专利名称：抗体靶向纳米制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体靶向纳米制剂的制备方法。
背景技术：
5-氟尿嘧啶(5-FU)是嘧啶类的氟化物，属于抗代谢类抗肿瘤药物，能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺核苷酸，干扰DNA的合成。此外尚能抑制RNA的形成，从而抑制肿瘤细胞的增殖，是临床上广泛运用的抗代谢类抗肿瘤药物，但是 5-FU有可能引起严重的消化道反应与骨髓抑制等不良反应。抗体靶向纳米制剂作为一种纳米级药物载体，在提高药物溶解度、增加药物稳定性、缓控释给药、靶向给药等方面有着广阔的应用前景。在目前的肿瘤研究中，已有药物与单克隆抗体偶联的研究报道。有研究表明，VEGF蛋白的过度表达与肿瘤血管的形成及转移有密切关系，因此以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤药物就成为了治疗肿瘤的方法之一。由于5-氟尿嘧啶的毒副作用限制了其应用，如果能靶向性使其直接作用肿瘤细胞，而少作用或不作用正常的细胞的话，那么可以减少其毒副作用，并且减少剂量，降低了患者的耐药性的风险。本发明提供抗体靶向纳米制剂，其包括抗血管内皮生长因子抗体与聚乳酸纳米微粒，可以有效解决现有技术难题。

发明内容
发明目的本发明采用超声乳化-溶剂蒸发法制备纳米制剂药物，制备出了一种具有缓释作用、增加药物在体内滞留时间、具有靶向作用的抗体靶向纳米制剂。技术方案抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10 1 8 1; 偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、血清白蛋白构成，其质量比为4 2 1。所述的抗体靶向纳米制剂的平均粒径小于300纳米。所述抗体靶向纳米制剂的平均粒径为230-280纳米。所述抗体靶向纳米制剂为冻干粉制剂。所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制5-氟尿嘧啶水溶液，作为内水相备用；b.称取聚乳酸溶于有机溶剂中，作为油相，将内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；
c.称取血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成血清白蛋白水溶液作外水相，将水/油初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其中聚乳酸纳米微粒的由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1;e.称取质量比为10 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于pH 为6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1，4°C下搅拌2h，制得抗体靶向纳米微粒。步骤b和d中所述的有机溶剂为丙酮。步骤e中偶联剂为碳二亚胺。本发明的制备过程流程示意图见图1。抗血管内皮生长因子抗体的编码氨基酸序列(重链)MDWTWILFLVAAATRVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKZ抗血管内皮生长因子抗体的编码氨基酸序列(轻链)MDffTffILFLVAAATRVHSQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSZ有益效果本发明原理解释本发明采用抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒，其中纳米微粒中包含有5-FU。其中全人源抗VEGF单克隆抗体特异性结合VEGF ；而血管生成是生殖、 生长发育和修复的基础，绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。在肿瘤血管内皮细胞中，VEGF表现为上调，而正常组织中VEGF表达量很低； 因此采用抗血管内皮生长因子抗体特异性结合肿瘤细胞中上调的VEGF，实现靶向性目的； 该抗人血管内皮生长因子抗体，是中国药科大学与上海转基因研究中心合作，利用转入人免疫球蛋白基因的五特征转基因小鼠成功制备的全人源抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体，其本身具有显著的体内外抗肿瘤活性；本发明抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒的5-FU，不仅靶向性结合肿瘤细胞，并且使得抗肿瘤活性大大增强，并且减少了 5-FU 的用量，减少了 5-FU的副作用，增加了病人的耐受性。如下是详细的说明1、从图3可知，全人源抗VEGF单克隆抗体可以在血液、心脏、肝、脾、肺和骨中，静脉给药后，其放射性迅速达到最大值，然后随着时间的延长放射性逐步降低；而在胃、肌肉、性腺和小肠中，其放射性在给药后Ih达到最大，然后在随着时间的延长而降低；脑中的放射性始终很低，表明全人源抗VEGF单克隆抗体无法通过血脑屏障。从表一可知，抗体靶向纳米微粒的抗体活性可以保存80%以上，因此，靶向纳米制剂可以在某些部位聚集，从而有效的减小全身毒性。2、5_氟尿嘧啶价格便宜并且对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌(局部涂抹)外阴白斑(局部涂抹)等均有一定疗效。 单独或与其他药物联合应用于乳腺癌和胃肠道肿瘤手术辅助治疗，也用于一些非手术恶性肿瘤的姑息治疗，尤其是那些胃肠道、乳腺、头颈部、肝、泌尿系统和胰腺的恶性肿瘤。但是由于5-氟尿嘧啶有着强烈全身毒性，如胃肠道反应与骨髓抑制，影响了其临床使用价值， 因此我们制备5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂，洗完可以减小其5-氟尿嘧啶全身毒性。由图3的结果可知，靶向纳米制剂的缓释效果为4-5天，并且靶向制剂可以在靶部位富集，缓慢释放5-氟尿嘧啶，从而达到缓释的效果。由于其在靶向部位释放5-氟尿嘧啶，靶向制剂可以大大减少5-氟尿嘧啶的全身毒性。3、制备5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂，其显著的优点就是可以利用碳二亚胺 (EDC)偶联剂与抗血管内皮生长因子单克隆抗体偶联，从而提高5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂的肿瘤靶向性，减小毒性。从图4、图5和图6的结果分析可知，全人源单克隆抗体对血管生长因子VEGF的表达有显著的抑制作用，且在特定组织聚集说明抗体对VEGF有着很好的靶向性。从表二可知，抗体2.靶向纳米微粒的抗体活性可以保存80%左右，因此可以显著的提高偶联后的纳米制剂对癌细胞的靶向性。4、从表三可知，制备5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂在相同的5-FU剂量下，其对肿瘤模型老鼠的全身毒性较小，模型老鼠的体重减轻较少，证明靶向制剂有效的降低了 5-FU的全身毒性；而且从抑瘤率结果来看，相同剂量的靶向制剂比单独的5-FU的制剂的抑瘤效果要好，5-FU的药效得到了明显的提高。5、本发明采用超声乳化-溶剂蒸发法制备纳米制剂药物，操作方法简单。利用本方法制备的纳米制剂药物，通过光子相关光谱测定其粒径及分布，结果见图7。图中可见，平均粒径为280nm，多分散性指数为0. 07，粒径分布范围较窄且少见大粒子，说明采用本方法制得的纳米制剂乳业为稳定溶液体系。


图1为本发明的制备过程流程示意图。图2为靶向纳米制剂释放度曲线。图3为静脉给药后全人源抗VEGF单克隆抗体在小鼠组织中的分布图4为全人源抗VEGF单克隆抗体对血管生成的影响。(a.正常组、b.模型组、c.低剂量组、d.高剂量组、e.阳性对照)图5为全人源抗VEGF单克隆抗体对VEGF表达的影响。(a.正常组、b.模型组、 c.低剂量组、d.高剂量组、e.阳性对照)图6为纳米制剂的粒径分布图。图7为靶向纳米制剂的粒径分布图。
具体实施方式
以下实施例所用材料和仪器设备为实施材料牛血清白蛋白(南京奥多福尼生物科技有限公司)、人血清白蛋白(北京寰宇科技发展有限公司)、5_氟尿嘧啶原料药(南京奥多福尼生物科技有限公司)、聚乳酸(Mw = 30000)(山东济南岱罡科技有限公司)、抗血管内皮生长因子抗体(按文献方法
备 Yu Liu, Dong-jie Yun, Jian-quan Chen, Jian-yang Zhao, Si-guo Liu, Guo-xiang Cheng. Isolation and characterization of human anti-VEGF 165monoclonal antibody with antitumor efficacy from transgenic mice expressing human immunoglobulin loci. Cancer letters, 2009)、碳二亚胺(Sigma 公司)。仪器设备超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)、激光粒度仪(美国布鲁克-海文公司)、冷冻离心机(美国Thermo公司)、磁力加热搅拌器(上海司乐仪器有限公司)、电子天平(Satourius公司)、紫外-可见分光光度计(上海菁华仪器科技有限公司)。本实施例中采用方法参照《药剂学》第三版(屠锡德、张钧寿、朱家壁主编)989 999页；《药物控释新剂型》(贾伟、高文远主编)337 348页。实施例1抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10 1;偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、牛血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1。所述的抗体靶向纳米制剂的平均粒径小于300纳米。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制质量体积比为5% 10%的5_氟尿嘧啶水溶液，所得溶液作为内水相备用；b.将聚乳酸溶于有机溶剂中，配制成质量体积比为5% 6%的溶液作油相，将 2. 5ml的内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；c.称取牛血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成质量体积比为 0. 3% 0. 5%的牛血清白蛋白水溶液作外水相，将初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其由聚乳酸、5-氟尿嘧啶和牛血清白蛋白组成，其质量比为4 :2:1;e. 16000转/分的高速离心机分离收集制得的聚乳酸纳米微粒，用去离子水洗涤三至四次，冷冻干燥，于-20°C冰箱中保存备用；f.称取质量比为10 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于 PH为6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中碳二亚胺与单抗的质量比为 2 1，4°C下搅拌池，将所得溶液16000r/min，5min离心分离，超声分散后用去离子水洗涤三遍，冷冻干燥，所得白色粉状固体即为抗体靶向纳米微粒。实施例2
抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为8 1;偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、牛血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1。所述抗体靶向纳米制剂的平均粒径为230-280纳米。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制质量体积比为5% 10%的5_氟尿嘧啶水溶液，所得溶液作为内水相备用；b.将聚乳酸溶于有机溶剂中，配制成质量体积比为5% 6%的溶液作油相，将 2. 5ml的内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；c.称取牛血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成质量体积比为 0. 3% 0. 5%的牛血清白蛋白水溶液作外水相，将初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其由聚乳酸、5-氟尿嘧啶和牛血清白蛋白组成，其质量比为4 :2:1;e. 16000转/分的高速离心机分离收集制得的聚乳酸纳米微粒，用去离子水洗涤三至四次，冷冻干燥，于-20°C冰箱中保存备用；f.称取质量比为8 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于pH为 6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳亚胺，其中碳二亚胺与单抗的质量比为2 1， 4°C下搅拌池，将所得溶液16000r/min，5min离心分离，超声分散后用去离子水洗涤三遍， 冷冻干燥，所得白色粉状固体即为抗体靶向纳米微粒。实施例3抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为8 1;偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、人血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1。所述抗体靶向纳米制剂的平均粒径为230-280纳米。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制质量体积比为5% 10%的5_氟尿嘧啶水溶液，所得溶液作为内水相备用；b.将聚乳酸溶于有机溶剂中，配制成质量体积比为5% 6%的溶液作油相，将 2. 5ml的内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；c.称取人血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成质量体积比为 0. 3% 0. 5%的人血清白蛋白水溶液作外水相，将初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；
d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其由聚乳酸、5-氟尿嘧啶和牛血清白蛋白组成，其质量比为4 :2:1;e. 16000转/分的高速离心机分离收集制得的聚乳酸纳米微粒，用去离子水洗涤三至四次，冷冻干燥，于-20°C冰箱中保存备用；f.称取质量比为8 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于pH为 6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中碳二亚胺与单抗的质量比为2 1， 4°C下搅拌池，将所得溶液16000r/min，5min离心分离，超声分散后用去离子水洗涤三遍， 冷冻干燥，所得白色粉状固体即为抗体靶向纳米微粒。实施例4抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10 1;偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、人血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1。所述的抗体靶向纳米制剂的平均粒径小于300纳米。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制质量体积比为5% 10%的5_氟尿嘧啶水溶液，所得溶液作为内水相备用；b.将聚乳酸溶于有机溶剂中，配制成质量体积比为5% 6%的溶液作油相，将 2. 5ml的内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；C.称取人血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成质量体积比为 0. 3% 0. 5%的牛血清白蛋白水溶液作外水相，将初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其由聚乳酸、5-氟尿嘧啶和人血清白蛋白组成，其质量比为4 :2:1;e. 16000转/分的高速离心机分离收集制得的聚乳酸纳米微粒，用去离子水洗涤三至四次，冷冻干燥，于-20°C冰箱中保存备用；f.称取质量比为10 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于 pH为6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中碳二亚胺与单抗的质量比为 2 1，4°C下搅拌池，将所得溶液16000r/min，5min离心分离，超声分散后用去离子水洗涤三遍，冷冻干燥，所得白色粉状固体即为抗体靶向纳米微粒。实施例5a.用Elisa检测法检测抗体抗体2.抗体靶向纳米微粒的抗体活性1.使用VEGF蛋白包被96孔板。2.每孔加lOOul，1 % BSA 一缓冲溶液，4°C封闭M小时，洗涤2次，吸净残留液体。3.稀释缓冲液将单克隆抗体和抗体靶向纳米微粒按单克隆抗体量梯度稀释，每孔加入lOOul，37°C孵育2小时。4.洗涤5次，加入二抗(1 2000稀释)100ul每孔，37°C孵育2小时。
5.洗涤5次，加入底物液IOOul每孔，37°C孵育0.5小时，加终止液。6.酶标仪检测492nm波长处OD值，以单克隆抗体和抗体靶向纳米微粒的吸光度值对应单克隆抗体浓度作图，结果见表1 ；表一
权利要求
1.抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒， 偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10 1 8 1;偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。
2.根据权利要求1所述的抗体靶向纳米制剂，其特征在于偶联剂为碳二亚胺。
3.根据权利要求1所述的抗体靶向纳米制剂，其特征在于聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、 5-氟尿嘧啶、血清白蛋白构成，其质量比为4 2 1。
4.根据权利要求3所述的抗体靶向纳米制剂，其特征在于所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
5.根据权利要求1所述的抗体靶向纳米制剂，其特征在于所述的抗体靶向纳米制剂的平均粒径小于300纳米。
6.根据权利要求5所述抗体靶向纳米制剂，其特征在于所述抗体靶向纳米制剂的平均粒径为230-280纳米。
7.根据权利要求1所述抗体靶向纳米制剂，其特征在于所述抗体靶向纳米制剂为冻干粉制剂。
8.一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.按聚乳酸、5-氟尿嘧啶、血清白蛋白的质量比为4 2 1称取原料；配制5-氟尿嘧啶水溶液，作为内水相备用；b.称取聚乳酸溶于有机溶剂中，作为油相，将内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；c.称取血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成牛血清白蛋白水溶液作外水相，将水/油初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒；e.称取质量比为10 1 8 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于 PH为6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1，4°C下搅拌池，制得抗体靶向纳米微粒。
9.根据权利8所述的一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于步骤b和d中所述的有机溶剂为丙酮。
10.根据权利8所述的一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于步骤e中偶联剂为碳二亚胺。
全文摘要
本发明涉及一种抗体靶向纳米制剂的制备方法。抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10∶1～8∶1；偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2∶1。本发明抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒的5-FU，不仅靶向性结合肿瘤细胞，并且使得抗肿瘤活性大大增强，并且减少了5-FU的用量，减少了5-FU的副作用，增加了病人的耐受性。
文档编号A61K9/19GK102283810SQ20111013827
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者刘煜, 王宗凯, 石晨阳 申请人:中国药科大学