专利名称：聚乙二醇化和双糖基化的红细胞生成素的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的双糖基化红细胞生成素变体，其生产的方法和用途及其药物组合物。
背景技术：
红细胞生成是红细胞的产生，其用于补偿细胞的破坏。红细胞生成是受控的生理学机制，其使得足够的红细胞能够用于适合的组织氧合作用。天然存在的人红细胞生成素(hEPO)是在肾中产生的包含165个氨基酸残基的糖蛋白，并且是刺激红细胞产生的体液血浆因子。人EPO刺激骨髓中的定向红系祖先细胞分裂和分化。人EPO通过与红系前体细胞上的受体结合发挥它的生物活性。天然存在的人红细胞生成素是酸性糖蛋白，其在血浆中以低浓度存在以刺激由于衰老而损失的红细胞的更替。
已经利用重组DNA技术(Egrie，J.C.等，Immunobiol.72(1986)213-224)生物合成制造了红细胞生成素，而且该红细胞生成素是插入中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)中表达的克隆人EPO基因的产物。天然存在的人EPO首先翻译为具有166个氨基酸的带有精氨酸166的多肽链。在翻译后的修饰中，通过羧肽酶切下精氨酸166。在SEQ ID NO1和SEQID NO2中所示是人EPO的一级结构(165个氨基酸和166个氨基酸)。在Cys7-Cys161和Cys29-Cys33间有两个二硫键。没有糖部分的人EPO多肽链的分子量是18,236 Da。在完整EPO分子中，碳水化合物基团占分子量的约40％(Sasaki，H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076)。
因为红细胞生成素在红细胞形成中是必要的，所以该激素在以低或缺陷的红细胞产生为特征的血液疾病治疗中是有用的。临床上，EPO用于例如慢性肾衰竭患者(CRF)及AIDS和经历化疗的癌症患者中以治疗贫血(Danna，R.P.等，InMB，Garnick编辑.Erythropoietin in ClinicalApplications-AN International Perspective.New York，NYMarcel Dekker；1990，301-324页)。然而，目前可用的蛋白质治疗剂，如EPO的生物利用率受它们短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性的限制。这些缺点阻止了它们发挥出最大的临床潜力。
在美国专利号4,835,260；WO 94/25055；WO 94/24160；WO 94/02611；WO 95/05465；和现有技术的许多其它出版物中提出了EPO氨基酸序列的修饰。
人尿来源的红细胞生成素和(哺乳动物细胞中表达的)重组红细胞生成素包含三个N-连接和一个O-连接的寡糖链，它们一起占糖蛋白总分子量的约40％。在位于24、38和83位置的天冬酰胺残基上存在N-连接的糖基化，而在位于126位置的丝氨酸残基上存在O-连接的糖基化(Lai等，J.Biol.Chem.261(1986)3116；Broudy，V.C.等，Arch.Biochem.Biophys.265(1988)329)。已经证明寡糖链被末端唾液酸残基修饰。
酶促处理除去糖基化红细胞生成素的所有唾液酸残基后引起了体内活性的丧失但是不影响体外的活性(Lowy等，Nature 185(1960)102；Goldwasser，E.等，J.Biol.Chem.249(1974)4202-4206)。当脱唾液酸红细胞生成素与肝脏脱唾液酸糖蛋白结合蛋白质相互作用时脱唾液酸红细胞生成素会从循环中被快速清除掉，由此解释了上述行为(Morrell等，J.Biol.Chem.243(1968)155；Briggs，D.W.等，Am.J.Physiol.227(1974)1385-1388；Ashwell，G.和Kawasaki，T.，Methods Enzymol.50(1978)287-288)。因此，仅仅当红细胞生成素被唾液酸化以避免它与肝脏结合蛋白质结合时，红细胞生成素才具有体内生物活性。
红细胞生成素寡糖链中其它成分的作用尚未十分明确。已经证明，与糖基化形式比较，部分去糖基化的红细胞生成素具有大大降低的体内活性，但是保留了体外活性(Dordal，M.S.等，Endocrinology 116(1985)2293-2299)。然而，在另一个研究中，通过诱变糖基化位点天冬酰胺或丝氨酸残基使N-连接或O-连接寡糖链单独或一起去除则急剧地降低了哺乳动物细胞中产生的改变的红细胞生成素的体外活性(Dube，S.等，J.Biol.Chem.263(1988)17516-17521)。
已经利用寡核苷酸定向诱变制备了缺乏特定糖基化位点的EPO结构突变体(Yamaguchi，K.等，J.Biol.Chem.266(1991)20434-20439；和Higuchi，M.等，J.Biol.Chem.267(1992)7703-7709)。Lee-Huang，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 61(1984)2708-2712；和美国专利号5,641,663描述了大肠杆菌(E.coli)中非糖基化EPO的克隆和表达。
EP 0 640 619涉及包含如下氨基酸序列的人红细胞生成素类似物，该序列包含至少一个添加的糖基化位点。与人红细胞生成素相比，该添加的糖基化位点可以导致更多数量的碳水化合物链和更高的唾液酸含量。此外，也提供了包含如下氨基酸序列的红细胞生成素类似物，该氨基酸序列包含至少一个糖基化位点的重排。也包括含有一个或多个氨基酸添加的类似物，所述氨基酸添加到红细胞生成素羧基末端，其中添加提供了至少一个糖基化位点。
WO 01/02017中描述了糖基化EPO的PEG化。这种分子显示了改进的生物学活性。WO 00/32772和Francis，G.E.等，Int.J.Hem.68(1988)1-18描述了聚乙二醇修饰的非糖基化EPO。WO 00/32772的分子在位置166也被修饰。这种分子被描述为不引起血细胞比容的显著增加。PEG-聚合物部分由1-5个聚合物链组成。WO 00/32772提出通过降低pH和减少PEG胺基团的比率控制PEG化的程度和位点。反应在pH7和PEG-醛∶氨基为1.5∶1摩尔比时进行，优选地与N-末端α氨基反应。
尽管已知EPO的大量修饰，但是还需要具有改变的特性，特别是具有改变的清除率的EPO突变蛋白质，和用于生产该突变蛋白质的简单且可重复的方法。
发明概述本发明提供了一类新EPO突变蛋白质。本发明的EPO突变蛋白质具有引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性。
本发明提供了在Asn24，Asn38，Asn83保留潜在N-糖基化位点的红细胞生成素突变蛋白质，该突变蛋白质在Asn38和Asn83被N-糖基化而在Asn24未被N-糖基化，并且优选地，在N-末端氨基和/或Lys20的ε氨基上连接聚(乙二醇)基团(PEG)，优选地，连接烷氧基聚(乙二醇)基团，更优选地，连接低级甲氧基聚(乙二醇)基团。
本发明的突变蛋白质有与EPO相同的用途。特别地，本发明突变蛋白质可以通过刺激骨髓中定向红系祖先细胞的分裂和分化用于治疗患者。EPO以相同的方式用于治疗患者。
本发明也包括人类贫血的治疗方法和突变蛋白质在药剂，优选用于这种治疗的药剂的制备中的用途。
本发明也包括制备本发明红细胞生成素突变蛋白质的方法，该方法包括产生由氨基酸26-165(EPO 26-165)组成的糖基化EPO片段，和随后融合所述片段与非糖基化但是优选PEG化的由氨基酸1-28(EPO 1-28)组成的EPO片段。
发明的详细描述术语“红细胞生成素”(EPO)指有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2序列的蛋白质，或者基本与其同源的蛋白质或多肽，它们的生物学特性涉及刺激红细胞产生和刺激骨髓中定向红系祖先细胞分裂和分化。
术语“基本同源”意指特定的对象序列，例如突变序列由于一个到五个替换、缺失或添加而不同于参考序列，但所述差异的净结果不会引起参考和对象序列间出现不利的功能不相似性。然而，如上所述，“基本同源”保留了潜在的糖基化位点Asn24，Asn38和Asn83。
人EPO有一个O-糖基化位点(在SEQ ID NO1的Ser126)和三个N-糖基化位点(在SEQ ID NO1的Asn24，Asn38和Asn83)。这些位点的糖基残基被唾液酰化，并且它们对于体内半衰期和随后对于EPO的效力是重要的。除去Asn24糖基化位点导致具有改进的体内效力的EPO突变蛋白。然而，根据本领域现有技术，只有通过将Asn24置换为不能被糖基化的另一氨基酸，才能产生这种EPO突变蛋白质。因此，由于在序列敏感位置有修饰的氨基酸，这些突变蛋白质不同于天然存在的EPO。例如，Nimtz，M.等，Eur.J.Biochem.213(1993)39-56；Sasaki，H.等，Biochemistry 27(1988)8618-8626；Delorme，C.等，Biochemistry 31(1992)9871-9876；Fibi，M.R.等，Blood 85(1995)1229-1236；和WO 99/11781(也参见EP 0 411 678；Takeuchi，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)7819-7822；EP 0 427189；EP 0 409 113；Dube，S.等，J.Biol.Chem.263(1988)17516-17521；Yamaguchi，K.等，J.Biol.Chem.266(1991)20434-20439；EP 0 640 619；和Fibi，M.R.等，Applied Microbiol.Biotechnol 35(1991)622-630)描述了这种具有修饰氨基酸序列和修饰糖基化的EPO突变蛋白质。
因此，根据现有技术，只要通过缺失、修饰或置换Asn24才可以阻止该氨基酸的糖基化。现有技术中从没有描述过保留了氨基酸Asn24，Asn38和Asn83但仅在Asn38和Asn83糖基化而在Asn24没有糖基化的红细胞生成素突变蛋白质，并且没有教导如何去产生这种分子。
本发明提供了在从分子的Cys29开始的C-末端部分中保留了糖基化，优选天然糖基化而在不超过Gly28的N-末端部分中未糖基化的EPO突变蛋白质的简单生产方法，由此，如果期望，还可以非常容易地以多种方式修饰所述N-末端部分。这种修饰可以是，例如可重复的且确定的侧链如聚乙二醇连接。
术语“N-末端EPO片段”或“EPO 1-28”指基本由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2氨基酸第1-28位组成的EPO片段。如上所述，只要没有不利地影响连接分子中EPO的药学特性和只要保留了Asn24，并且在片段的序列C-末端保留Gly28，该术语也包括氨基酸序列中具有轻微修饰的片段(不超过约2个交换、添加、缺失)。
术语“C-末端EPO片段”或“EPO 29-165”指基本由SEQ ID NO1的氨基酸第29-165位或SEQ ID NO2的氨基酸第29-166位组成的EPO片段。如上所述，只要基本没有影响连接分子中EPO的药学特性和只要保留了Asn38和Asn83，并且Cys29被保留为所述片段的N-末端氨基酸，该术语也包括氨基酸序列中具有轻微修饰的片段(不超过约3个交换、添加、缺失)。
根据本发明，在真核细胞中重组产生从Cys29开始的红细胞生成素C-末端部分，由此糖基化Asn38和Asn83，而通过化学反应体外合成从开始到Gly28的N-末端部分。
因此，本发明提供了EPO突变体产生的方法，所述方法的特征在于通过Gly28和Cys29间的化学连接来连接由保留了Asn24和Gly28的EPO氨基酸1-28组成的N-末端EPO片段和由在Asn38和Asn83糖基化的EPO氨基酸29-165或166组成的C-末端EPO片段，并分离EPO突变蛋白质。
通过重组DNA技术在真核生物细胞中，例如在CHO，BHK或HeLa细胞系中表达，或者通过内源基因激活，即通过内源基因激活表达红细胞生成素糖蛋白，可以制备重组C-末端EPO片段。根据本发明，优选的红细胞生成素突变蛋白质基于人EPO序列。更优选地，人EPO具有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列，最优选为具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人EPO。
根据WO 99/05268和EP 1 037 821，优选采用与产生全长EPO相同的方式在CHO细胞中产生C-末端EPO片段，或者也优选通过人细胞的内源基因激活来产生C-末端EPO片段。
N-末端EPO片段可以通过利用分步固相方法合成，并且从树脂上切割下来并去保护。该片段可以通过色谱法，例如通过高效液相色谱法纯化，并且通过例如在Schnoelzer，M.等，Int.J.Pept.Protein Res.40(1992)180-193；Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779；和Schnoelzer等，G.G.Fields(编辑)，固相肽合成，Methods Enzymology 289(1977)，(参见全卷)中所述的离子喷射质谱法表征。该片段的C-末端优选含有用于连接C-末端片段的Cys29的硫代羧基酯基团。
只要C-末端片段在氨基末端具有半胱氨酸残基，优选Cys29，则可以以简单的方法，通过天然化学连接进行N-末端和C-末端EPO片段的连接(Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779)。根据该原则，N-末端片段在α-羧基基团处含有硫酯，并且受到C-末端片段的氨基末端Cys残基侧链的亲核攻击。开始的硫酯连接产物经历快速的分子内反应，产生在连接位点具有天然肽键的产物。在Dawson，P.E.，和Kent，S.B.H.，AnnualReview of Biochemistry 69(2000)923-960中综述了这种肽的化学连接方法。
根据Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779，或者Dawson，P.E.等，J.Am.Chem.Soc.，119(1997)4325-4329，优选在连接期间将N-末端EPO片段和C-末端EPO片段溶解在变性溶液，如盐酸胍或脲中，并且进行连接。
通过常规方法如亲和层析，大小排阻层析和离子交换层析进行连接的EPO突变蛋白质的纯化。
术语“PEG化”意指在多肽N-末端和/或赖氨酸20处聚乙二醇残基的共价连接。蛋白质的PEG化在现有技术中是广泛公知的，并且，例如Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417综述了蛋白质的PEG化。可以利用不同官能基团和具有不同分子量的聚乙二醇、直链和支链的PEG及不同的连接基团连接PEG(也参见Francis，G.E.等，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。
例如WO 00/44785中所述，可以在水溶液中利用PEG化试剂，优选地，利用NHS-激活的5至40kDa分子量的直链或支链PEG分子进行N-末端片段的PEG化。根据Lu，Y.等，Reactive Polymers 22(1994)221-229，也可以在固相中进行PEG化。
这些方法产生了在Lys20的ε-氨基上和/或在N-末端氨基上PEG化的N-末端EPO片段。根据Felix，A.M.等，ACS Symp.Ser.680(Poly(ethyleneglycol))(1997)218-238，可以在N-末端氨基酸上进行选择性PEG化。在固相合成期间，通过Nα-PEG化氨基酸衍生物和肽链N-1末端氨基酸的偶联可以获得选择性N-末端PEG化。在固相合成期间，通过Nε-PEG化赖氨酸衍生物和生长链的偶联可以进行侧链PEG化。而按照以上固相合成中所述方法或通过在溶液相合成中将激活的PEG试剂应用到氨基去保护的肽上，可以获得混合的N-末端和侧链PEG化。适合的PEG衍生物是激活的PEG分子，其优选具有从约5到约40kDa，更优选从约20到约40kDa，最优选约30kDa的平均分子量。PEG衍生物可以是直链或支链PEG。从Shearwater Polymers(Huntsville，AL，U.S.A.；www.swpolymers.com)可以获得适于用在PEG-蛋白质和PEG-肽缀合物制备中的各种PEG衍生物。
激活的PEG衍生物是现有技术已知的，并且，例如在Morpurgo，M.等，J.Bioconj.Chem.7(1996)363-368中对PEG-乙烯砜进行了描述。直链和支链PEG适于PEG化片段的制备。反应性PEG试剂的例子是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜(m优选是从约450到约900的整数，R是直链或支链的、具有1到6个碳原子的低级烷基如甲基、乙基和异丙基等，其中优选甲基) 或 这些碘激活的物质的应用是本领域已知的并且Hermanson，G.T.在Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148中进行了描述。
最优选地，利用(烷氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺，如甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺)(MW 30000；Shearwater Polymers，Inc.))，通过N-羟基琥珀酰亚胺酯活化PEG， 或
其中R和m如上所定义。
术语“烷氧基”指烷基醚基团，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，优选甲氧基，其中术语“烷基”意指包含最多4个碳原子的直链或支链烷基基团。
通过本领域已知的方法，例如柱层析可以完成PEG化N末端片段的进一步纯化，包括单或双PEG化种类的分离。
此外，本发明涉及包含EPO突变蛋白质或者如上所定义的组合物和药物学上可接受的赋形剂，如缓冲液的含水组合物和药物组合物，还涉及如上定义的EPO突变蛋白质或组合物在药物制备中的用途，所述药物用于慢性肾衰竭患者(CRF)和AIDS中治疗或预防贫血相关疾病，和用于化疗癌症患者的治疗。此外，本发明涉及在慢性肾衰竭患者(CRF)、AIDS和进行化疗的癌症患者中对贫血相关疾病进行预防和/或治疗的方法，该方法包括步骤以治疗有效量给患者施用上述组合物。
术语“治疗有效量”是对于引起骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性而言所必需的本发明红细胞生成素突变蛋白质的量。红细胞生成素突变蛋白质的确切量可以根据一些因素，如所治疗疾病的确切类型、所治疗患者的病情和组合物中的其它组分进行优化。可以按照以各种方式向患血液疾病的人类患者给药时的有效浓度，配制含有红细胞生成素的药物组合物，所述血液疾病以低或缺乏的红细胞产生为特征。红细胞生成素糖蛋白产品的平均治疗有效量可以变化，并且特别应该以有资格医师的建议和处方为基础。
而且，本发明涉及任何时候通过上述方法制备的上述EPO突变蛋白质和组合物，也涉及用于在慢性肾衰竭患者(CRF)、AIDS和进行化疗的癌症患者中治疗贫血相关疾病的上述EPO突变蛋白质和组合物。
可以根据现有技术纯化本发明的EPO片段和EPO突变蛋白质。
在EP-A 0 267 678中描述了用于EPO纯化的S-琼脂糖凝胶上的离子交换层析，C8柱上的制备型反相HPLC和凝胶过滤层析。在这方面，通过S-琼脂糖凝胶上的高速流动离子交换层析可以代替凝胶过滤层析。也建议在离子交换层析前在Blue Trisacryl柱上进行染色层析。Nobuo，I.等，J.Biochem.107(1990)352-359也描述了重组EPO纯化的方法。然而，在该方法中，在纯化前，用Tween20、苯甲磺酰氟、乙基马来酰亚胺、胃蛋白酶抑制剂A、硫酸铜和草氨酸处理EPO。
可以通过本领域已知的各种测定法测定本发明EPO或EPO突变蛋白质的比活性。本发明的纯化EPO蛋白质的生物学活性是指通过给人类患者注射给药EPO蛋白质，与未注射或对照组对象相比引起骨髓细胞增加的网织红细胞和红细胞生产。通过Pharm.Europa Spec.Issue ErythropoietinBRP Bio 1997(2)的方法可以测定根据本发明获得并纯化的EPO突变蛋白质或其片段的生物学活性。
在实施例5中描述了测定EPO活性的另一种生物学测定法，即，正常红细胞性贫血小鼠测定法。
通过本领域已知的方法，本发明制备的红细胞生成素突变蛋白质可以与药物学可接受载体或赋形剂一起制备成适于注射的药物组合物。例如在WO 97/09996，WO 97/40850，WO 98/58660，和WO 99/07401中描述了适合的组合物。其中，用于配制本发明产品的优选药物学上可接受的载体是人血清白蛋白、人血浆蛋白质等。可以在pH 7，含有渗涨剂，例如132mM氯化钠的10mM磷酸钠/钾缓冲液中配制本发明化合物。可选地，药物组合物可以含有防腐剂。药物组合物可以含有不同量的红细胞生成素，例如10-1000μg/ml，例如50μg或者400μg。
本发明红细胞生成素糖蛋白产品的给药将导致人体中红细胞的形成。因此，红细胞生成素糖蛋白产品的给药补充了对红细胞产生有重要作用的这种EPO蛋白质。可以按照通过各种方式施用于血液疾病人类患者时的有效浓度，配制含有红细胞生成素糖蛋白产品的药物组合物，所述血液疾病完全或者作为疾病或病况的一部分以低或缺陷的红细胞产生为特征。可以通过注射，如通过皮下或静脉内注射给药药物组合物。红细胞生成素糖蛋白产品的平均量可以变化，且特别应该以有资格医师的建议和处方为基础。缀合物的确切量可以根据一些因素，如所治疗疾病的确切类型、所治疗患者的病况和组合物中的其它组分来优化。例如，可以每kg体重给药0.01到10μg，优选地，每kg体重0.1到1μg，例如每周一次。
在本申请中，参考了各种公开出版物。为了更充分描述现有技术状态，这里并入这些出版物中的记载为参考。
提供了下面的实施例，参考文献和序列表以帮助理解本发明，在所附权利要求书中阐述了本发明真正的范围。可以在不背离本发明精神的情况下对所述方法进行修改，这是可以理解的。
实施例1PEG化EPO(1-28)的产生Nα-PEG-CH2-CO-(Lys(PEG-CH2-CO)20)-EPO(1-28)αCOSBzl的合成和单PEG化组分的分离。
按文献中所述(参见，Schnolzer，M.等，Int.J.Pept.Protein Res.40(1992)180；Schnlzer，P.M.等，G.G.Fields编辑，固相肽合成，Meth.Enzymol.289(1997)，全卷)，利用逐步固相方法合成肽，从树脂上切下并去保护，通过高效液相色谱纯化，并且通过离子喷射质谱法进行表征，其中按照Lu，W.等，J.Am.Chem.Soc.，118(1996)8518-8523的途径形成了C-末端苄基硫酯。
1.1 PEG-CH2-CO-NHS的合成如Lu，Y.A.，Int.J.Pept.Protein Res.43(1994)127-138所述，用N-羟基琥珀酰亚胺激活mPEG-CH2-COOH(CH3-(O-CH2-CH2)n-O-CH2COOH)。
环氧乙烷重复单位在n≈110的范围内以致产生5000的分子量(PEG5000)，或在n≈440(PEG20k)或n≈880(PEG40k)的范围内。
1.2 EPO(1-28)αCOSBzl的合成根据Lu，W.等，J.Am.Chem.Soc.，118(1996)8518-8523，用逐步固相合成法制备N-末端肽。BOC-Gly-(硫酯接头)-氨基甲基-树脂用于氨基酸的逐步连接。去保护和从树脂上切下所得到的肽。
添加苄基溴以制备硫酯，然后通过HPLC纯化。合并含有硫酯的组分，通过HPLC纯化。
1.3 EPO(1-28)αCOSBzl的PEG化添加PEG-CH2-CO-NHS以在N-末端丙氨酸的α-NH2和第20位赖氨酸的ε-NH2上对肽进行N-酰化。分离单和双PEG化EPO(1-28)硫酯，通过HPLC纯化，并冻干。
实施例2利用双官能试剂对EPO(1-28)进行PEG化a)巯基的共价连接本实施例公开了巯基和片段共价连接的反应条件的确定。为了确定该条件，向片段EPO(1-28)αCOSBzl的溶液中，这里是向1ml于pH 7.3，10mM磷酸钾，50mM NaCl中的5mg/ml片段中添加不同量含有被封闭的巯基的试剂，这里是SATA(乙酰硫代醋酸琥珀酰亚胺酯)或者SATP(乙酰硫代丙酸琥珀酰亚胺酯)(在DMSO中溶解，达到10mg/ml)。搅拌反应约30分钟(25℃)，通过加入1M赖氨酸溶液至10mM终止反应。通过在pH 6.2，10mM磷酸钾、50mM NaCl和2mM EDTA中透析除去多余量的SATA和SATP。用羟胺除去保护性乙酰基后，根据Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119(1967)41-49中所述方法用二硫代联吡啶通过光度法测定共价连接片段的巯基数量。
b)活化的EPO(1-28)的PEG化在含有95mg活化的EPO的溶液(4.5mg/ml，于10mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.2中)中溶解380mg甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 30.000；Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))。溶液中由此得到的活性片段和甲氧基-PEG-马来酰亚胺间的摩尔比率是1∶4。通过添加1M羟胺水溶液到上述溶液中达到30mM，pH 6.2，使活性片段共价连接的封闭巯基解封闭。由此反应混合物溶液中得到的活性片段含有游离巯基(-SH)。进行巯基解封闭后，接着，立即进行现在含有游离巯基(-SH)的活性片段和甲氧基-PEG-马来酰亚胺间的90分钟偶联反应(搅拌，25℃)。通过加入0.2M半胱氨酸水溶液到反应混合物中达到2mM，终止偶联反应。30分钟后，通过添加DMSO中的0.5M N-甲基马来酰亚胺达到5mM浓度，封阻未与甲氧基-PEG-马来酰亚胺反应的活性片段的过量游离巯基。30分钟后，通过离子交换层析纯化得到的现在含有PEG化片段的反应混合物，用10mM磷酸钾，pH 7.5透析≥15小时。
实施例3EPO(29-165)的重组产生根据WO 99/05268的实施例1制备EPO(29-165)。
收获和细胞分离利用批重新饲喂方法(batch refeed process)，即，当达到期望细胞密度时，收获约80％的培养物。用新鲜培养基补充剩余的培养物，培养直到下一次收获为止。一次生产过程由最多10次连续的收获组成9次部分收获和在发酵最后的1次全部收获。每3-4天进行一次收获。
转移确定的收获物体积进入冷却的容器中。通过离心或过滤分离出细胞并弃去。在线过滤含有片段的离心步骤上清液，在第二个冷却容器中收集。在纯化期间单独处理每次的收获物。
实施例4连接和分离在pH 7.5，6M盐酸胍，0.1M磷酸缓冲液中以约6mg/ml溶解等摩尔量的根据实施例1和2制备的PEG-EPO(1-28)COSBzl和EPO(29-165)。添加3％苯硫酚和1％卞硫醇(体积比)和过量DTT以使蛋白质保持还原并连接约36小时直到反应完成。然后通过离子交换层析除去多余试剂。通过用6M盐酸胍调整缓冲液和pH到约1mg/ml蛋白质浓度，并且稀释到大约0.2mg/ml实现蛋白质的重新折叠。根据WO 01/02017的实施例1纯化连接产物。
实施例5通过正常红细胞性贫血小鼠测定法测定PEG化EPO的体内活性给小鼠施用PEG-EPO、未修饰的EPO和缓冲溶液。结果表明PEG化EPO比未修饰EPO具有更高的活性和延长的半衰期，这是通过在每只小鼠利用相同剂量时网织红细胞量的显著增加和网织红细胞计数最大值的迁移证明的。
正常红细胞性贫血小鼠生物测定法是本领域已知的(Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP BIO 1997(2))。用BSA-PBS稀释样品。皮下给药7-15周龄的正常健康小鼠0.2ml如实施例4中所述的PEG化EPO。从给药后72小时开始4天期间，通过穿刺尾部静脉抽血，稀释至在1ml的0.15μmol吖啶橙染色溶液中存在1μl血液。染色时间是3到10分钟。通过红色荧光直方图(每30,000个分析的血细胞)分析，在流式细胞仪中通过显微荧光测定法进行网织红细胞计数。每天每个研究组为5只小鼠，小鼠仅取血一次。
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序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)<120>聚乙二醇化和双糖基化的红细胞生成素<130>20971<140>
<141>
<150>EP01122555.4<151>2001-09-25<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166
<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16权利要求
1.具有使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性的红细胞生成素突变蛋白质，其特征在于其在Asn38和Asn83位被N-糖基化而在Asn24位没有N-糖基化。
2.如权利要求1所述的红细胞生成素突变蛋白质，其特征在于其在N-末端氨基基团和/或Lys20的ε-氨基基团上与低级烷氧基聚(乙二醇)基团连接。
3.如权利要求2所述的红细胞生成素突变蛋白质，其中每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是约5千道尔顿到约40千道尔顿。
4.如权利要求2所述的红细胞生成素突变蛋白质，其中每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是约30千道尔顿。
5.如权利要求2至4所述的红细胞生成素突变蛋白质，其中聚(乙二醇)部分通过甲氧基封端。
6.如前述任一权利要求所述的红细胞生成素突变蛋白质，其具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
7.包含红细胞生成素突变蛋白质和药物学上可接受缓冲液的含水组合物，其中所述突变蛋白质具有使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性，并且其特征在于在Asn38和Asn74位具有N-糖基化而在Asn24位没有N-糖基化。
8.如权利要求7所述的含水组合物，其特征在于所述红细胞生成素突变蛋白质在N-末端氨基基团和/或Lys20的ε-氨基基团上与低级烷氧基聚(乙二醇)基团连接。
9.包含权利要求1至8任一项所述的突变蛋白质或组合物及药物学上可接受赋形剂的药物组合物。
10.权利要求1至8任一项所述的突变蛋白质或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防慢性肾衰竭患者(CRF)、AIDS中的贫血相关疾病和用于治疗经历化疗的癌症患者。
11.红细胞生成素突变蛋白质的生产方法，其特征在于通过Gly28和Cys29间形成化学键来连接由保留了Asn24和Gly28的红细胞生成素氨基酸第1-28位组成的N-末端红细胞生成素片段和由在Asn38和Asn83被糖基化且保留了Cys29的红细胞生成素氨基酸第29-165位或166位组成的C-末端红细胞生成素片段，分离红细胞生成素突变蛋白质。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述N-末端片段在红细胞生成素序列的N-末端和/或Lys20位被PEG化。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于通过化学合成产生所述N-末端片段。
14.如权利要求11至13所述的方法，其特征在于通过重组基因表达产生所述C-末端片段。
15.这里所限定的本发明。
全文摘要
本发明提供了具有使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物学活性的红细胞生成素突变蛋白质，其特征在于其在Asn38位被N－糖基化而在Asn24位没有N－糖基化。这种突变蛋白质具有改进的药物特性。
文档编号A61K47/48GK1558952SQ02818752
公开日2004年12月29日 申请日期2002年9月20日 优先权日2001年9月25日
发明者W·蒂舍尔, W 蒂舍尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司, 弗 哈夫曼-拉罗切有限公司