专利名称：内皮细胞促生长素抑制素受体的选择性处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择性的肽和非肽类的促生长素抑制素受体激动剂治疗性应用的领域。
SS的效应由SS受体家族(SSTR)转导，其中的5个(SSTR1-SSTR5)已被克隆(Coy等，1993，同上)。基于相对序列相似性和对SS类似物的亲合性，这些受体可被分为两个亚群(Hoyer等，1995,TrendsPharmacol Sci16:86)。第一个亚群由SSTR2,SSTR3和SSTR5组成。第二个亚群包含SSTR1和SSTR4。部分是由于对SSTR、特别是对SSTR2具选择性的SS类似物的可用性，第一个受体亚群的生理学已经被更彻底的定性。已知全部5种SSTR有一些共同的机理性特征，例如已经证实所有5种都与G蛋白偶联并调节细胞内cAMP的水平，这部分是通过Gi的激活完成的(Patel等，1994,Biochem.BilphysRes.Commun.198:605)。
在体内SS半寿期非常短，导致它不适用于多种治疗。为了治疗方面的应用，已鉴定了许多SS短肽类似物，尤其是SSTR的第一亚组的激动剂(见，例如1984年11月27出版的U.S．专利4,485,101；1990年2月27出版的4,904,642；1992年9月15出版的5,147,859；1995年4月25出版的5,409,894；1997年1月28出版的5,597,894；和下述国际专利公开1997年1月16日的WO97/01579和1997年12月18的WO97/47317；全部在此引用作为参考)。
其中特征研究最为透彻的SSTR肽激动剂是Octreotide(SandozLtd.,Basel,Switzerland)和angiopeptin(有时也称为BIM23014)。Octreotide被认为是SSTR2选择性的激动剂(Yang等，1998,PNASUSA95:10836)。angiopeptin被认为是一种SSTR2/SSTR5的选择性激动剂(Alderton等，1998，英国药理学杂志(Br.J.Parmacol)124(2):323)。U.S．专利号5,750,499(Hoeger等,1998年5月12日出版，在此引用作为参考)公开了其中声称为是第一种SSTR1选择性激动剂(也见于Liapakis等，1996.The J.of Pharmacology andExperimental Therapeutics276(3)1089，在此引用作为参考)，其中的一种被证实为des-AA1,2,5[DTrp8,LAamp9]SS(即脱氨基酸1,2,5[Dtryptophan8,N-对异丙基-4-氨甲基-L-苯丙氨酸9]SS，此处简写为“SSTR1′499激动剂”)。
通过应用组合化学的方法，发现了许多非肽类的促生长素抑制素受体亚型选择性激动剂(Rohrer等，1998，科学(Science)282:737，在此引用作为参考)。Rhorer等(同上)鉴定的激动剂中，包括有SSTR1和SSTR4的选择性激动剂。Rhorer等(同上)也公开了SS14与SSTR受体结合的表观抑制常数(Ki)(如表1所示)，并公开了计算SSTR选择性激动剂的常数的方法。Rhorer等(同上)指出其中公开的SSTR1和SSTR4激动剂是无生理活性的，原因在于它们在模型系统中不能抑制生长激素、胰高血糖素或胰岛素的释放。相反，其中公开了一种SSTR2激动剂具有强的抑制生长激素，胰高血糖素和胰岛素分泌的效果。
表1SS14 SSTR特异性(Ki,nM)*
*来自Rohrer等，1998，科学282:737已经提示，特定的SSTR激动剂在多种疾病的治疗中可能有用，尤其是某些动物模型中有利的治疗结果可说明这一点。例如，根据鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型，提示SSTR2激动剂尤其可能是血管形成的有效的抑制剂(Woltering等，1997,Investigational New Drugs15:77，其中多种激动剂的SSTR2结合活性与化合物的抗血管形成的能力相关)。在血管形成方面，在裸鼠模型中，通过抑制鼠的血管形成，最近显示SS本身可控制异种移植的Kaposi肉瘤在小鼠体内的生长(Albini等，1999,The FASEB J.13(6):647，其中提供的结果表明人内皮细胞表达SSTR3)。也有大量的证据表明SSTR2激动剂，尤其是angiopeptin，在动物模型中对抑制动脉损伤后的内膜增生有效(Lundergan等，1989，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)80:49；Foegh等，1989，动脉粥样硬化78:229；Conte等，1989,Transpl Proc 21:3686；Vargas等，1989,Transplant Proc21:3702；Hong等，1993,Circulation88:229；Leszczynski等，1993,Regulatory peptides 43:131；Mooradian等，1995,J.Cardiovasc Pharm25:611；Light等，1993，美国生理学杂志(Am J Physiol)265:H1265)。提示这种在动物模型中的治疗活性反映了angiopeptin抑制损伤的内皮细胞释放生长因子的能力(Hayry等，1996,Metabolism45(8Suppl1):101)。但是，在临床研究方面，利用angiopeptin对导致病人再狭窄的内膜增生进行抑制未得到什么结论(Eriksen等，1995,Am Heart J.130:1；Emanuelsson等，1995,Circulation 91:1689；Kent等，1993,Circulation 88:1506)。angiopeptin在预防冠状动脉血管成形术后的再狭窄的临床试验方面效力较差，与动物研究中令人鼓舞的结果相反，其中原因在于angiopeptin对SSTR2受体的内在活性低，再加上缺乏对SSTR5受体的激动剂活性(Alderton等，1998,Br.J.Pharmacol124(2):323)。SSTR2激动剂已经被证实在治疗糖尿病性视网膜病变方面通常也是无效的(Kirkegaard等，1990,Acta Endocrinologica(Copenh)122:766),尽管体外和动物研究提示这样的化合物有抗血管形成的活性。
内皮细胞形成被覆人体所有血管的单细胞层，被其它的细胞类型如成纤维细胞和平滑肌细胞包围。内皮细胞局限于血管内。调节血管重建的生理系统的不平衡导致内皮细胞介导的增殖性疾病如血管生成性疾病和内膜增生依然是重要的健康问题。例如，在诸如年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病变中眼内新血管形成是最常见的失明原因之一。现已发现内膜增生导致的再狭窄或动脉狭窄的发病率在冠状动脉成形术中为30-50％，分流术后大约为20％(McBride等，1988,N.Engl.J.Med.318:1734；Clowes,1986,J.Vasc.Surg3:381)。实体瘤生长诱导的血管形成不仅可能导致原发肿瘤的增大，而且可借助新生的血管发生转移。
发明详述一个方面，本发明提供了SSTR1和SSTR4选择性激动剂的治疗性使用。在一些实施例中，本发明涉及使用SSTR1和SSTR4选择性激动剂治疗内皮细胞介导的增殖性疾病。内皮细胞介导的增殖性疾病的例子包括内膜增生和血管形成性疾病(血管形成性疾病的特征在于因不适当的或不能调节的血管形成导致的病理性新血管形成)。增殖性疾病可能由内皮细胞介导，例如，其中内皮细胞可能参与病理性细胞增殖的上调，如在内膜增生(其中的增殖细胞可能是内皮细胞或其它细胞类型)就是如此，或，如实体瘤的血管形成的例子中，其中的内皮细胞促进病理性细胞增殖。内皮细胞介导的增殖性疾病的种类可以被医学实践者和本领域技术人员所识别，并随医学研究的进展而不时的改变。
在本发明的多方面，血管形成性疾病可以包含增殖性视网膜病变，如糖尿病性视网膜病变，早产儿视网膜病变，角膜移植排斥，晶状体后纤维组织形成，新生血管性青光眼，虹膜发红(rubeosis)，黄斑变性引起的视网膜新血管形成(包含光动力治疗后的抗血管形成治疗)，缺氧，与感染或外科干预相关的眼内血管形成，和眼内其它异常新血管形成状况；皮肤病如牛皮癣相关的血管形成；血管疾病例如血管瘤(hemagiomas)，和动脉粥样斑内的毛细血管增殖，Oser-Webber综合症，心肌血管形成，和斑新生血管化，毛细血管扩张症，血友病性关节，血管纤维瘤，和创伤肉芽发生。其它的应用包括治疗以过度或不正常的内皮细胞激活为特征的疾病，包含但不局限于肠粘连，Crohn’s疾病，动脉粥样硬化，硬皮病和肥大疤痕，即疤痕疙瘩。SSTR1和SSTR4的选择性激动剂也在以血管形成为病理结果的疾病如猫抓病(Rochele nianlia quintosa)和溃疡(Helicobacter pylori)的治疗方面有用。
本发明另外一个方面包括SSTR1和SSTR4选择性激动剂用于对抗血管形成治疗敏感的肿瘤的治疗，包含原发和转移的实体瘤，包括乳腺癌，结肠癌，直肠癌，肺癌，口咽癌，喉癌，食管癌，胃癌，胰腺癌，肝癌，胆囊癌和胆管癌，小肠癌，泌尿道癌(包括肾脏癌，膀胱癌和尿道上皮癌)，女性生殖道癌(包括宫颈癌，子宫癌和卵巢癌，以及绒毛膜癌，和妊娠滋养层疾病)，男性生殖道癌(包含前列腺癌，精囊癌，睾丸癌和生殖细胞肿瘤)，内分泌腺癌(包括甲状腺癌，肾上腺癌，和脑下垂体癌)，和皮肤癌，以及血管瘤，黑色素瘤，肉瘤(包括骨和软组织来源的肉瘤以及Kaposi’s肉瘤)和脑肿瘤，神经瘤，眼瘤和脑膜瘤(包括星形细胞瘤，神经胶质瘤，神经胶质母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，神经瘤，神经母细胞瘤，神经鞘瘤，脑脊膜瘤)。在本发明的一些方面，SSTR1和SSTR4选择性激动剂在造血组织恶化来源的恶性肿瘤如白血病(即绿色肉瘤，浆细胞瘤和蕈样肉芽肿病斑及瘤，和皮肤T细胞淋巴瘤/白血病)以及淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)的治疗方面也是有用的。此外，SSTR1和SSTR4选择性激动剂可单独或与放疗和/或其它的化疗试剂联合用于预防上述肿瘤的转移。
在几个方面，本发明涉及对一种或更多种促生长素抑制素受体亚型具有选择性的促生长素抑制素受体激动剂。在此方面，可以进行受体-配基结合试验以确定化合物对一种或多种促生长素抑制素受体的相对亲合力，例如Rhorer等，1998，科学282:737描述的例子。在一些实施方案中，如果某化合物相对于某受体的表观抑制常数(Ki，如Rhorer等描述的方法计算)低于该化合物相对于另一促生长素抑制素受体的Ki，并且在一些实施方案中至少低10倍，则表示该化合物对该受体是选择性的。在一些实施方案中，本发明中使用的激动剂的选择性可以高于10倍，如100倍或1000倍。在一些实施方案中，本发明包含对一种以上SSTR具选择性的化合物。
一个方面，本发明应用了已建立的模型系统来研究人血管形成。该模型系统包含自发转化的人脐静脉内皮细胞株ECV304，在Matrigel基底上生长(Hughes,1996，实验细胞研究(Experimental CellResearch)225:171-185)。Matrigel是一种溶解的基底膜提取物，它能够促进内皮细胞在体外分化成毛细血管状的结构。已经表明在Matrigel培养基上，当人脐静脉内皮细胞经历与新生血管形成相关联的形态学改变时，将发生细胞骨架的重组织(Grant等，1991,In VitroCell Dev Biol27A(4):327-36)。如此处实施例1中公开的，利用包含在Matrigel基底上的ECV304细胞的体外血管形成模型，本发明内容表明SS14可抑制血管形成。已发现在次微摩尔和更高的浓度下，SS14可显著地抑制这种模型系统中新生血管的生长。这些结果提示，SS14这种所有促生长素抑制素受体亚型的激动剂(见表1)，可作为血管形成抑制剂作用于人内皮细胞。
本发明者进一步阐明了ECV304细胞仅表达SSTR1和SSTR4受体亚型，并不表达RT-PCR可检测量的SSTR2,SSTR3或SSTR5的mRNA(见实施例2)。因此，所阐明的SS14对ECV304细胞的抗血管形成作用可能是由SSTR1和/或SSTR4介导。本发明者也阐明了SSTR1的选择性激动剂对ECV304细胞具有相似于SS14的生理效果，特别是对肌动蛋白应力纤维的解装配和片状伪足的形成效果相似(见实施例3)。这表明，在本发明其它实施方案中，SSTR1和SSTR4选择性激动剂对人内皮细胞具有抗血管形成的效应，正如SS14在ECV304/Matrigel模型系统中具有抗血管形成作用一样。
已表明促生长素抑制素类似物在许多增殖性疾病，包括血管形成和内膜增生的动物模型中具有治疗效果。有证据表明尤其是SSTR2激动剂可成功用于改善内皮细胞介导的增殖性疾病模型例如CAM，几种动物种属的动脉囊损伤(arterial balloon injury)，和肿瘤模型中的鼠血管增殖的病变。本发明者也已确定，与内皮细胞表达SSTR2的动物模型相反(见实施例4和Chen等，1997,J.of Investigative Surgery10:17)，人内皮细胞和组织表达SSTR1和SSTR4。这种结果提示，SSTR2激动剂在治疗人内皮细胞介导的增殖性病变或疾病的动物模型方面是有效的，而SSTR1和SSTR4选择性激动剂可以用来治疗人类的患者。
尽管此处公开了本发明的多种实施方案，但依据本领域技术人员的常识在本发明范围内可进行许多改编和修改。这种修改包括本发明任何方面的已知等价物的代替从而以基本上相同的方式取得相同的结果。数字范围包含确定界限的数字。在权利要求中，单词“包含”是一个开放式的术语，基本等同于“包括，但不局限于”。下面的实施例是本发明多个方面的例证性的描述，并不限制如此处公开的本发明宽广的方面。实施例1:SS14的抗血管形成效应这个实施例说明利用一种已建立的血管形成模型，在体外SS14对内皮细胞毛细血管样微管形成的抗血管形成作用。该模型是基于人内皮细胞，尤其是ECV304细胞在Matrigel(一种基底膜提取物)上形成毛细血管样微管的倾向性(Hughes,1996，实验细胞研究(Experimental Cell Reseach)225:171)。
利用1.0mL0.01％BSA/0.01N乙酸/PBS重溶5mg小瓶的SS14(Biomeasure Incorporated)，以获得3mM的工作贮存液。人内皮细胞株ECV304(ATCC)在添加2mML-谷氨酰胺(Gibco BRL),1mM丙酮酸钠(Gibco BRL),5×10-5M2-巯基乙醇(Sigma),100U/mL青霉素(Gibco BRL),100μg/mL链霉素(Gibco BRL),20mMHEPES(Sigma)，和可任选加入的10％热灭活胎牛血清(Gibco BRL)或1％BSA的Medium199(M199,Sigma)中培养。细胞长满后，用0.05％胰酶，0.005％EDTA(Gibco BRL)按1∶5传代。
将ECV304细胞(3.5×104个在0.5mL完全M199培养基中)铺在以0.125mLMatrigel(Becton-Dickinson)预包被的24孔板上。立即将SS14加入ECV304细胞并将细胞在CO2湿化的箱内37℃培养。24小时后，将微管形成的图象记录在胶片上。利用Hewlett-PackardScanJet4C/T扫描仪将图象转变成数字化格式，应用Optimas6.1图象分析软件(Optimas Corp)测量毛细血管样微管的总长度。
图2以图解形式说明SS14以剂量依赖形式抑制新生血管微管的形成结果。图2中的图形表示，通过测量新生血管微管相对于SS14未处理对照样品的相对长度，浓度为0.1-100μM的SS14对血管形成的抑制均大于50％。实施例2人内皮细胞的特征以RT-PCR检测von Willebrand因子(vWF)的mRNA和以免疫组织化学检测vWF(vWF参与体内血液凝集级联反应，是内皮细胞已知的功能性标志物)，确定本发明中使用的ECV304细胞的内皮细胞特征。此处使用的ECV304细胞也表达内皮性标志物-内皮细胞氧化氮合酶(eNOS)。
RT-PCR提供证据表明ECV304细胞和来源于脐静脉的原代内皮细胞HUVEC细胞株中存在SSTR1和SSTR4的mRNA。两种细胞株都不表达SSTR2、SSTR3和SSTR5的mRNA，除了一些HUVEC培养细胞的较晚代细胞表达低水平的SSTR2。
进行ECV304和HUVEC内皮细胞株的SSTR1和vWF免疫染色，证实SS受体的位置。ECV304和HUVEC细胞株显示在细胞浆内和质膜上有SSTR1免疫染色。vWF在ECV304细胞和HUVEC细胞的早期传代细胞中的定位揭示，95-100％细胞是有免疫活性的，但在较晚代数的HUVEC中有免疫染色的细胞较少(60％)。
在本实施例中，将ECV304细胞(American Type CultureCollection,Manassas,VA)在添加2mM谷氨酰胺，24mM丙酮酸钠，10mMHepes，青霉素(100U/mL)，链霉素(0.1mg/mL)，和热灭活胎牛血清(10％)的Medium199培养基(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中培养。HUVEC和AoSMC细胞与所需的培养基来自CloneticsCorporation(Walkersville,MD)。用于RNA收集的细胞株在75cm2Falcon瓶(Becton Dickinson Labware,Frahklin Lakes,NJ.)中生长，用于组织学分析的细胞株接种在24孔Costar平板(Corning Inc.,Corning,NY)内覆盖20mm盖玻片的APES(Sigma)上。以下ECV304细胞株的信息由ATCC提供ATCC号CRL-1998，最初保藏于1992年5月生物体人(人类)名称ECV304组织正常，脐静脉，内皮，内皮的形态学卵圆形保藏者K.Takahashi病毒敏感性Semliki Forest virus(SFV)成瘤性是，在BALB/c nu/nu小鼠核型形态数目=80产物血管紧张素转化酶(ACE)培养基更新率每周2-3次传代培养移去培养基，加入新鲜的0.25％胰酶，0.03％EDTA溶液，冲洗并移去胰酶。将瓶放置在室温(或37℃孵育)直到细胞分开(通常5-10分钟)，加入新鲜培养基，吹打并转入新的瓶内。
传代比率推荐1∶6到1∶10生长特性单层注解ECV304是从正常人脐静脉血(捐献者号304)中建立的自发转化的永生化内皮细胞株，该细胞以卵圆形单层生长模式，无需任何特殊生长因子即具有高增殖潜能，以及具有接触抑制的锚定依赖性为特征。电镜研究证实有内皮特异性Weibel-Palade小体。对植物血凝素Ulex europaeusⅠ(UEA-Ⅰ)和PHM5(抗人内皮以及肾小球上皮单克隆抗体)的免疫组织化学染色呈阳性。这些细胞对于Ⅷ因子相关抗原，碱性和酸性磷酸酶以及上皮角蛋白为阴性。该细胞在BALB/cnu/nu小鼠上能够形成肿瘤，并且在家兔的角膜上可引起新血管生成。据报道它们能够产生尿激酶原型PA(pro-u-PA)并表达少量的细胞间粘附分子(ICAM-1)，淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)，血管细胞粘附分子(VCAM-1)和粒细胞膜蛋白-140(GMP-140)。白细胞介素-1(IL-1)和干扰素对ECV304具有抑制效应。这些细胞在用IL-1刺激后，也能够产生IL-6。该细胞株曾以BM Cycline处理21天以消除支原体的污染。更详尽的信息可能包含在以下的在此引用作为参考的文献中Takahashi等，1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:265；Takahashi和Sawasaki,1991,In Vitro Cell Dev.Biol27A:766；Takahasi和Sawasaki,1992,In Vitro Cell.Dev.Biol28A:380)。该细胞株的增殖可以在ATCC Medium199培养基，90％；10％的热灭活胎牛血清中进行。
在本实施例中，根据制造商说明书从裂解于Trizol溶液(GibcoLife Technologies,Grand Island,N.Y.)中的组织样品和细胞株中分离总RNA。任何存在的DNA通过在含1mM dNTP(Pharmacia),10URnasin(Pharmacia)，和2U的DNA酶(Promega Corporation,Madison,WT)的第一链缓冲液(25mMTris-HCl pH8.3,37.5mMKCL,1.5mMMgCl2和10mMDTT)中并加热到37℃,30min孵育以除去。加热到75℃,5min灭活DNA酶。取一样品作为PCR的模板以证实无基因组DNA。以寡聚dT为引物((Gibco)，10U Rnasin(Pharmacia)，和1mMdNTP(Pharmacia))按照制造商说明书，利用SuperscriptⅡ逆转录酶(100U MMLV,Gibco Life Technologies,Grand Island,N.Y.)自纯化的RNA中合成cDNA。样品在42℃孵育1小时。通过加热样品到75℃，15分钟灭活酶。在PCR扩增前cDNA样品贮存在-20℃。
为检测内皮细胞株(和人血管)中的SSTR亚型，在AppliedBiosystems Model391DNA合成仪上合成如下寡核苷酸引物
表2人SSTR引物
设计与其受体独特区域杂交的SSTR-1,-2,-3,-4和-5引物对。利用2μ1cDNA在含1mM MgCl2(扩增SSTR5的MgCl2为5mM),0.2mMdNTP(Pharmacia),5％DSMO(仅在扩增SSTR5时加入)和100ng5′和3′引物和Taq聚合酶(1.25U,Gibco BRL)的25μl总体积的PCR缓冲液(67mM Tris pH9.01,1.5mM MgSO4,166mM AmSO4,10mM巯基乙醇)中进行SSTR1-5的PCR反应。扩增反应在RoboCycler Gradient96(Stratagene,LA Jolla,CA)上进行35个循环。每个循环组成为94℃，变性45秒，在各自适宜的退火温度(见表2)下退火45秒，72℃延伸45秒。最后以72℃延伸5分钟结束扩增。通过1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。用Eagle EyeⅡVideo System(Stratagene)观察并拍摄DNA图谱。从凝胶中分离应用SSTR1,2和5的引物获得的DNA片段并连接到pGEM-T载体(Stratagene,LaJolla,CA)中。利用T7测序酶(Pharmacia Biotech Inc.)以双脱氧核苷酸链终止法测定亚克隆的DNA序列。应用SSTR3和4的引物获得的DNA片段从凝胶中洗脱后进行诊断性限制消化分析以确认该PCR产物就是SSTR-3和-4。
为检测内皮细胞中的vWF，利用寡核苷酸序列为5′-CCCACCCTTTGATGAACACA-3′的正向引物和5′-CCTCACTTGCTGCACTTCCT-3′的反向引物进行PCR反应以检测von Willebrand’s(vWF)因子cDNA。在含2.0mM MgCl2,0.2mMdNTP(Pharmacia),5％DSMO和100ng 5′和3′引物，和Taq聚合酶(1.25U,Gibco BRL)的PCR缓冲液(20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl)中进行PCR反应。在60℃的退火温度下按上述方法进行35个PCR循环。如上所述分离和观察PCR产物。自凝胶中分离DNA片段并进行诊断性限制消化分析以确认该PCR产物就是vWF。实施例3:SSTR1选择性激动剂对人内皮细胞的作用现已阐明SS通过作用于SSTR1而调节细胞内的pH(Barber等，1989,J.Biol.Chem.264:21038)并且细胞内pH又反过来调节肌动蛋白应力纤维的产生(Tominaga等，1998,Mol.Biol.Cell.9:2287)。应用荧光素标记的鬼笔环肽定位肌动蛋白，本实施例描述了SS14和一种SSTR1选择性激动剂对内皮细胞内肌动蛋白成束的共同作用。
为确定SS14对内皮细胞的作用，洗涤ECV304细胞以除去生长培养基并加入新鲜的培养基(无血清)(1ml/孔)。在测试孔中加入SS14(10nM,Peninsula Laboratories；Belmont,CA)而对照孔仅加入等体积的培养基前，将细胞冷却至4℃15分钟以浓缩细胞膜上的SSTR。接着细胞在37℃孵育30分钟，在4％PFA中固定5分钟，在PBS中洗涤。将细胞与ALEXA-488偶联的鬼笔环肽(1:50,Molecular ProbesInc.,Eugene,OR)在室温共孵育15分钟，以显现肌动蛋白细胞骨架。利用上述Zeiss Axiophot显微镜观察细胞。采用同样的方法评价SSTR1选择性激动剂对内皮细胞的作用。
在对照ECV304细胞中观察到大量横跨整个细胞的应力纤维而没有观察到多少片状伪足。SS14处理的ECV304细胞表现出长的应力纤维丧失而且剩余的纤维短且缺乏定向组织。此外，在质膜上片状伪足的数目和大小有增加。除了这些形态学的改变外，由细胞内pH呈像确定出SS14还表现对ECV304细胞上的Na/H交换器的抑制。这些结果提示探测肌动蛋白细胞骨架或细胞内pH的变化是跟踪内皮细胞上SS受体激活的快速和简单的方法。在一些实施方案中，这种试验也可以用来筛选SSTR1或SSTR2选择性激动剂。
以SSTR1′499激动剂处理ECV304或HUVEC细胞产生了与以SS14处理这些细胞相似的结果。SSTR1′499处理的结果是应力纤维的减少和片状伪足形成的增加。以SSTR2选择性激动剂DC32-87(Raynor等，1993,Mol.Pharmacol43(6):838)处理ECV304或HUVEC细胞，对内皮细胞没有影响。实施例4人类内皮组织与动物组织中的SSTR在人类，以RT-PCR检测表明，SSTR1,SSTR2和SSTR4(但不是SSTR3或SSTR5)的mRNA存在于正常的主动脉，正常的内乳动脉，正常的隐静脉，动脉粥样硬化的腘动脉。在所有的正常内皮组织中，SSTR1均有表达并且是最丰富的受体亚型。SSTR2和SSTR3的表达有更多变化，一些个体缺乏两种中的一种亚型的表达。在正常组织内，与SSTR1相比较，SSTR2和SSTR3的mRNA的丰度较低一些。
由旁路法，断肢或与Pacific Organ Retrieval and TransplantSociety相关并得到英国哥伦比亚大学Ethical Committee on HumanExperimentation伦理学上允许的器官移植捐献人收集人动脉样品(100-400mg)。收集正常静脉N=6(大隐静脉和胳膊静脉)，动脉N=5(主动脉和内乳动脉)和动脉粥样硬化动脉或动脉瘤动脉N=3。用来获取这些结果的正常的组织如下2个正常的主动脉样品，其一来自42岁的女性，第二个来自19岁的男性；3个内乳动脉样品，和3个隐静脉样品来自年龄为69-74岁的男性病人。在动脉粥样硬化腘动脉中，SSTR1也是占主要的受体，SSTR2和SSTR4的水平不定，同样没有SSTR3或SSTR5存在的证据。3个腘动脉样品来源于68,72,73岁的男性病人。
此处分析的血管组织包括内皮和非内皮细胞。尤其是，非内皮性平滑肌细胞组成脉管系统的实质性成分。在主动脉平滑肌原代细胞制备物中，检测到SSTR1,SSTR2和SSTR4的mRNA，也检测到vWF的mRNA和免疫染色(＜10％的细胞)，提示在这些细胞培养物中包含一些内皮细胞。
综合人内皮细胞内mRNA的表达分析结果(实施例2)，在本实施例中报道的结果提示在人血管组织中检测到的SSTR2mRNA来源于该组织中的非内皮细胞，而SSTR1和SSTR4的mRNA则来源于内皮细胞。
应用免疫组织化学检测内皮细胞原位表达的SSTR1。正常和病变的血管内皮细胞能够被SSTR1而不是SSTR2抗体免疫染色。vWF因子的免疫反应性(IR)局限于正常和病变血管的内皮细胞。为进行免疫细胞化学法将每种血管样品的一小部分在4％福尔马林(PFA)中固定1小时，利用封固在载玻片上的10μm恒冷箱切片和在PFA中固定10分钟的培养细胞进行免疫组织化学染色。将兔抗人SSTR-1抗血清(1∶100)和抗SSTR2抗血清(1∶100)(CURE/Gastroenteric BiologyCenter Antibody/RIA Core,NIH grant DK41301)和抗vWF抗血清(Sigma；1∶1000)在切片或完整细胞上4℃孵育过夜。在PBS中洗涤除去多余的抗体后，用1∶1000的CY3缀合的驴抗兔IgG(JacksonImmuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA.)在室温定位结合的抗体1小时。利用装备落射荧光的Zeiss Axiophot显微镜扫描载玻片。应用配备氪氩激光的Biorad MRC600激光共聚焦扫描显微镜数字化有代表性的切片，利用NIH图像(共享仪器)将叠加的图像转化成最大强度的投影，并用Adobe Photoshop制作最后的图象。
动物模型的组织中SSTR试验的结果可能与上述人组织中的结果相反(见背景实施例Chen等，1997,J.Invest.Surg.10∶17)。在啮齿动物髂动脉对照样品中，没有观察到对SSTR1,2和3特异性抗血清的可检测的免疫反应性。但是，动脉损伤后，在损伤处聚集的内皮细胞表面观察到SSTR-2免疫反应性。通过用抗vWF的单克隆抗体进行双染色确定了SSTR2免疫反应性细胞和内皮细胞是相同的细胞。这种免疫组织化学的结果提示SSTR2是大鼠动脉损伤模型中有活性的SS受体。利用特异于5种已知SSTR的引物进行的RT-PCR证实了这种结果。该结果表明正常大鼠动脉表达低水平的SSTR2和SSTR3，但不表达SSTR1,SSTR4或SSTR5。利用竞争性PCR方法比较对照和损伤血管中SSTR2 mRNA的水平。应用该方法的结果表明，在大鼠髂动脉的囊部损伤7天后，SSTR2受体的表达水平有显著地增加，继后实验说明这种增加可维持至损伤后长达2月之久。这些动物模型结果与angiopeptin抑制大鼠内膜增生的能力以及SSTR1和SSTR4的选择性激动剂抑制人内膜增生的能力是相符合的。
本发明提供包含SS激动剂的药学组合物(药物)。在一个实施方案中，该组合物包含足以改变，优选地抑制γ-干扰素产生的治疗或预防有效量的SS激动剂化合物，以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，该组合物包含足以抑制血管形成的治疗或预防有效量的SS激动剂化合物，和药学上可接受的载体。
SSTR1和SSTR4选择性激动剂可以与其它的组合物以及治疗疾病的方法配伍使用。例如，可以常规地将光动力治疗，外科手术，放疗或化疗与SSTR1或SSTR4选择性激动剂组合使用以治疗肿瘤，然后可以将SSTR1或SSTR4选择性激动剂给予病人以延长微小转移灶的休眠期并稳定和抑制任何残余原发肿瘤的生长。
“治疗有效量”是指在剂量和所需的作用时间上能够取得预期的治疗结果的有效量，如减少或逆转肿瘤中的血管形成，或减少或抑制内膜增生的剂量。根据诸如个体疾病的状态，年龄，性别和体重，以及在个体中SS激动剂诱导预期反应的能力，SS激动剂的治疗有效量是可改变的。可以通过调节给药方案以提供最佳的治疗反应。治疗有效量同样也是一种治疗有益效应超过SS激动剂的任何毒性或有害效应的剂量。
“预防有效量”是指在剂量和必需的作用时间上，能有效取得预期预防性结果，如防止或抑制肿瘤转移率或内膜增生发生的量。可以按照上述确定治疗有效量的方法确定预防有效量。通常，由于在疾病发生之前或疾病的较早期使用预防有效量，因此预防有效量将低于治疗有效量。
在具体的实施方案中，SSTR1或SSTR4选择性激动剂优选的治疗或预防有效量的范围可以是0.1nM-0.1M,0.1nM-0.05M，0.05nM-15μM或0.01nM-10μM。可选择地，每日的总剂量可能范围在约0.001-1mg/kg病人体重。剂量值可以随待缓解的病情严重程度变化。应该进一步理解，对于任何特殊的患者，特殊的给药方案应该根据个体的需要和管理或指导给予该组合物的人员的专业判断不时地作出调整，此处列出的剂量范围仅是例证性的，目的不是局限本发明方法的范围或实践。
在治疗组合物中活性SSTR选择性激动剂的量可依据如个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素来改变。可以通过调节给药方案以产生最佳的治疗反应。例如，可以使用单个药丸，或在一段时间内使用数份剂量，或适应紧急治疗状况剂量按比例减少或增加。制成便于给药并且剂量均一的单位剂型的胃肠外组合物是特别有益的。此处使用的单位剂型是指适于单元剂量的物理上离散的单位，每个单位包含预计能够产生预期治疗效果的预定量活性化合物以及所需的药学载体。本发明剂型单位的规格直接取决于(a)活性化合物的独特特性和欲取得的特定治疗效果，和(b)组合这种用于治疗个体敏感性的活性化合物领域中固有的局限性。
此处用到的“药学可接受的载体”或“赋形剂”包括生理相容的任何和全部溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌试剂，等渗剂和延缓吸收剂等。在一个实施方案中，该载体适宜胃肠外给药。可选择地，该载体可以适用于静脉内，腹膜内，肌内，舌下给药或口服。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉。这种药学上有活性物质的介质和试剂的应用在本领域是众所周知的。除去与该活性化合物不兼容的任何常规的介质和试剂，它们在本发明药学组合物中的使用均涵盖在内，其它的活性化合物也可掺入该组合物中。
治疗性组合物一般必需是无菌的，并且在制造和贮存的条件下是稳定的。该组合物可以配制成溶液，微乳剂，脂质体或与高药物浓度相宜的其它有序的结构。该载体可以是一种溶剂或分散介质，其中包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，和其适宜的混合物。合适的流动性可以通过例如使用诸如卵磷脂的包衣，维持分散液中所需的颗粒大小以及使用表面活性剂来维持。在许多情况下，在组合物中优选地包含等渗剂，例如，糖，多元醇，诸如甘露醇，山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包含一种能够延迟吸收的试剂例如，单硬脂酸盐和明胶，可以制备延长吸收的可注射组合物。而且，SS激动剂能够以时间释放形式给药，例如通过在包含缓释多聚体的组合物中完成给药。活性化合物能够与防止该化合物迅速释放的载体一起制备，这种控释制剂，包括植入体和微囊化的传送系统。可以使用生物可降解的生物相容的多聚体，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酸酐类，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，聚乳酸和乳酸-乙醇酸共聚物(PLG)。制备这种制剂的许多方法已申请专利或通常被本领域的技术人员所熟知。
通过向适宜的溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如SS激动剂)和上述一种或多种成分(如果必要)，接着过滤灭菌，可以制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体中而制备分散液。至于用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末，优选制备方法是真空干燥和冻干，从而由事先已过滤灭菌溶液得到活性成分与其它所需成分的粉末。依据本发明的一个可选择的方面，SS激动剂可以与一种或多种能够增加SS激动剂溶解性的其它化合物一起配制。
另外一种给药形式是眼部给药。SSTR1或SSTR4选择性激动剂可以由药学上可接受的眼用载体送递，从而使该化合物与眼睛表面的接触持续足够的时间，以允许该化合物渗入角膜和眼睛内部区域，如前房，后房，玻璃体，眼房水，玻璃体液，角膜，虹膜/睫状体，晶状体，脉络膜/视网膜，巩膜。药学可接受的眼用载体可以，例如，是一种软膏，植物油或包裹材料。可选择的，本发明的化合物可直接注入玻璃体液和眼房水内。在另外的选择中，该化合物可以被系统地给药，例如通过静脉内灌输或注射，用来治疗眼睛。在一些实施方案中，以SSTR1或SSTR4激动剂进行的抗血管形成处理可以在光动力治疗后实施(如1998年8月25日出版的U.S.5,798,349中描述的，在此引用作为参考)。
根据本发明的另外一个方面，本发明的包含SSTR1或SSTR4选择性激动剂的治疗性组合物，可以装在带有有关用SSTR1或SSTR4选择性激动剂治疗内皮细胞介导的增殖性疾病的说明书标签的容器中。
权利要求
1．SSTR1或SSTR4选择性激动剂在制备用于治疗内皮细胞介导的增殖性疾病的药物中的应用。
2．SSTR1或SSTR4选择性激动剂在制备用于治疗人患者中内皮细胞介导的增殖性疾病的药物中的应用。
3．根据权利要求1或2的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中内皮细胞介导的增殖性疾病是内膜增生。
4．根据权利要求1或2的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中内皮细胞介导的增殖性疾病是血管形成疾病。
5．根据权利要求4的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中血管形成疾病是年龄相关的黄斑变性。
6．根据权利要求4的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中血管形成疾病是实体瘤。
7．根据权利要求1-6中任一项的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中所述SSTR1或SSTR4选择性激动剂是des-AA1,2,5[DTrp8，IAamp9]SS。
8．根据权利要求1-6中任一项的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中所述SSTR1或SSTR4选择性激动剂是SSTR1选择性激动剂。
9．根据权利要求1-6中任一项的SSTR1或SSTR4选择性激动剂的应用，其中所述SSTR1或SSTR4选择性激动剂是SSTR4选择性激动剂。
10．一种治疗内皮细胞介导的增殖性疾病的方法，包括给有此需要的人患者施用治疗有效量的SSTR1或SSTR4选择性激动剂。
11．根据权利要求10的方法，其中内皮细胞介导的增殖性疾病是内膜增生。
12．根据权利要求10的方法，其中内皮细胞介导的增殖性疾病是血管形成疾病。
13．根据权利要求12的方法，其中血管形成疾病是年龄相关的黄斑变性。
14．根据权利要求12的方法，其中血管形成疾病是实体瘤。
15．根据权利要求10-14中任一项的方法，其中SSTR1或SSTR4选择性激动剂是des-AA1,2,5[DTrp8，IAamp9]SS。
16．根据权利要求10-14中任一项的方法，其中SSTR1或SSTR4选择性激动剂是SSTR1选择性激动剂。
17．根据权利要求10-14中任一项的方法，其中SSTR1或SSTR4选择性激动剂是SSTR4选择性激动剂。
18．一种抑制血管形成的方法，包括给有此需要的人患者施用治疗有效量的SSTR1或SSTR4选择性激动剂。
19．一种抑制内膜增生的方法，包括给有此需要的人患者施用治疗有效量的SSTR1或SSTR4选择性激动剂。
20．用于治疗内皮细胞介导的增殖性疾病的组合物，其中包含SSTR1或SSTR4选择性激动剂以及药学可接受的载体。
21．一种调节人内皮细胞的方法，包括用有效量的SSTR1或SSTR4选择性激动剂处理所述细胞。
22．根据权利要求21的方法，其中对人内皮细胞的活性进行调节以抑制血管形成。
23．根据权利要求21的方法，其中对人内皮细胞的活性进行调节以便对该细胞产生与促生长素抑制素相同的作用。
全文摘要
本发明提供了利用SSTR1或SSTR4选择性激动剂治疗人内皮细胞和配制人用药物的应用,其中该药物可以用来治疗内皮细胞介导的增殖性疾病。SSTR1或SSTR4选择性激动剂治疗内皮细胞介导的增殖性疾病的应用可以包含,例如,内膜增生或血管增殖疾病的治疗。在不同的实施方案中,血管增殖病可能是例如黄斑变性,或实体瘤。SSTR1或SSTR4选择性激动剂可以包含SSTR1′499激动剂(des－AA
文档编号A61P27/00GK1320042SQ99811513
公开日2001年10月31日 申请日期1999年9月1日 优先权日1998年9月1日
发明者Y·希桑, A·布昌, J·G·莱维, P·M·C·玛佳隆 申请人:不列颠哥伦比亚大学, Qlt公司