专利名称：基于丙酸菌的免疫刺激剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于丙酸菌(Propionibakteria)的免疫刺激剂的制备。
从DE-A3011461得知基于丙酸菌菌株DSM1773,1772和ATCC6919的肿瘤化疗制剂。为准备细菌材料，使细菌在1升容器的液体培养基中无氧条件下增殖。然后离心分离细菌细胞，研磨，煮沸灭活，经胰蛋白酶处理后，再次离心分离并冻干。
然后可再悬浮所得的制备物并通过例如静脉注射施用。
上述制备方法是复杂的并且不适合用于动物保健领域中的试剂，例如免疫刺激剂。因此，对简化该制备方法而不减少所述制剂的活性和相容性的可能性进行了研究。
本发明提供一种基于丙酸菌的免疫刺激剂制剂，其特征在于所述细菌在液体培养基中无氧增殖并，一旦发酵完成，以常规方式灭活和分离，清洗并干燥所得的细胞物质。
意外的是以此简单方式可得到的制剂是高效同时又是耐受良好的。
优选使用德国微生物保藏所DSM1772号保藏的丙酸菌的avidum KP40制备免疫刺激剂。基于丙酸菌KP40(DSM1772)的全细胞制剂在发酵罐液体培养基中用简化的方法获得。所使用的接种材料来自一只主要的原种。通过使用该种源，可保证数次传代后的出发菌株保持与德国微生物保藏所保藏的菌株特性一致。
所述细菌通过在营养丰富培养基中，无氧条件下，30-39℃(优选35-37℃)通过预培养和主要培养(Hauptkultur)进行增殖，所述营养丰富培养基含酵母提取物(可用胰蛋白酶(tryptin)处理而被消化)，蛋白质水解物，葡萄糖和有机酸，如丙酮酸，乳酸或α酮戊二酸。还可使用复合培养基如脑/心培养基。预培养在0.1-50升体积的深层立式培养中进行18-30小时。用预培养物接种主要培养。发酵在10-5000升体积的控制发酵罐中持续振荡培养基，进行24-72小时，优选40-56小时，特别优选48小时。
发酵完成后，以常规方式通过物理方法，例如通过加热，紫外或γ照射，或通过化学方法，例如通过乙醇，甲醛或β内酯的反应灭活所述细菌。
加热灭活在60-120℃(优选在75-85)发酵罐中进行15-60分钟(优选30-45分钟)。化学灭活以本来为已知的方式在适当容器，例如发酵罐中进行。所给出的优选方案是使用浓度为0.01-0.5％的甲醛，特别优选0.05-0.2％的甲醛。所述灭活在30-39℃进行，优选35-37℃，持续12-48小时，优选18-30小时，并使该材料在不断运动中灭活。
通过过滤或通过，分批或连续流动离心的方法从培养肉汤分离灭活的细菌细胞。优选使用0.1-1微米孔径(优选0.22-0.45微米)的膜通过对流连续流动法进行过滤。该方法还可用于细菌细胞的浓缩物，以及培养肉汤的洗涤液和含生理盐浓度(例如0.9％浓度生理盐溶液)的缓冲水溶液的甲醛残余物或磷酸缓冲生理盐溶液。
通过5000-20,000x g离心力离心分离所述细菌细胞，通过分批法或连续流动法分批进行。
在含生理盐浓度的缓冲水溶液(例如0.9％浓度生理盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)中重悬浮所述沉淀物。为清洗培养肉汤和甲醛残留物，该操作被重复数次。
在冲洗后，使细菌细胞经过干燥过程，例如喷雾干燥或冷冻干燥。优选使用冷冻干燥，被重悬浮的细菌细胞直接在样品容器中分份冻干，或以较大的份量被冻干并随后称重到样品容器中。到此最后的操作，若有必要将所述细菌与保护性胶体和/或稳定剂，去泡剂和防腐剂混合。
在施用所述制剂前，用一种溶剂，例如蒸馏水，纯化水或0.9％浓度的生理盐水溶液重新配制(reconstituted)所述干燥的产物。
实施例全细胞细菌制剂的制备材料-PBS(SIGMA D8537)-NaOH储备液10％NaOH 100.00克去离子水补足1000.00毫升-培养基溶液1酪蛋白水解物120.00克酵母提取物 120.00克L-半胱氨酸HCI 10.00克淀粉15.00克丙酮酸钠15.00克硫酸镁 10.00克去离子水补足7500.00毫升溶液2葡萄糖 40.00克去离子水补足250.00毫升溶液3磷酸二氢钾 40.00克NaOH储备液10％ 120.00毫升去离子水补足2250.00毫升在全部物质被溶解后，将溶液1转移到发酵罐中并与发酵罐一起灭菌。在制备后，立即将溶液2和3分别在+110℃灭菌15分钟。在无菌条件下，将溶液2和3加入到发酵罐中的溶液1。为建立起无氧条件并检查灭菌情况，在+37℃，每分钟100转(rpm)和每小时1.5升氮气(N2/h)运转所述发酵罐过夜。为预培养，将100毫升培养基转移到100毫升Schott瓶中。取出该培养基1毫升以再悬浮保藏的P.avidumKP40样品。将全部再悬浮的保藏的样品转移到Schott瓶中，并旋好瓶盖，但要松一些。在+37℃无菌条件下(GasPak,BBL)进行培养24小时。将100毫升该培养物在无菌条件下转移到所述发酵罐中并培养在+37℃,100rpm和1.5升N2/h共48小时。然后终止发酵，将发酵罐内容物与27毫升36.5％浓度的甲醛溶液(相当于0.1％终浓度的甲醛)混合。在+37℃灭活并减少与氮气的接触共24小时。然后卸出发酵罐中的内容物并进行检测。用一部分所述材料于灭活检测(每周间隔传3代)。所述灭活材料在10,000x g分份离心10分钟。弃上清，并合并沉淀物和在磷酸缓冲生理盐水(PBS)中洗两次。随后将10毫升一份的再悬浮细菌细胞装入无菌25毫升瓶中并冷冻干燥。得到的产物被储存在+4℃。
权利要求
1．制备基于丙酸菌的免疫刺激剂的方法，其特征在于在液体培养基中无氧增殖所述细菌并，一旦发酵完成，以常规方式灭活，并且所得细胞物质被分离，洗涤，过滤和干燥。
全文摘要
本发明涉及基于丙酸菌的免疫刺激剂的制备,其特征在于所述细菌在液体培养基中无氧增殖并,一旦完成发酵,以常规方式灭活,并且所得细胞物质被分离,洗涤,过滤和干燥。
文档编号A61P37/04GK1226170SQ97196768
公开日1999年8月18日 申请日期1997年7月14日 优先权日1996年7月26日
发明者W·布罗克, E·海南, N·施梅尔, G·普尔弗雷尔 申请人:拜尔公司