专利名称：Rna胞体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，尤其是细胞学和组织学领域。特别地，本发明涉及一种可再生的RNA胞体，其包含RNA并且表达通常只在原始精母细胞中表达的RNA结合蛋白VASA。这些RNA胞体还表达c-kit，但不是表达在胞体表面，而是表达在胞体内RNA的部位。此外，这些RNA胞体不表达E-cadherin。本发明还涉及上述RNA胞体的用途,其例如可以用于促进组织再生和伤口修复(例如通过静脉注射的方式)，因为这些胞体具有进一步分化成组织特异细胞的潜能。本发明还涉及上述RNA胞体用于制备药物组合物的用途，以及包含上述RNA胞体的药物组合物。
背景技术：
外伤、缺血和纤维化疾病可导致组织损伤。作为组织损伤的结果，不同的组织或器官，例如皮肤、肝脏和心脏会产生疤痕。对于皮肤上较大的疤痕，由于缺乏有效的治疗方法，会给病人带来长期的心理和生理上的负担。在心血管系统疾病中，急性心脏病发作可由心肌细胞缺血引起，其可能导致心脏组织的坏死，并且坏死的细胞会被成纤维细胞取代进而形成疤痕。因此，寻找组织或器官损伤的再生治疗方法一直是临床上十分关注的问题。虽然干细胞被认为具有再生组织的巨大潜能，但一些研究结果的结论是自相矛盾的，例如在利用成人的骨髓干细胞再生心肌细胞方面。一方面，尽管已报道骨髓或血液来源的造血干细胞参与造血谱系之外的组织(例如肌肉，神经元，肝细胞等其他组织)的发育和再生，但迄今为止，仍未明确鉴定到具有多系潜能的特定骨髓或血液来源的干细胞亚群。另外，还有报道称，传统的骨髓干细胞在体外培养后会丧失再生组织的能力。另一方面，虽然已报道骨髓干细胞具有自我更新的能力，例如，干细胞维持恒定的数目并同时为组织提供祖细胞，但这些干细胞的自我更新机制仍不清楚。有报道称，干细胞通过不对称分裂来实现自我更新与定向分化，然而单个细胞如何能够分裂产生2种具有不同命运的细胞是完全不清楚的。因此，目前在使用干细胞来进行再生治疗方法方面仍存在着很多问题。本领域仍然迫切需要新的有效的再生治疗方法。在低等生物中，原始生殖细胞(PGC)形成于特定的种质中，该种质是卵母细胞的细胞质成分，由线粒体衍生物和电子密集体聚集而成。其中电子密集颗粒富含来自母体的RNA0该种质在形态上与体细胞的细胞质不同，它表达几种未在其它组织和细胞类型中发现的特异性分子标记。其中一种分子标记是VASA，它是一种DEAD-box RNA结合蛋白。在斑马鱼中，生殖细胞系形成前，vasa基因的RNA发生不对称地分离。在果蝇卵中，将后极胞质移植入前极或移植入UV照射过的后极区域仍能维持PGC的正常形成，这提示种质RNA对于PGC的形成是必不可少的。这一点进一步得到下述事实的支持沉默VASA会抑制PGC的形成和发展。果蝇vasa基因与真核细胞的起始因子4A(eIF4A)相类似。VASA有几种功能，其中一种是与eIF5B结合，后者是必须的翻译起始因子，诱导核糖体亚单位的组装；另一种功能是在早期生殖细胞中调节mei-P26的翻译，进而促进生殖细胞的进一步分化。这些报道表明在果蝇生殖细胞的形成过程中种质和VASA起着非常重要的作用。虽然哺乳动物中，种质并不是PGC的来源，但对形成胚胎非常重要，因为对克隆羊来说必不可少的物质是卵母细胞的种质和体细胞的细胞核。本发明人意外地在血液中发现了一种RNA胞体，其包含RNA以及与RNA结合的VASA蛋白。该RNA胞体，例如经血液移植后，能够促进组织再生和伤口修复，从而为再生治疗方法提供了新的选择。

发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的免疫学、分子生物学、细胞生物学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。 如本文中使用的，术语“RNA胞体(RNA body) ”是指，包含由膜包被的RNA的小体，其直径一般为O. 1-1 μ m,并且具有自我更新的能力。RNA胞体不同于本领域所公知的真核细胞，表现在它们没有典型的细胞核，细胞器及细胞膜。RNA胞体也不同于目前已知的原核细胞，表现在其表面没有膜或壳等原核细胞膜结构。RNA胞体的表面蛋白主要是血浆蛋白，并且蛋白层的厚度可随着RNA胞体的分化和成熟而变薄(见图11-12)。本发明的RNA胞体可从动物例如例如哺乳动物(包括人和小鼠)的血液和骨髓中分离获得。如本文中使用的，术语“自我更新”是指，当在培养条件下或在其天然环境中时，其能够生长和扩增，从而使个体(例如，本发明的RNA胞体)的数目不断增加。如本文中使用的，当提及标记时，术语“阳性”是指使用本领域技术人员公知的方法(例如流式细胞术，免疫组织化学，免疫印迹等)，能够检测到标记的存在，即，标记以可检测的水平表达。相应地，术语“阴性”是指，无法检测到标记的存在。因此，如本文中使用的，术语“阴性”不仅包括标记不表达，还包括标记以极低的、无法检测的水平表达。如本文中使用的，当提及标记时，术语“低表达”是指表达此种标记的个体的数目小于整个群体的约30%，例如小于约20%，例如通过流式细胞术所测定的；术语“高表达”是指表达此种标记的个体的数目高于整个群体的约30%，例如通过流式细胞术所测定的。一种或数种标记的表达模式的不同可用于区分不同的群体，例如不同的细胞群体(例如干细胞与体细胞)。可用于区分细胞群体的标记是本领域技术人员已知的，包括但不限于，c-kit、VASA、E-cadherin、CD13、CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、Seal 和 HiLi 等等。例如，c-kit被认为是造血干细胞的特异性标记之一,VASA被认为是原始生殖细胞(PGC)的特异性标记之一，而E-cadherin则在表皮细胞,肥大细胞和内皮细胞等上特异性表达。如本文中使用的，术语“RNA胞体融合体”或“融合体”是指，2个或更多个RNA胞体的膜彼此融合而形成的小体。因此，本发明的融合体包含膜和内含物，所述膜由RNA胞体的膜融合而成，所述内含物来源于各个RNA胞体。如本文中使用的，术语“RNA胞体集落”是指，包含单独的RNA胞体以及RNA胞体的融合体的类似于集落(colony)的结构。如本文中所使用的，术语“血液”包括但不限于，外周血和脐带血，优选脐带血。
在一个方面，本发明涉及一种分离的RNA胞体，其包含由膜包被的RNA，具有自我更新的能力，且直径为O. 1-1 μ m。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体是c-kit阳性的。在另外优选的实施方案中，本发明的RNA胞体是VASA阳性的。在另外优选的实施方案中，本发明的RNA胞体是E-cadherin阴性的。在又一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞 体表达⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、CD34、Scal和HiLi中的一种或多种。在又一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体低表达⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、CD34、HiLi和Scal中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体的特征在于，其所包含的RNA占总核酸的50%以上，即在RNA胞体中，RNA的含量高于DNA的含量，并且在RNA胞体所包含的RNA中，有至少40%是miRNA。在进一步优选的实施方案中，所述miRNA包括表I所列的miRNA的一种或多种。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体的特征在于，其能够发生聚集和融合，并形成融合体。在进一步优选的实施方案中，所述融合体包含膜和内含物，且能够经历下述过程所述膜变薄，所述内含物中的DNA增加，而RNA减少。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体的特征在于，其具有参与和/或促进组织再生和伤口修复的能力。在进一步优选的实施方案中，组织包括但不限于，上皮组织，心肌组织，神经组织和骨组织。因此，在一个实施方案中，本发明的RNA胞体具有选自下列的一种或多种特征I)其是c-kit阳性的；2)其是VASA阳性的；3)其是 E-cadherin 阴性的；4)其表达 CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、HiLi 和 Seal 中的一种或多种；5)其所包含的RNA占总核酸的50%以上，并且在所述RNA中，有至少40%是miRNA ；6)其能够发生聚集和融合，形成融合体；和7)其具有参与和/或促进组织再生和伤口修复的能力。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体能够从动物例如哺乳动物(包括人和小鼠)的血液和骨髓获得。在进一步优选的实施方案中，本发明的RNA胞体能够通过以下方法获得I)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞；2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落；3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤；4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，RNA胞体集落释放出RNA胞体，由此从培养物中获得RNA胞体。在进一步优选的实施方案中，在上述方法的步骤4)中，使用能够特异性结合c-kit的制剂例如C-kit抗体来从培养物中富集和/或分离RNA胞体。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体的特征在于，其能够针对c-kit标记的存在而进行富集和/或分离。在进一步优选的实施方案中，可以通过使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体来富集和/或分离本发明的RNA胞体。在另一个方面，本发明涉及由上面所定义的RNA胞体融合而形成的融合体。在另一个方面，本发明还涉及包含上面所定义的RNA胞体以及上面所定义的RNA胞体融合体的RNA胞体集落。在一个优选的实施方案中，本发明的RNA胞体集落可以通过下述方法获得I)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞； 2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落；3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤；4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，从而获得RNA胞体集落。在另一个方面，本发明还涉及包含上面所定义的RNA胞体和/或上面所定义的融合体和/或上面所定义的RNA胞体集落的组合物。在另一个方面，本发明还涉及上面所定义的RNA胞体和/或上面所定义的融合体和/或上面所定义的RNA胞体集落和/或上面所定义的组合物用于组织再生和伤口修复的用途。在另一个方面，本发明还涉及上面所定义的RNA胞体和/或上面所定义的融合体和/或上面所定义的RNA胞体集落和/或上面所定义的组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于组织再生和伤口修复。在另一个方面，本发明还涉及用于促进组织再生和伤口修复的方法，其包括将上面所定义的RNA胞体和/或上面所定义的融合体和/或上面所定义的RNA胞体集落和/或上面所定义的组合物施用给有此需要的受试者。在本发明的优选实施方案中，组织包括但不限于，上皮组织，心肌组织，神经组织和骨组织。在另一个方面，本发明还涉及分离上面所定义的RNA胞体和上面所定义的RNA胞体集落的方法，其包括I)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞；2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落；3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤；4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，RNA胞体集落释放出RNA胞体，由此从培养物中获得RNA胞体和RNA胞体集落。在进一步优选的实施方案中，在上述方法的步骤4)中，使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体来从培养物中富集和/或分离RNA胞体。如上文所描述的，可以通过静置并获取沉淀(即，通过重力沉降)来获得本发明的RNA胞体和RNA胞体集落。因此，类似地，还可以使用其他沉降方式，例如离心(例如超速离心和梯度离心)等方式来获得本发明的RNA胞体和RNA胞体集落。在另一个方面，本发明还涉及富集上面所定义的RNA胞体的方法，其包括使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体,就c-kit标记的存在进行富集。在另一个方面，本发明还涉及使用上文所述的方法获得的RNA胞体和RNA胞体集落。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。


图I展示了从血液中分离得到的RNA胞体的c-kit和VASA表达情况，如使用免疫荧光染色法所测定的。从图中可以看出，表达c-kit的颗粒也表达VASA，c-kit和VASA这两种标记共定位。这表明本发明的RNA胞体同时表达c-kit和VASA这两种标记。标尺为5 μ m0图2展示了 RNA胞体的VASA表达情况以及其所包含的核物质，其中图2B为图2A的局部放大图(图2A放大倍数为2000x，图2B放大倍数为4000x)。从图中可以看出，表达VASA的颗粒(即，RNA胞体)聚集在一起，具有相对较微弱的DAPI染色，然而DNA染色并不与VASA染色共定位。这表明，本发明的RNA胞体所含的核物质主要是RNA，而DNA含量很低。此外，图2显示，RNA胞体可以以聚集的形式存在。标尺为5 μ m。图3展示了 RNA胞体中的核物质的分析结果，总RNA分析表明RNA胞体中包含大量的miRNA (超过50% )及小RNA，但是不含核糖体RNA。图4展示了 RNA胞体的两种典型的类型第一种类型(图4A，标尺为IOOnm)包含由于致密性不同而可区分的中心区域和外层区域，并且中心区域相对于外层区域而言，较不致密；第二种类型(图4B，标尺为IOOnm)的中心区域和外层区域的区别较不明显，二者
的致密性基本一致。图5A显示了从血液新鲜分离的RNA胞体培养物中RNA胞体集落的形态；图5B为标准干细胞集落，图5A和5B均为40 X物镜下的观察结果。图6显示了在透射电镜下(4000 X)观察到的RNA胞体集落。从图中可以看出，该RNA胞体集落的外围中不仅包含单独的、未发生融合的RNA胞体，而且包含RNA胞体的融合体(如箭头所示)。标尺为O. 5 μ m。图7进一步显示RNA胞体集落中的典型的RNA胞体的融合体(如箭头1_3所示)。这些融合体的体积远大于单个的RNA胞体。标尺为2 μ m。图8显示了图7的箭头1-3所指示的融合体的详细形态学特征(分别对应于图8A-8C)。特别地，图8A展示了图7中箭头I所指示的融合体，该融合体具有致密的外层区域和中心区域，然而二者的界限并不明显(标尺为200nm);图SB展示了箭头2所指示的融合体，该融合体具有致密的外层区域和中心区域，并且二者的界限较为明显，外层区域比中心区域更致密(标尺为IOOnm);图SC展示了箭头3所指示的融合体，该融合体也具有外层区域和中心区域，并且在中心区域还具有环形结构(标尺为lOOnm)。从图8可以看出，这些融合体可能是由不同类型的RNA胞体融合而成的。不同类型的RNA胞体所形成的融合体的形态也不相同。图9展示了由第一种类型的RNA胞体融合形成的RNA胞体融合体。融合后，RNA胞体的外层区域融合形成最终的外膜，中心区域物质经历降解和重排，标尺为200nm。图10展示了由第二种类型的RNA胞体融合形成的RNA胞体融合体。标尺为O. 5 μ m0图11和12分别展示了由第一或第二种类型的RNA胞体形成的融合体的成熟过程融合体的外膜由RNA胞体的外膜互相融合形成，并且在成熟过程中逐渐变薄；中心区域(核物质)则经历了降解和重排的过程，并且进一步聚集形成致密颗粒，这些颗粒主要出现在外膜的内侧部位。在图11中，图A和D的标尺为O. 5μπι，图B和C的标尺为O. 2μπι。在 图12中，图A的标尺为lOOnm，图B的标尺为O. 5 μ m，图C的标尺为O. 2 μ m。图13展示了典型的成熟的融合体，其厚厚的外膜层不复存在，代之以很薄的外膜，并且中心区经历了降解和重排，核物质颗粒进一步增加，并且主要分布在靠近膜内侧的区域。标尺为O. 2 μ m。图14A展示了成熟的融合体的免疫荧光染色结果；图14B展示了成熟的融合体的电镜观察结果。从图14A可以看出，在成熟的融合体中，DNA含量显著增加，其主要分布在外膜内侧处，并且在融合体中心区域形成一个核样结构，整个结构与电镜下观察到的成熟融合体的结构(图14B，箭头所示为核样结构)非常一致。图14A的标尺为5 μ m，图14B的标尺为O. 2 μ m。图15显示了创伤后3天伤口处的情况，其中显示，在创伤后3天，携带VASA标记和GFP标记的RNA胞体就已经转移并聚集到伤口处，再生为真皮和表皮组织。图15A-15C分别展示了创伤后3天观察到的VASA(N) (A) ,GFP(B)和DAPI (C)的染色结果。图IOT为图15A-15C合并后的图像，其显示携带VASA标记和GFP标记的RNA胞体位于未愈的表皮层。图15E是图15C中方框区域的放大图像。图MD的标尺为50 μ m，图15E的标尺为20 μ m。图16显示了创伤后5天伤口处的情况，其中显示，携带GFP标记的RNA胞体分布于皮肤毛囊的外围(箭头所示)以及毛囊的基质区域。在创伤后5天，在荧光显微镜下利用抗GFP抗体检测GFP的表达，并利用DAPI染色检测核物质。在低放大倍数下(上排图)可以观察到，GFP阳性细胞分布于平滑肌的上方和损伤上皮组织的下方(箭头所示)。在共聚焦显微镜下(下排图)可以观察到，GFP阳性细胞位于毛囊的外围和毛囊基质区域(箭头所示)。在图16中，上排图的标尺为200 μ m,下排图的标尺为50 μ m。
具体实施例方式现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。实施例中未注明具体条件者，按照本领域通常已知的常规条件(参见例如照J. Sambrook等人，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc. , 1995)或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。一般方法
I.流式细胞术(FACS)用PBS洗涤获得的RNA胞体，并用I %正常马血清(NHS)封闭I小时；然后在含1%NHS的PBS中用I : 50或I : 100稀释的抗体(一抗)孵育RNA胞体30min ;然后用含I %NHS的PBS进行洗涤，并用FITC或PE偶联的二抗在4°C孵育30min。在进一步用PBS洗涤后，利用流式细胞仪例如Vantage SE或者DiVa Vantoo FACS进行分析。流式细胞数据可通过CellQuest (BD公司)软件获得并可用FlowJo软件进行分析。2.免疫荧光染色RNA胞体的免疫荧光染色培养的RNA胞体经过固定、洗涤、封闭后，与以I : 50-1 200稀释的抗体(一抗)在4°C孵育过夜。孵育后，进行洗涤，然后将RNA胞体与荧光标记偶联的二抗反应I小 时。洗涤后，RNA胞体用DAPI复染，然后用共聚焦显微镜或标准荧光显微镜进行观察。组织的免疫荧光染色收集创伤后1-7天的小鼠的伤口组织，进行固定，并包埋于OCT复合物中以做成冰冻切片。封闭切片，然后将切片与以I : 100稀释的抗体(一抗)在4°C反应过夜。洗涤后，切片用DAPI复染，并用共聚集显微镜或标准荧光显微镜进行观察。所有对照组不用一抗处理。获得的图像用Volocity软件进行分析。3.电子显微镜观察RNA胞体用2%的戊二醛和4%的多聚甲醛在pH7. 3的二甲砷酸钠缓冲液中在室温下固定30min。在用二甲砷酸钠缓冲液洗涤后，向RNA胞体加入冰上预冷的、1%的四氧化锇，并在4°C轻摇2小时。在用水洗涤后，向RNA胞体加入I %乙酸铀酰，孵育过夜。然后，RNA胞体用系列稀释的乙醇脱水，并包埋于环氧树脂Epon中。然后，进行超薄切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅二次染色，并在电镜下进行观察。实施例I. RNA胞体的分离和培养在本实施例中，示例性说明了 RNA胞体的分离和培养。取Balb/c小鼠的血液，加入红细胞裂解液(155mM NH4Cl, IOmMKHCO3和O. ImMEDTA)孵育15min，血液与红细胞裂解液的体积比为约I : 10。孵育后，将裂解产物的上层液体部分移入新容器内，并且裂解产物的底层沉淀部分用PBS(磷酸盐缓冲液)洗2遍(SP，加入PBS，静置2-3min，然后小心地吸去上层液体部分)。将得到的底层沉淀部分置于培养基(I : I的DMEM/F12培养基(购自Invitrogen公司)，补充有20%的胎牛血清)中进行培养。培养条件为37°C，5% CO2，每2-3天更换培养基一次。经过一段时间的培养后，即可获得RNA胞体。当RNA胞体达到汇合状态时，用胰酶进行消化，并进行传代。由于RNA胞体在表面特异性表达标记c-kit (即，其是c-kit阳性的)，因此，可以使用本领域公知的分选技术，就c-kit标记的存在进一步富集和分离RNA胞体。例如,可以使用流式细胞术或磁珠分离技术，就c-kit标记的存在进一步富集和分离RNA胞体。在本实施例中，示例性地通过磁珠分离技术进一步富集和分离RNA胞体。磁珠分离方法参照生产商(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)的说明书进行。简言之，将上述得到的底部沉淀部分用封闭液封闭，然后与抗c-kit抗体(Santa Cruzbiotechnology,CA)孵育 30min,接着与抗兔 IgG 偶联的磁珠(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)在4°C孵育30min。然后，利用磁场分离磁珠并用PBS清洗磁珠三次。最后，用洗脱液将RNA胞体从磁珠上洗脱。分离效率可以进一步通过荧光染色和流式细胞术(FACS)来验证。结果显示，通过磁珠分离技术，可有效分离和富集表达c-kit的RNA胞体(参见图I)。实施例2. RNA胞体表达的标记如实施例I所述，用抗c-kit抗体分离和富集RNA胞体。培养一周后，使用上文描述的免疫荧光染色法检查RNA胞体中c-kit和VASA的表达情况。免疫荧光染色的结果参见图I。从图I中可以看出，表达c-kit的颗粒也表达VASA, c_kit和VASA这两种标记共定位。这表明本发明的RNA胞体同时表达c-kit和VASA这两种标记。进一步，通过DAPI染色和DNA染色检查RNA胞体的核物质(参见图2A和图2B)。结果显示，表达VASA的颗粒(即，RNA胞体)具有微弱的DAPI染色，然而DNA染色并不与VASA染色共定位。这表明，本发明的RNA胞体所含的核物质主要是RNA，而DNA含量很低。
此外，从图I和2可以看出，表达VASA的颗粒可以以聚集的形式存在，这表明本发明的RNA胞体在培养条件下能够发生聚集。还使用FACS检测了本发明的RNA胞体所表达的其他标记。结果显示，本发明的RNA 胞体不表达 E-cadherin，并且低表达 CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、Scal 和 HiLi (另一种由原始生殖细胞表达的特异蛋白)。实施例3. RNA胞体的核物质为进一步表征本发明的RNA胞体，收集培养扩增后的RNA胞体并用Trizol方法提取总RNA,然后根据制造商的说明书,进一步使用Bioanalyzer (Agilent Technology)对RNA的成分进行了分析。结果显示,本发明的c-kit阳性的RNA胞体中包含大量的miRNA (超过50% )(参见图3)。这与实施例2的免疫荧光染色结果相一致RNA胞体所含的核物质主要是RNA。进一步,根据制造商的说明书,使用micro-RNA芯片(Affymetrix, CA)对RNA胞体所包含的miRNA进行分析。结果表明，RNA胞体所包含的miRNA的序列与人和小鼠的miRNA序列相匹配(参见表I)。表I :RNA胞体所包含的miRNAI miRNA-人miRNA-小鼠
权利要求
1.分离的RNA胞体，其包含由膜包被的RNA，具有自我更新的能力，且直径为O.I-Iym0
2.权利要求I的RNA胞体，其是c-kit阳性的。
3.权利要求I或2的RNA胞体，其是VASA阳性的。
4.权利要求1-3任一项的RNA胞体,其是E-cadherin阴性的。
5.权利要求1-4任一项的RNA胞体，其表达⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、⑶34、HiLi和Scal中的一种或多种。
6.权利要求1-5任一项的RNA胞体，其所包含的RNA占总核酸的50%以上，并且在所述RNA中，有至少40 %是miRNA。
7.权利要求6的RNA胞体，其中所述miRNA包括表I所列的miRNA的一种或多种。
8.权利要求1-7任一项的RNA胞体，其能够发生聚集和融合，形成融合体。
9.权利要求8的RNA胞体，其中所述融合体包含膜和内含物，且能够经历下述过程所述膜变薄，所述内含物中的DNA增加，而RNA减少。
10.权利要求1-9任一项的RNA胞体，其具有参与和/或促进组织再生和伤口修复的能力。
11.权利要求1-10任一项的RNA胞体，其能够从动物例如哺乳动物(包括人和小鼠)的血液和骨髓获得。
12.权利要求1-11任一项的RNA胞体，其能够通过以下方法获得 1)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞； 2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落； 3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤； 4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，RNA胞体集落释放出RNA胞体，由此从培养物中获得RNA胞体。
13.权利要求1-12任一项的RNA胞体，其能够针对c-kit标记的存在而进行富集和/或分离， 例如，可以通过使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体来富集和/或分离所述RNA胞体。
14.由权利要求1-13任一项的RNA胞体融合而形成的融合体。
15.包含权利要求1-13任一项的RNA胞体以及权利要求14的融合体的RNA胞体集落，其例如可以通过下述方法获得 1)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞； 2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落； 3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤； 4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，从而获得RNA胞体集落。
16.包含权利要求1-13任一项的RNA胞体和/或权利要求14的融合体和/或权利要求15的RNA胞体集落的组合物。
17.权利要求1-13任一项的RNA胞体和/或权利要求14的融合体和/或权利要求15的RNA胞体集落和/或权利要求16的组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于组织再生和伤口修复。
18.分离权利要求I的RNA胞体和权利要求15的RNA胞体集落的方法，其包括 1)提供动物(例如哺乳动物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的细胞，例如使用细胞裂解液裂解血液中的细胞； 2)静置至少5分钟(例如10分钟，15分钟或更长)，然后去除裂解产物的上层液体部分，而保留底层沉淀部分，该底层沉淀部分包含RNA胞体集落； 3)任选地洗涤底层沉淀部分，例如使用PBS进行洗涤； 4)将所述底层沉淀部分置于培养基中进行培养，RNA胞体集落释放出RNA胞体，由此从培养物中获得RNA胞体和RNA胞体集落。
19.权利要求18的方法，其中在步骤4)中，使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体来从培养物中富集和/或分离RNA胞体。
20.富集权利要求I的RNA胞体的方法，其包括使用能够特异性结合c-kit的制剂例如c-kit抗体,就c-kit标记的存在进行富集。
21.通过权利要求18的方法获得的RNA胞体和RNA胞体集落。
全文摘要
本发明涉及一种可再生的RNA胞体，其包含RNA并且表达通常只在原始精母细胞中表达的RNA结合蛋白VASA。这些RNA胞体还表达c-kit，但不是表达在胞体表面，而是表达在胞体内RNA的部位。此外，这些RNA胞体不表达E-cadherin。本发明还涉及上述RNA胞体的用途，其例如可以用于促进组织再生和伤口修复(例如通过静脉注射的方式)，因为这些胞体具有进一步分化成组织特异细胞的潜能。本发明还涉及上述RNA胞体用于制备药物组合物的用途，以及包含上述RNA胞体的药物组合物。
文档编号A61P17/02GK102876666SQ201110197680
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者孔五一 申请人:内蒙古弘泰医学科技有限公司