色谱法分批纯化，冻干得白色粉末状固体295mg，收率44.2％,[α]D23=-74.2°(C=0.07,H2O)，产品肽的结构由氨基酸组成分析确定。
下列多抗原肽也可以用实施例1中给出的相似方法来合成实施例2 (P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.2°(C=0.085,H2O)实施例3 (P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-54.5°(C=0.14,H2O)实施例4 (P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.8°(C=0.055,H2O)实施例5 (P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-72.7°(C=0.055,H2O)实施例6 (P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-70.5°(C=0.095,H2O)缩略语表Ag antigen 抗原Alaalanine 丙氨酸Argarginine 精氨酸Ashasparagine 天冬酰胺Aspaspartic acid 天冬氨酸t-BOC t-butyloxycarbonyl 叔丁氧羰基t-Bu t-butyl 叔丁基BOPbenzotriazolyl-1-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
Bzlbenzyl 苄基Cbzbenzyloxycarbonyl 苄氧羰基DCCdicyclohexylcarbodiimide 二环己基碳二亚胺DCMdichloromethane 二氯甲烷DIPEA diisopropylethylamine 二异丙基乙基胺DMFdimethylformamide 二甲基甲酰胺Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 9-芴甲氧羰基Glyglycine 甘氨酸Gluglutamie acid 谷氨酸Glnglutamine 谷氨酰胺HOBt 1-hydroxybenzotriazole 1-羟基苯并三氮唑Ileisoleucine 异亮氨酸Lleleucine 亮氨酸Lyslysine 赖氨酸MAPmultiple antigen peptide 多抗原肽Pam resin phenylacetamidomethyl resin Pam树脂Phephenylalanine 苯丙氨酸Proproline 脯氨酸Serserine 丝氨酸TFAtrifluoroacetic acid 三氟乙酸Thrthreonine 苏氨酸Trptryptophan 色氨酸Tostosyl 对甲苯磺酰基Tyrtyrosinc 酪氨酸Vlavaline 缬氨酸
权利要求
1．本发明涉及一种有机化合物-多抗原肽，由多个血吸虫抗原肽和作为核心基质的寡聚赖氨酸组成，其特征在于化学结构如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A为H或RCO-形式的基团，在这里，R是H或C1-5烷基。Ag和Ag′可以分别是下列多肽中的两种不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe--Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys-Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一个从1至10的整数，最好是2或3。B可以是天然的氨基酸残基，也可以是D-构型的氨基酸残基，最好是-Gly,-Ala-,-β-Ala-。X可以是NHR或OR，在这里，R是H或C1-5烷基。
2．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于A是氢。
3．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于n是2或3。
4．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于B是-Gly-。
5．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于X是OR，在这里R是H。
6．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P1,Ag′可以是P2，或P3，或P4。
7．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P2,Ag′可以是P3。
8．如权利要求1中所述的化合物，其特征在于见下式(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(p)4Lys4Lys2LysGly-OH(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH
9．权利要求1-8中要求保护的多抗原肽，用作治疗血吸虫病的药物，或用其制成的抗血吸虫病的疫苗类药物。
全文摘要
本发明属于有机化合物。具有下列结构的多抗原肽;(A－Ag)
文档编号A61P33/00GK1235164SQ98101840
公开日1999年11月17日 申请日期1998年5月8日 优先权日1998年5月8日
发明者蔡孟深, 曹胜利, 秦致辉, 石佑恩, 王述恒 申请人:北京医科大学