专利名称：靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用，属于微生物学，分子生物学和基因工程领域。
背景技术：
2009年，美国ASCO主席在介绍肿瘤进展时提到，癌症的第一死亡原因是癌症本身和癌症复发，第二位死因就是血栓。癌症与血栓的关系非常密切，重视癌症血栓的预防和治疗已成为临床医生今后工作的重点之一。1865年,法国医生Armand Trousseau首次报道了胃癌患者容易形成静脉血栓， 不久，Billroth又于1878年发现了血栓中存在癌细胞，进一步提出癌变可引起凝血功能紊舌L。临床上把肿瘤相关性血栓称为Trousseau综合症。大量的病理、实验和临床研究证实了这一现象，而且还发现，几乎所有的癌症患者都存在局部或全部高凝状态。癌症患者的血栓性疾病包括深静脉血栓(deep venous thlmmbosis, DVT)、肺栓塞(pulmonary embolism, PE)、弥散性血管内凝血(disseminated intravascularcoagulation, DIC)、门静脉血栓(portal vein thmrnbosis, PVT)和动脉血栓栓塞(arterial thromboembolism, AT)、游走性浅表血栓性静脉炎(migratorythrombophlebitis superficial)等，其中下肢 DVT 最为常见。癌症患者血栓形成的发病机理相当复杂，至今尚未完全明确。多种因素通过不同途径共同导致了癌症患者的血栓易患倾向，主要包括抗癌治疗、肿瘤细胞的表达物及释放物和致癌基因等因素。抗癌治疗导致血栓形成，主要是手术治疗期间形成血栓，化疗药物和放射治疗诱发血栓形成以及患者在接受中心静脉穿刺置管治疗期间，管周纤维蛋白鞘导致血栓形成。癌症患者所患的血栓性疾病与肿瘤细胞表达和释放的物质关系密切。肿瘤细胞可通过释放促凝因子或炎性因子来直接或间接地激活凝血级联反应，另一方面，炎性因子亦可刺激肿瘤细胞释放更多的促凝因子而加剧血液的高凝状态。肿瘤细胞表达和释放的三种主要促凝物质为组织因子(TF)、癌促凝物质(cancer procoagulant CP)和丝氨酸蛋白酶(hepsin)。新近的研究表明，某些致癌基因在促进细胞恶变的同时也能够引起凝血功能紊舌L。如Yu J等证实，导致癌症产生的某些基因病变如Ras基因活化或p53基因失活能够造成组织因子(TF)的过度表达，诱发凝血病变。最近的研究还显示，血栓形成参与了肿瘤的进展、血管生成和转移等机制。除了癌症治疗形成血栓可视为外界因素外，其余两种因素所形成的血栓都是应机体癌变出现的。研究发现，血栓的形成有利于肿瘤发生和发展的机制可能是纤维蛋白沉积于肿瘤细胞周围为肿瘤生长提供了 2个便利条件一方面为肿瘤细胞附着提供了基质，利于其局部扩散和蔓延；另一方面，纤维蛋白凝血块和相关的凝血因子能够上调血管内皮细胞生长因子的表达(VEGF)，从而为新生血管创造了条件。目前，治疗肿瘤及血栓的药物都为单一功能的药物，同时具有抗肿瘤及溶栓功能的药物还未见报道。因此，构建出一种既抗肿瘤又溶栓的双功能嵌合蛋白，对于治疗癌症并发血栓的病例具有重要意义。

发明内容
针对癌症患者易形成血栓的问题，本发明基于SEC2的抗肿瘤活性和SAK的抗血栓作用，构建一种靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，使抗肿瘤和抗血栓两种作用得以体现的同时，还具有较精确的靶向作用。为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，由序列表SEQ ID NO. I所示的生长抑素类似物奥曲肽Oct序列、序列表SEQ IDNO. 2所示的截短SAK氨基酸序列和序列表SEQ ID NO. 3所示的截短SEC2氨基酸序列构成， 将三者连接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示的嵌合蛋白/Isee之或氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的嵌合蛋白0ct-ASEC2-ASAK。利用大肠杆菌表达系统生产上述靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白Oct-Δ sak-Δ sec2的方法如下
1)构建嵌合基因Oct-Asak-Δ sec2,其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示；
2)将得到的嵌合基因化i-Z sak- Δ sec2,经酶切后，插入到载体质粒pET28a (+)的AcoRI/ Xhol位点，构建出表达嵌合蛋白Oct-Λ sak-Δ sec2的质粒pET28a_Oct-Δ sak-Δ sec2 ；
3)将质粒pET28a-化卜』似左-』转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到O.6时，在30°C条件下用I mM IPTG诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；
5)用超声波破碎菌体细胞，功率400W;处理时间5X11 sec, 5 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。利用大肠杆菌表达系统生产上述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白0ct-ASEC2_ASAK的方法如下
1)构建嵌合基因Oct-Λsec2-A似左，其DNA序列如SEQ ID NO. 10所示；
2)将得到的嵌合基因Oct-Λsec2~A sak,经酶切后，插入到载体质粒pET28a (+)的feoRI/ Xhol位点，构建出表达嵌合蛋白Oct-Λ SEC2-Λ SAK的质粒pET28a-Oct-Δ sec2~A sak ；
3)将质粒pET28a-0ct-』似左转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到O.6时，在30°C条件下用I mM IPTG诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；
5)用超声波破碎菌体细胞，功率400W ;处理时间5X11 sec, 5 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白Oct-ASEC2-ASAK，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本发明，根据实际需要选择嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2或嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK,当药物制剂以抗肿瘤为主时以嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK为佳，当药物制剂以溶栓为主时以嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2为佳。本发明的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。以本发明的嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2或嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK为有效成分，添加药学上常规的辅料，可制备具有抗肿瘤溶栓双效的各种药物制剂。本发明的有益效果是本发明所构建的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白能够在生物体内通过奥曲肽靶向结合肿瘤细胞的同时，高效的发挥SEC2的抗肿瘤功能，又可以发挥SAK 的溶栓活性，是理想的溶栓抗癌双效生物制剂。本发明采用重叠延伸剪接技术，构建嵌合基因，通过大肠杆菌原核表达系统和Ni亲和层析纯化法，成功获得了高蛋白纯度的嵌合蛋白，并经体外溶栓实验和体外抑瘤实验证明了，本发明的嵌合蛋白分别与SAK和SEC2具有相同的活性，成功实现了溶栓抗癌双效生物制剂的构建。
具体实施例方式实施例I抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2的制备 (一)带有嵌合基因Oct-Δ sak- Δsec2的表达质粒构建
通过重叠延伸剪接技术构建嵌合基因，连接到表达载体pET28a(+)上，并转化大肠杆菌 BL21(DE3)。I、嵌合基因 Oct-Δ sak-AsecJ 的构建
经PCR方法分别克隆得到编码截短SAK的基因Λ sak (其DNA序列如SEQ ID NO. 6所示)、编码截短SEC2的基因Ksec2 (其DNA序列如SEQ ID NO. 7所示)，经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因Asak-Awd，再通过引物设计，将编码奥曲肽Oct的基因(其DNA序列如SEQ ID NO. 8所示)连接到嵌合基因Λ sak-前面，使其成为Oct-Λ sak-(其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示)。同时，为了实现嵌合基因Oct- Δ sak- ΛmcJ 连接到表达质粒pET_28a (+)上并能成功表达，通过PCR方法在嵌合基因Oct-Λ sak-A1SecJ的5’端加上酶切位点及保护碱基，在嵌合基因Oct-Λ sak-A1Sed的3’端加上终止密码子，XhoI酶切位点及保护碱基。2、构建重组质粒
将带有酶切位点的嵌合基因Oct-Λ sak-AmcJ 经限制性内切酶及和ZAoI双酶切后，插入到表达载体pET28(+)的及^PI/ Xhol位点，T4连接酶16°C连接过夜，得到连接反应液。3、大肠杆菌的化学转化
将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，经化学方法转化(42°C水浴热激)，之后，将菌液涂布于LB平板上，37°C培养过夜，以筛选阳性克隆。4、阳性克隆的筛选在含有Kan抗性的LB平板培养基上，挑取阳性克隆，培养后提取质粒经及和ZAoI双酶切验证，确定嵌合基因Oct-Λ sak-AmcJ 是否被插入到表达质粒中。再由上海生工公司(Sangon, China)对得到的重组质粒进行测序确认。试验结果
经双酶切验证和测序分析综合表明，表达Oct-Δ sak-Δ sec2的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pET28a- /I SaA-Zl SecJ的重组大肠杆菌。(二)Oct-Λ sak-Δ sec2的诱导表达及纯化 I^Oct-Δ sak-Δ sec2 的诱导表达
将带有重组质粒pET28a- oct-Δ sak-Δ sec2的重组大肠杆菌接种于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine, Kan) (40 Kg/ml)的10 ml LB培养基中，培养12 16小时，次日按2%的·接种量，将培养好的菌液接种到含有Kan (40 Pg/ml)的200 ml LB培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用I mM IPTG进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明·选择在菌体生长不是很活跃的30°C作为诱导温度，诱导4 一 5 h。2> Oct-Δ sak-Δ sec2 的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000 rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20°C过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。用超声波破碎菌体细胞，功率400 W ;处理时间5Xllsec，5 sec间隔。处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。将上清液低速上样于Ni-NTA亲和层析柱，平衡缓冲液(30 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl pH7. 6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50-300 mM 咪唑PH7. 6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组Oct-Δ sak-Δ sed本发明中，载体质粒pET28a(+)编码了三个用于纯化的标签，C端6XHistag，t7tag和N端6XHistag,本发明选择了 N端6XHistag。利用Ni离子特异性螯合His的特点，实现含有6 X Hi stag的Oct-Λ sak-Δ 与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6 XHistag与Ni离子的结合实现Oct- Δ SAK- Δ SEC2的洗脱。试验结果经SDS-PAGE验证，成功表达并纯化出嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。(三)体外溶栓活性分析 具体实施如下
称取125 mg琼脂糖(电泳级)，加入23 ml生理盐水，煮沸溶解，60°C水浴平衡，加凝血酶 14 μ I (100 IU/ml)，人纤溶酶原 280 μ I (O. 5 mg/ml)，人纤维蛋白原 2. 2 ml (6 mg/ml)，倒入80 mm平板内冷却，制成人纤维蛋白平板，用前于4°C放置半个小时。打孔上样，每个孔的直径为2 mm,上样量为10 μ I, SAK和Oct- Δ SAK- Δ SEC2的浓度为50μ g/ml，每个样品设置3个重复，于37°C恒温湿盒内放置24 h后，测溶栓直径并进行活性比较。实验结果
SAK的溶栓直径平均为24. 68 mm, Oct- Δ SAK- Δ SEC2的溶栓直径平均为24. 81 mm，二者的溶栓活性基本相同。
(四)体外淋巴细胞(PBMC)增殖活性分析 具体实施如下
取正常人新鲜外周血5 ml，抗凝后(肝素，终浓度O. 2 mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000 rpm离心15 min，取出中间的云雾层(PBMC),再加入等量D-Hanks液混勻,3000 rpm离心10 min,弃上清,然后用3_5 ml D-Hanks液重悬PBMC，3000 rpm离心10 min，重复一次，加入适量的含有10%血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以I X IO5个/孔的量加入到96孔板中，于CO2含量为5%，37°C的恒温细胞培养箱中培养12 h，次日用含有10%血清的DNEM培养基将待测样品稀释至20 ng/ml和200 ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，以BSA阴性作为对照，PHA-P作为阳性对照，每样3个复孔；5% CO2, 37°C培养72 h ;取出96孔板，按50 μ I/孔加入MTT，5% CO2, 37°C培养4h ；3000 rpm 离心 10 min，加入 DMSO 120 μ I/孔，37°C溶解 20 min ;酶标仪上 570 nm 测定各孔的吸光值。 实验结果
从鼠脾淋巴细胞的增值情况可以看出，无论是较低浓度的20 ng还是较高浓度的200ng，Oct- Δ SAK- Δ SEC2和肠毒素SEC2的增值率是相同的。结果见表I表I鼠脾淋巴细胞增殖实验
SSC2 SAZ-im.yr-SE SEC2 SAK-ls hir-S￡ PHA-P BSA C (2Ckg) (200fg} C2 ftWng) i雜,f {WffM
増殖車 50Al 37% 52 63% 52.6热 112.2S% 5 30%
(五)体外抑瘤活性分析 具体实施如下
取正常人新鲜外周血5 ml，抗凝后(肝素，终浓度O. 2 mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000 rpm离心15 min，取出中间的云雾层(PBMC),加入等量D-Hanks液混勻，3000 rpm离心10 min,弃上清,用3-5 mlD-Hanks液重悬PBMC，3000 rpm离心10 min，重复一次，加入适量的含有10%血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以2X IO5个/孔的量加入到96孔板中；倒掉Hella细胞培养瓶中旧培养基，力口入2-3 ml D-Hanks液洗去残留的培养基，或用少量胰酶涮洗一次，加入1-2 ml胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，将胰酶倒掉，加入少量含有10%血清的DMEM培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，计数。将Hella细胞以I X IO4个/孔的量加入到96孔板中，用含有10%血清的DMEM培养基将待测样品稀释至20 ng/ml和200 ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，仅加Hella细胞作为肿瘤细胞对照孔，仅加与实验孔等量的PBMC和待测样品作为本底释放孔，每样3个复孔，5% C02，37°C培养 36 h ;取出 96 孔板，加入 50 yl/^LMTT，5% C02，37°C培养 4 h ；3000rpm离心10 min，W；VDMS0 120 μ I/孔，37°C溶解20 min，酶标仪上570 nm测定各孔的吸光值。并按照下面的公式计算抑瘤率
权利要求
1.一种靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于由序列表SEQ ID NO. I所示的生长抑素类似物奥曲肽Oct序列、序列表SEQ ID NO. 2所示的截短的SAK氨基酸序列和序列表SEQ ID NO. 3所示的截短的SEC2氨基酸序列构成，三者连接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示的嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2或氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的嵌合蛋白0ct-ASEC2_ASAK。
2.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求I所述的靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，其特征在于步骤如下 1)构建嵌合基因Oct-ΛsaA-Δ ，其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示； 2)将得到的嵌合基因Oct-Λsak-Δ sec2,经酶切后，插入到载体质粒pET28a (+)的AcoRI/ Xhol位点，构建出表达嵌合蛋白Oct-Λ sak-Δ sec2的质粒pET28a_Oct-Δ sak-Δ sec2 ; 3)将质粒pET28a-ifci-Zsak-Δ mcJ 转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌； 4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到O.6时，在30°C条件下用I mM IPTG诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞； 5)用超声波破碎菌体细胞，功率400W;处理时间4X11 sec, 5 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液； 6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求I所述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，其特征在于步骤如下 1)构建嵌合基因Oct-Λsec2-A似左，其DNA序列如SEQ ID NO. 10所示； 2)将得到的嵌合基因Oct-Λsec2~A sak,经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的&oRI/ Xhol位点，构建出表达嵌合蛋白Oct-Λ SEC2-Λ SAK的质粒pET28a_6fci-/l sec2~A sak ; 3)将质粒pET28a-ifci-Zsec2~A转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌； 4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到O.6时，在30°C条件下用I mM IPTG诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞； 5)用超声波破碎菌体细胞，功率400W;处理时间5X11 sec, 5 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液； 6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
4.权利要求I所述的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及靶向肿瘤细胞抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用。本发明嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或如SEQ ID NO.5所示。嵌合蛋白的制备方法如下构建嵌合基因；将嵌合基因经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌摇瓶培养，超声波破碎，将收集的上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白。本发明的嵌合蛋白，可使靶向肿瘤，抗肿瘤并抗血栓两种作用得以同时体现。
文档编号A61K38/16GK102924606SQ20121046587
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者胡风庆, 林家帅 申请人:辽宁大学