专利名称：一类荧光分子影像探针与磁/荧光双模态分子影像探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一类荧光分子影像探针与磁/荧光双模态分子影像探针及其制备方法。
背景技术：
分子影像技术可以在分子水平上实现生物有机体生理和病理变化的在体、实时、 动态、无创的三维成像，融合不同影像的双、多模态技术，可实现不同影像设备的优势互补， 从而减少假阳性和假阴性，使获取的诊断结果更为精准。多模态分子探针的构筑则是有效提高成像质量及肿瘤诊断准确率的重要途径。双、多模态融合已成为生物医学成像的发展趋势，多模态分子探针的介入使得分子影像从一项技术演变为一门新的学科，并逐渐在疾病的治疗、诊断及监测等方面发挥重要作用。磁共振成像(MRI)技术因具有无创伤、高组织分辨率等优点已成为临床医疗中诊断肿瘤最为有效的方法之一，但其敏感性较低。为了增强病变组织与正常组织图像之间的对比度和清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。这些造影增强剂绝大多数是利用金属离子的顺磁特性。钆(Gd3+)因为具有强顺磁性，它的络合物是目前应用最广泛和最有效的一类造影增强剂。钆内嵌金属富勒烯水溶性衍生物，以其高效低毒的特性，迅速成为新型造影剂的研究热点，如GdOC82 (OH) 40的MRI造影效率是临床所用Gd-DTPA二乙烯三胺五醋酸，DTPA螯合物造影剂的 20 倍(Mikawa, Μ.，et al.，Bioconjugate Chemistry, 2001. 12(4) :p. 510-514)。然而，传统修饰方法得到的内嵌金属富勒烯造影剂和其它MRI造影剂均为原生单模态造影剂，需要通过进一步被发光基团或核素修饰才能得到结合磁/荧光或磁/PET等双模态分子影像探针实现多重检测。

发明内容
本发明的目的在于提供基于碳纳米材料的单模态(荧光)分子影像探针、双模态 (磁/荧光)一体化分子影像探针及其制备方法。本发明所提供分子影像探针是按照包括下述步骤的方法制备得到的将碳纳米材料加入过氧化氢与氨水的混合溶液中进行反应，得到含荧光分子影像探针的溶液；其中，所述碳纳米材料选自下述任意一种内嵌金属富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。内嵌金属富勒是指富勒烯的碳笼内能够包入各种不同的金属或金属原子簇，形成一类具有特殊结构和性质的化合物，通常使用MOCai形式来表示内嵌金属富勒烯的结构；其中励C82、A3NiC80或M2OC8tl型具有较高的产量。本发明中所述内嵌金属富勒烯具体可为Gd@C82、LuiC82, YiC82, Gd3NiC80, Y3NiC80, Lu3NiC80, Gd2iC80, Lu#C8Q、Y2iC80O 所述空心富勒烯具体可为 C6tl 或 C7Q。上述方法中，当碳纳米材料为具有顺磁性的钆或镥内嵌金属富勒烯时，可得到磁/ 荧光双模态分子影像探针。
上述方法中，所述反应需在搅拌条件下进行，所述反应的反应温度为45_90°C，反应时间为2-16小时。上述方法中，所述过氧化氢与氨水的混合溶液中过氧化氢的质量浓度为 70% -80%，氨水的质量浓度为20-30% ；所述碳纳米材料与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为(5-100)mg (10-40)mL。该混合溶液具体可由质量浓度30%的过氧化氢溶液和质量浓度的氨水按照体积比7 3混合得到的。当碳纳米材料为内嵌金属富勒烯(如GdOC82)时，所述反应的反应温度为45-55°C、 时间2-3小时，所述内嵌金属富勒烯与上述混合溶液的配比为(3-5)mg 20mL。当碳纳米材料为空心富勒烯时，所述反应的反应温度为55_65°C、时间10-12小时，所述空心富勒烯与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为IOOmg (70-80)mL ；当碳纳米材料为氧化石墨烯时，所述反应的反应温度为80_90°C、时间12-16小时，所述氧化石墨烯与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为5mg (20-40)mL。本发明所述方法还包括下述步骤将所述含荧光分子影像探针的溶液离心，除去不溶物，再浓缩至至l_2mL，得到浓缩液；向所述浓缩液中加入乙醇并振荡，生成大量沉淀， 收集沉淀并用乙醇冲洗，然后干燥，得到所述荧光分子影像探针。所述方法还进一步包括对所述荧光分子影像探针进行纯化的步骤，具体方法如下将所述荧光分子影像探针溶于水中，过滤收集滤液，将滤液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子杂质，透析后将溶液使用200nm微孔滤膜过滤，将滤液浓缩蒸干得到纯化的荧光分子影像探针。以金属富勒烯GdOC82为例，它与30 %过氧化氢和观%氨水混合溶液作用发生氧化反应得到笼外修饰羟基与氨基的金属富勒烯水溶性衍生物，该分子影像探针的分子表达式为Gd@C820 14(OH) 14(NH2) 6。本发明所使用原料金属富勒烯GdOC82是用高效液相色谱结合富勒烯/内嵌金属富勒烯专用色谱柱Buckypr印/Buckypr印-M纯化得到的，用一步反应法即可制备得到双模态一体化分子影像探针。本发明的优点在于制备的双模态分子影像探针(GdOC82O^14(OH) 14(NH2) 6。)同时具有良好的弛豫性能及宽激发波长的荧光特性，无需进一步修饰就可以方便的用于磁共振成像以及荧光成像的多重检测；另一优点在于表面修饰的氨基残基便于进一步与生物配体偶联，使之具有一定的组织靶向性。与其它现有技术比较，本发明具有以下特点1、本发明制备的GdOC82O14(OH)14(NH2)6具有荧光/磁共振成像双模态一体化分子影像探针特性，是一种原生的双模态分子影像探针。2、本发明不需有机溶剂的介入，无需分离中间产物，无需无水无氧等条件，具有制备方法简单经济、绿色环保等优点。3、本发明巧妙利用过氧化氢的氧化性与氨的亲核性，经过一步反应大量制得具有荧光特性的GdOC82的衍生物。该方法同样适用于C6(1、CTO等空心富勒烯，Y3N@C8(1、Lu3N@C8(1等内嵌富勒烯和氧化石墨烯，因而具有一定普适性和便于实现规模化生产等优点。4、本发明制备的Gd@C820 14(0H) ^14(NH2) 6双模态一体化分子影像探针具有粒径分布小、窄等特点。5、本发明制备的双模态一体化分子影像探针其MRI造影效率是现临床所用 Gd-DTPA的近10倍，可以在较低剂量下实现较高的影像对比度。6、本发明中合成的双模态一体化分子影像探针，由于碳笼的存在，有效地防止了有毒的Gd3+离子的泄露和外来物质的进攻，从而大大降低了其毒性。7、本发明制备的双模态一体化分子影像探针具有宽激发波长的荧光特性，可以方便的进行细胞吸收、定位观测。8、本发明制备的双模态一体化分子影像探针，表面修饰的氨基残基便于进一步与生物配体偶联，使之具有一定的组织靶向性。


图1为本发明提供的基于金属富勒烯GdOC82的双模态(磁/荧光)分子影像探针的制备流程图。图2为实施例1制备的双模态金属富勒烯GdOC82衍生物的平均水合半径。图3为实施例1制备的双模态金属富勒烯GdOC82衍生物在水与生理盐水中，在 0. 5T磁场下用反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/ \对不同Gd浓度作图。图4为实施例1制备的双模态金属富勒烯GdOC82衍生物在0. 5Τ与7. IT磁场下， 在水中用反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/ \对不同Gd浓度作图。图5为对照例IGd-DTPA在0. 5Τ磁场下用反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/ \对不同Gd浓度作图。图6为实施例1中制备的GdOC8UOH) 14(NH2) 6在0. 054mM、0. 138mM和对照例1中的临床使用造影剂Gd-DTPA在0. 5mM下和纯水的体外T1加权像对比图(0. 5T自旋-回波序列 TE/TE = 300ms/15ms，T = 27 °C )。图7为实施例1制备的GdOC82O^14(OH) ^14(NH2) ^6中不同价态的Cls键合能实验曲线和拟合曲线。图8为实施例1制备的GdOC82O^14(OH) ^14(NH2) ^6中不同价态的Nls键合能实验曲线和拟合曲线。图9为实施例1制备的GdOC82O 14(OH) ^14(NH2) ^6的紫外-可见吸收谱图。图10为实施例1制备的Gd@C820 14(OH) 14(NH2) 6的荧光光谱发射峰图(激发波长 370-490nm，步长=20nm)。图11实施例2产物的荧光光谱发射峰图(激发波长350-470nm，步长=20nm)图12实施例3产物的荧光光谱发射峰图(激发波长400-500nm，步长=20nm)图13为实施例1制备的GdOC82O^14(OH) 14(NH2) 6在自然光和365nm紫外光下的照片。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
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对照例1作为对照，以临床使用的钆喷酸葡胺注射液，商品名为马根维显(Gd-DTPA， Magnevist)(德国先灵公司生产，先灵药业有限公司分包装。进口药品注册证号 H20030138，批准文号国药准字J2003006》，分别配制一系列浓度的水溶液，用翻转-恢复序列在0. 5T磁场条件下测得纵向弛豫时间T1，而后用其倒数对浓度作图(见图幻，得到表征其水质子弛豫率大小的重要参数A值为4. SmT1s-1。实施例1、制备基于金属富勒烯GdOC82的双模态(磁/荧光)一体化分子影像探针(a)内嵌金属富勒烯GdiC82可按如下参考文献制备=Shu, C. Y.，et al.，Carbon, 2006. 44 (3) :p. 496-500. Cagle. D. W.，PNAS, 1999. 96 :ρ· 5182-5187。具体如下通过直流电弧放电法制备含有金属富勒烯GdOC82的灰炱，用甲苯 (DMF或邻二氯苯)提取结合高效液相色谱(使用富勒烯/内嵌金属富勒烯专用色谱柱 Buckypr印/Buckypr印-M)分离提纯得到高纯度的金属富勒烯GdOC82的甲苯溶液，蒸干得到黑色固体(A)。(b)配制20mL质量浓度30%过氧化氢溶液与质量浓度氨水的混合溶液(Va
氧化s · V氨水=7 · 3) (B)。(c)将!BrngA加入B中，在50°C下剧烈搅拌3h，A逐渐溶解生成亮黄色溶液C。(d)将C溶液离心，除去不溶物，再减压蒸馏浓缩至lmL，得到黄色浓溶液；加入 IOmL乙醇并振荡，迅速生成大量黄色沉淀，离心后收集固体并用乙醇反复冲洗几次，以除去过量氨水与过氧化氢，然后蒸干、真空干燥，得到橙色固体。(e)向橙色固体中加入IOmL高纯水溶解并过滤，滤液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子杂质，透析后将溶液使用200nm微孔滤膜过滤，将滤液浓缩蒸干得到亮黄色固体即为基于金属富勒烯GdOC82的双模态(磁/荧光)一体化分子影像探针。由图2可知，其平均水合半径为15. 69nm。由图3得到，在0.5T场强下，新制备的双模态(磁/荧光)一体化分子影像探针的纵向弛豫率T1为47. ImT1iT1,且在生理盐水(巧为45. OmT1iT1)也没有明显下降。图4可知在高场强(7.1T)下分子影像探针的纵向弛豫率。有一定下降。由图3和图5得到的纵向弛豫率巧比较可知，本发明制备的分子影像探针的造影效率是临床使用Gd-DTPA的10倍以上。图6说明该物质的造影效果明显优于临床所用的Gd-DTPA，即使在低浓度下 (0. 054mM)成像效果依然明显。由图7可知
权利要求
1.一种制备荧光分子影像探针的方法，包括下述步骤将碳纳米材料加入过氧化氢与氨水的混合溶液中进行反应，得到含荧光双模态分子影像探针的溶液；其中，所述碳纳米材料选自下述任意一种内嵌金属富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述内嵌金属富勒烯选自下述至少一种 GdiC82, LuOC82、YOC82、Gd3N@C8Q、Y3NiC80, Lu3N@C8(1、Gd2@C8(1、Lu2@C8(1、Y2iC80 ；所述空心富勒烯为 C60 或 C70。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述内嵌金属富勒烯选自下述至少一种 GdiC82,LuiC82,Gd3NiC80,Lu3NiC80,Gd2iC80 和 Lu2@C8(1，所述荧光分子影像探针为磁 / 荧光双模态分子影像探针。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述反应在搅拌条件下进行， 所述反应的反应温度为45-90°C，反应时间为2-16小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于所述过氧化氢与氨水的混合溶液中过氧化氢的质量浓度为70% _80%，氨水的质量浓度为20% -30%;所述碳纳米材料与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为(5-100)mg (10-40)mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述过氧化氢与氨水的混合溶液是由质量浓度30%的过氧化氢溶液和质量浓度的氨水按照体积比7 3混合得到的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述碳纳米材料为内嵌金属富勒烯，所述反应的反应温度为45-55°C、时间2-3小时，所述内嵌金属富勒烯与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为(3-5)mg 20mL；所述碳纳米材料为空心富勒烯，所述反应的反应温度为55-65°C、时间10-12小时，所述空心富勒烯与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为IOOmg (70-80)mL ；所述碳纳米材料为氧化石墨烯，所述反应的反应温度为80-90°C、时间12-16小时，所述氧化石墨烯与所述过氧化氢与氨水的混合溶液的配比为5mg (20-40)mL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括将所述含磁 /荧光双模态分子影像探针的溶液离心，除去不溶物，再浓缩至l_2mL，得到浓缩液；向所述浓缩液中加入乙醇并振荡，生成沉淀，收集沉淀并用乙醇冲洗，然后干燥，得到所述荧光分子影像探针。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法还包括下述步骤对所述荧光分子影像探针进行纯化的步骤，具体方法如下将所述荧光分子影像探针溶于水中，过滤收集滤液，将滤液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子杂质，透析后将溶液使用200nm微孔滤膜过滤，将滤液浓缩蒸干得到纯化的荧光分子影像探针。
10.权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的荧光分子影像探针。
全文摘要
本发明公开了一种新型双模态(磁/荧光)一体化分子影像探针及其制备方法。该分子影像探针是按照包括下述步骤的方法制备得到的将碳纳米材料加入过氧化氢与氨水的混合溶液中进行反应，得到含磁/荧光双模态分子影像探针的溶液；离心，除去不溶物浓缩；向浓缩液中加入乙醇并振荡，生成大量沉淀，收集沉淀并用乙醇冲洗，然后干燥，得到所述磁/荧光双模态分子影像探针；其中，所述碳纳米材料选自下述任意一种内嵌金属富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。本发明方法不需有机溶剂的介入，无需分离中间产物，无需无水无氧等条件，具有制备方法简单经济、绿色环保等优点。
文档编号A61K49/06GK102284067SQ20111022548
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者王春儒, 甄明明, 舒春英, 郑俊鹏 申请人:中国科学院化学研究所