专利名称：一种注射型组织工程骨修复材料的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程学技术领域，具体涉及一种注射型组织工程骨修复材料。
背景技术：
组织工程是二十一世纪生命科学一大热点。它的核心内容是体外细胞三维培养，它的基本方法是将种子细胞与可降解生物材料组成复合体，替代受损组织器官。可注射型组织工程骨是利用初始状态为液态的可降解生物材料，与种子细胞有机复合，制备成液态可注射的组织工程骨，并且在完全填充骨缺损的过程中，逐步固化形成凝胶或固态的组织工程骨修复骨缺损。可注射骨易于塑形，与种子细胞、生长因子复合便捷，且具有组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点，适应了微创外科技术发展的要求，因此正逐步引起国内外诸多学者的髙度关注。目前，用于可注射骨的材料多为凝胶类，主要包括纤维蛋白凝胶，聚氧化乙烯水凝胶，藻酸盐凝胶等，这些生物材料注入体内后为凝胶状，并不具备生物力学强度，虽然复合种子细胞植入体内后都有一定的成骨效果，但距理想的可注射骨支架材料还有相当的距离 。

发明内容
本发明的目的在于提供一种注射型组织工程骨修复材料，该骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。本发明所采用的技术方案是:
一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，其特征在于:所述载体支架为可注射性材料壳聚糖-β -磷酸三钙复合物，复合种子细胞；所述的种子细胞为经传代增殖培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞。所述的可注射材料壳聚糖-β -磷酸三钙为将壳聚糖与β -磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β -磷酸三钙复合物。所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。本发明所述注射型组织工程骨修复材料的制备方法，包括如下步骤:
1)种子细胞的培养:抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代IO7数量级；
2)可注射性支架材料的制备:将壳聚糖与β-磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成壳聚糖-β -磷酸三钙复合物；
3)种子细胞的处理:将培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混
匀；
4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合:壳聚糖-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤(3)处理后的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml: 1.5g:0.3ml充分混匀，即获得所述的注射型组织工程骨修复材料。本发明所釆用的壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰基后的衍生物，为天然髙分子聚合物，具有良好的生物降解性，降解产物无毒副作用。本发明所釆用的β_磷酸三钙属于钙磷陶瓷类，具有和自然骨相似的化学成份、良好的生物相容性和生物降解性。本发明将两者复合而成为较理想的组织工程骨可注射性支架材料。以往对壳聚糖交联所釆用的交联剂为戊二醛，但戊二醛被证实有细胞毒性，故本发明中釆用柠檬酸作为壳聚糖的交联剂。柠檬酸是人骨有机质的重要组成部分，占到全身的70%，其对糖、脂肪、蛋白质的氧化代谢过程有重要作用。由于柠檬酸中含有羧基，可以与壳聚糖中的羟基发生酯化反应，未反应的羧基将与壳聚糖中的氨基作用形成盐键。通过此键，使壳聚糖交联形成有机网络结构。本发明选用壳聚糖为有机相，β -磷酸三钙为无机相，β -磷酸三钙与壳聚糖复合后，分散在有机网络结构中，复合物最初为液态，逐惭固化形成固态、多孔网状结构且具有一定的生物力学强度，从而制备了一种新型有机/无机复合的可注射材料。本发明技术方案带来的有益效果是:
I)本发明骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。2)本发明通过实验结果证实了壳聚糖-β -磷酸三钙复合支架材料与BMSCs的相容性良好，是一种可行的可注射型组织工程骨支架材料。以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
具体实施方式
:
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1
注射型组织工程骨修复材料的制备 包括如下步骤:
1)种子细胞的培养:抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代IO7数量级；
2)可注射性支架材料的制备:将壳聚糖与β-磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成壳聚糖-β -磷酸三钙复合物；
3)种子细胞的处理:将培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混
匀；
4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合:壳聚糖-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤(3)处理后的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml: 1.5g:
0.3ml充分混匀，即获得所述 的注射型组织工程骨修复材料。实施例2
MTT法分析BMSCs与壳聚糖-β -磷酸三钙复合材料复合培养后的成活和增殖能力接种细胞后，于第2、4、6、8天弃原培养基，加入无血清DMEMlml和MTT (5mg/mol) 10 μ 1，在37°C的CO2孵箱内孵育4小时，小心吸去MTT后，加入二甲基亚砜0.5ml振荡15分钟，酶标仪上选择波长570nm，测定光吸收值。
随培养时间的延长，各组D570逐渐增加，到第8天最髙，壳聚糖_ β -磷酸三钙组在各时间点与对照组均无显著性差异(> 0.05)(表I)。表I两组MTT法测定吸光度值
权利要求
1.一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，其特征在于:所述载体支架为可注射性材料壳聚糖-β -磷酸三钙复合物，复合种子细胞；所述的种子细胞为经传代增殖培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞。
2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于:所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙为将壳聚糖与磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β -磷酸三钙复合物。
3.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于:所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理 后形成有机网络结构的壳聚糖。
全文摘要
本发明公布了一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，其特征在于所述载体支架为可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物，复合种子细胞；所述的种子细胞为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。本发明通过实验结果证实了壳聚糖-β-磷酸三钙复合支架材料与BMSCS的相容性良好，是一种可行的可注射型组织工程骨支架材料。以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
文档编号A61L27/38GK103157137SQ20111041768
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者孙叶芳 申请人:西安瑞捷生物科技有限公司