专利名称：一种蝉拟青霉分生孢子在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药和天然药物技术领域，具体涉及蝉拟青霉分生孢子在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
蝶拟青霉(Paecilomyces cicadae)是中药蝶花的无性型,属虫生性药用真菌,在我国的认识和利用已有悠久的历史。南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》云“蝉花，凡使要白花全者，收得后于屋下东南悬干，去甲土后，用浆水煮一日至夜，焙干碾细用之”。目前在市场上流通的蝉花药材基本上为无性型的蝉拟青霉药材。现代研究表明， 蝉拟青霉具有免疫调节、抗疲劳抗应激、解热镇痛、镇静催眠、改善肾功能、抗肿瘤等作用。肿瘤化疗药物均有较大的毒副作用，这使得临床应用受到很大限制，并且肿瘤的治疗效果已经步入平台期，因此全世界对肿瘤治疗研究的投入不断加大，新药物和新疗法的开发正在加紧进行。蝉拟青霉的抗肿瘤作用虽有ー些报道，但基本集中在蝉拟青霉的水提物或多糖方面，研究发现，蝉花粗提物对癌细胞的生长有明显的抑制作用，且存在剂量关系，抑瘤作用与细胞周期有相关性；蝉拟青霉水提取总多糖能使人外周血单个核细胞的増殖率升高，较高浓度多糖能抑制白血病细胞株U937、K562的増殖，能提高人外周血单个核细胞的増殖能力，从而可能促进外周血单个核细胞的杀肿瘤活性。而对于蝉拟青霉分生孢子，目前尚未有对其进行研究和应用的报道。

发明内容
本发明的目的之一是为了提供一种蝉拟青霉分生孢子在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明的蝉拟青霉分生孢子可作为主要药效成分或主要药效成分之一广泛应用于抗肿瘤药物的制备。所述的抗肿瘤药物选自抗胃癌、抗宫颈癌、抗胶质瘤、抗胰腺癌、抗白血病、抗回盲肠癌或抗横纹肌肉瘤的药物。较优的，所述的抗肿瘤药物选自抗胃癌、抗宫颈癌(鳞癌)、抗胰腺癌、抗白血病或抗横纹肌肉瘤的药物。 最优的，所述的抗肿瘤药物选自抗胰腺癌的药物。本发明另一方面，公开了ー种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有治疗有效量的蝉拟青霉分生孢子及药学上可接受的载体，所述孢子与药学上可接受载体的总重量比例为
I 0. 5-1 2。药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉，纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、こ基纤维素和甲基纤维素，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇，如丙ニ醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚こニ醇，海藻酸，乳化剂，如Tween;润湿剂，如月桂基硫酸钠，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剤，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在ロ服的情况下产生可接受的ロ感或气味。本发明采用蝉拟青霉分生孢子制备的抗肿瘤药物，可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式，包括ロ服制剂，也包括胃肠外给药制剂。优选的是片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、透皮吸收剂以及喷雾剂。本发明的蝉拟青霉分生孢子制备的抗肿瘤药物，可按常规方法在临床上使用，例如ロ服。在使用时，蝉拟青霉分生孢子通常每人每天给药量至少为2g。具体剂量还应考虑给药途径、病人个体状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的蝉拟青霉分生孢子可采用下列步骤培养获得I)斜面菌种制备将蝉拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20 25°C下，培养3 5天;2)种子液的制备从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，20 25°C下，140 160rpm,培养3 5天即可制得蝶拟青霉种子液；3)将步骤2)中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10 15%接入液体培养基中，在20 25°C下，140 160rpm,振荡发酵3 5天；4)将步骤3)中制得的发酵液按重量百分比为3 10%接入灭菌后的固相培养基中，在温度为18 25°C，湿度为50 90%的条件下，静置开放式培养15 25天；5)孢子的分离与收集。较佳的，步骤I)中，所述斜面培养基为PDA固相培养基，其制备可由本领域技术人员參考现有技术进行配制。进ー步优选的，所述PDA固相培养基的制备方法为挑取新鮮马铃薯，去皮洗净并切碎后与水混合，其中，马铃薯和水的重量比例为I : (3 7),灭菌后过滤,其滤液为马铃薯煮汁，然后在所述马铃薯滤液中加入琼脂2%份，蔗糖2%份，加热溶解后加水补足使得体积至原来马铃薯滤液体积，然后分装至试管，灭菌后摆斜面，冷却后使用。较佳的，步骤2)、3)中，所述液体培养基的制备方法为挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗浄，切成小薄片后与水混合，其中，马铃薯的重量百分比为10 30%，煮沸后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入量百分比为I 10%的蔗糖，0. 01 1%的柠檬酸，加热溶解后补足剩余百分量的水，混合、灭菌后使用。较佳的，步骤4)中，所述固相培养基的制备方法为先将玉米粉和麸皮煮熟，将蔗糖、KN03、KH2PO4, MgSO4在水中溶解，再与蚕蛹粉、煮熟后的玉米粉和麸皮按照比例混合均匀，灭菌后使用。培养基各原料的组分为麸皮20 45重量份；玉米粉5 30重量份；鹿糖0. 5 5重量份；蚕蛹粉0. 5 5重量份；KNO30. I 3 重量份；
KH2PO40. 05 I 重量份；MgSO40. 05 0. 8 重量份；H2O25 70 重量份。或者，所述固相培养基还可为称取一定量的麸皮、蚕蛹粉、贝壳粉、营养液混合、灭菌后使用。培养基各原料的组分为麸皮40 70重量份；营养液30 60重量份；贝壳粉0. 01 2重量份； 蚕蛹粉0. 01 5重量份；其中，所述营养液中含有的组分名称及其重量百分比为KNO30. I 5 % ;蔗糖I 20%;KH2PO40.05 3%;MgSO40.01 0.5%;柠檬酸铵0. 01 0. 1% ;H2O余量。较佳的，步骤4)中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通；进一步优选的，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0. I 0. 3_/层，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固相发酵；更佳的，所述静置开放式培养过程中，在培养基上面覆盖多层厚度为0. I 0. 3_/层，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。本发明的蝉拟青霉分生孢子粉可通过下述步骤分离、收集(I)培养物烘干将培养物整体倒入沸腾干燥机，脱水烘干；(2)培养物粗粉碎将烘干的培养物进行粗粉碎，使孢子从培养物上脱落；(3)孢子分离开启旋风收集器，将孢子与培养物分离，使孢子从管道中进入收集室;(4)孢子收集孢子从管道中进入收集室，在收集室顶端通过微风装置将孢子吹至收集室底部收集袋，获得蝉拟青霉孢子粉。体外抗肿瘤活性实验结果表明，本发明的蝉拟青霉分生孢子加入各种人癌细胞的培养液中，对人胃癌、人宫颈癌、人胶质瘤、人胰腺癌、人白血病、人回盲肠癌或人横纹肌肉瘤的増殖具有一定的抑制作用。最优的，对人胰腺癌具有很好的抑制效果，且抑制作用存在剂量关系，抑瘤作用的原因可能与诱导细胞自噬及损伤肿瘤细胞膜，改变细胞形态，破坏细胞膜完整性及阻滞细胞周期，抑制细胞増殖，诱导细胞凋亡或坏死性凋亡等有夫。因此，本发明的蝉拟青霉分生孢子可作为主要药效成分或主要药效成分之一的原料广泛应用于抗肿瘤药物的制备，为抗肿瘤药物提供了新的来源。


图I :蝉拟青霉孢子粉对人胰腺癌SW1990细胞形态学的影响(A :空白对照；B_F 孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)
图2 :蝉拟青霉孢子粉对人宫颈癌Hela细胞形态学的影响(A :空白对照；B_F :孢子粉；G 5-氟尿嘧啶图3 :蝉拟青霉孢子粉对人回盲肠癌Ccl-244细胞形态学的影响(A :空白对照；B-F :孢子粉；G :5_氟尿嘧啶)图4 :蝉拟青霉孢子粉对人横纹肌肉瘤RD细胞形态学的影响(A :空白对照；B_F 孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)图5 :蝉拟青霉孢子粉对人胶质瘤LN229细胞形态学的影响(A :空白对照；B_F :孢子粉；G :环磷酰胺)图6 :蝉拟青霉孢子粉对人胃癌HGC27细胞形态学的影响(A :空白对照；B_F :孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)图7 :孢子粉对人胰腺癌SW1990细胞周期的影响(A :空白对照；B lmg/ml孢子粉； C 5uM 5-氟尿嘧啶)图8 :孢子粉对人白血病K562细胞周期的影响(A :空白对照；B lmg/ml孢子粉；C 5uM5-氟尿嘧啶)图9 :孢子粉对人宫颈癌Hela细胞周期的影响(A :空白对照；B lmg/ml孢子粉；C 5uM5-氟尿嘧啶)
具体实施例方式下面通过具体实施例进ー步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例所用到的实验药品、仪器如下I.实验药品药品名称药品来源
权利要求
1.蝉拟青霉分生孢子在制备抗肿瘤药物中的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，蝉拟青霉分生孢子作为所述抗肿瘤药物的主要药效成分或主要药效成分之一的原料应用于抗肿瘤药物的制备。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗胃癌、抗宫颈癌、抗胶质瘤、抗胰腺癌、抗白血病、抗回盲肠癌或抗横纹肌肉瘤的药物。
4.一种抗肿瘤药物，含有治疗有效量的蝉拟青霉分生孢子及药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述抗肿瘤药物，其特征在于，所述治疗有效量蝉拟青霉分生孢子与药学上可接受载体的总重量比例为I : 0.5-1 2。
6.如权利要求4所述抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、透皮吸收剂或喷雾剂。
7.如权利要求4所述抗肿瘤药物，其特征在于，所述蝉拟青霉分生孢子由下列步骤培养获得 (1)斜面菌种制备将蝉拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20 25°C下，培养3 5天; (2)种子液的制备从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的液体培养基中，20 25°C下，140 160rpm,培养3 5天制得蝶拟青霉种子液； (3)将步骤2)中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10 15%接入液体培养基中，在20 25°C下，140 160rpm，振荡发酵3 5天； (4)将步骤3)中制得的发酵液按重量百分比为3 10%接入灭菌后的固相培养基中，在温度为18 25°C，湿度为50 90%的条件下，静置开放式培养15 25天； (5)孢子的分尚与收集。
8.如权利要求7所述的的抗肿瘤药物，其特征在于，步骤(4)中所述固相培养基，其原料及组分为 麸皮 20 45重量份； 玉米粉 5 30重量份； 鹿糖 0. 5 5重量份； 蚕蛹粉 0. 5 5重量份； KNO3 0. I 3重量份； KH2PO4 0. 05 I重量份； MgSO4 0. 05 0. 8 重量份； H2O25 70重量份。
9.如权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，步骤(4)中所述固相培养基的另一原料组分为 麸皮 40 70重量份； 营养液 30 60重量份； 贝壳粉 0.01 2重量份； 蚕蛹粉 0. 01 5重量份； 其中，所述营养液中含有的组分名称及其重量百分比为 KNO30. I 5% ;庶糖I 20% ；KH2PO40.05 3%;MgSO40.01 0.5%; 朽1檬酸铵0. 01 0. 1% ；H2O余量。
全文摘要
本发明提供了一种蝉拟青霉分生孢子在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首次将蝉拟青霉分生孢子应用于抗肿瘤药物的制备。体外实验表明，蝉拟青霉分生孢子对多种人肿瘤细胞具有明显的抑制作用，且抑制效果存在剂量关系。本发明为抗肿瘤药物的制备提供了新的来源。
文档编号A61P35/02GK102755357SQ20111011191
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者孙长胜, 王玉芹, 盖悦, 谭悠久, 陈祝安 申请人:上海泛亚生命科技有限公司