专利名称：卡洛孢苷衍生物、其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的活性物质(卡洛孢苷衍生物)，其是在微生物Gloeoporus dichrous Bres.ST001714，DSM 13784发酵时形成的，还涉及它们的制备方法、它们作为药物的应用、含有卡洛孢苷衍生物的药物和微生物Gloeoporus dichrous Bres.ST 001714，DSM 13784。
1994年卡洛孢苷首次被描述为磷脂酶C的抑制剂(W.Weber等，J.Antibiotics，47，1188-1194)。同年，分离出了两个其他类似的次级代谢物(R.Shan等，Nat.Prod，Lett.，4，171-178)。式I(下面)所示本发明化合物和其中所描述的物质在结构上不同。
癌症是人和动物的疾病，它通常是致命的，是由机体本身细胞的失控生长引起的。癌症是给予瘤(肿瘤或癌)恶性生长的形成或者白细胞恶性退化和成熟障碍(白血病)的名字。通过机体本身细胞的转化而形成癌细胞或肿瘤细胞。癌细胞的恶性通过生长的自主性显示出来，也就是说它能不受抑制的、浸润性的生长而不会适应器官的结构安排并破坏组织。恶性的一个确切的标志是在肿瘤细胞随血液或淋巴液传播后，在远离肿瘤的地方形成转移。癌症是人类最普遍的死因之一，因此非常需要治愈或治疗恶性退化的方法和手段。
恶性肿瘤的可能疗法除了手术切除肿瘤外，可能的根本方法还有用X射线、α、β、γ射线进行照射的放射性治疗，免疫治疗和化学治疗。免疫治疗在现今应用程度有限。肿瘤的化学治疗意味着施用细胞毒(细胞抑制剂)治疗肿瘤和局部手术治疗或放射治疗后的残余肿瘤细胞。这些物质特异性干涉细胞分裂的特定过程，从而有高比例的正在分裂的细胞的组织(如快速生长的肿瘤组织)反应更加敏感。所使用的有烷基化化合物，例如环磷酰胺(The Merk Index，12thEd.page 463)，代谢拮抗剂如氨甲蝶呤(TheMerk Index，12thEd.page 1025)，生物碱如长春新碱(The Merk Index，12thEd.page 1704)和抗生素如道诺霉素(The Merk Index，12thEd.page479)和阿霉素(The Merk Index，12thEd.page 581-582)。然而，由于多方面的副作用，所有这些药物都有很多的缺点以致病人的死亡只能延迟而不能避免。此外，在退化(癌)细胞中出现了抗药性。这样现在的药物不再有细胞抑制作用，但因为副作用而具有毒性。而且，组合或依次使用细胞抑制剂超过单个细胞抑制剂(单疗)的疗效，这一事实已经显现出来，这样多化学疗法有可能不会增加很大的副作用。由于所有这些原因，很需要并在世界范围内寻找新的化疗药物。
细胞周期蛋白依赖的激酶(＝CDK)在调节细胞周期中起着中心的角色。它们催化磷酸化反应从而启动反应的级联，引起细胞周期中G1期(生长期1)向S期(合成期)的过渡。细胞周期蛋白依赖的激酶因此代表治疗癌症和其他细胞增殖病理障碍的疾病的好的治疗目标。调节细胞周期并防止细胞失控分裂的低分子量的抑制剂将是对治疗癌症病人有用的药物。
申请人令人惊讶地发现，在微生物菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM 13784能够高效生产在极低浓度时抑制细胞周期蛋白依赖的激酶的新的细胞抑制剂。
因此，本发明涉及菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM 13784产生的活性物质(卡洛孢苷衍生物)及其生理上可耐受的盐、酯和明显的化学等价物。
这样本发明涉及式I所示化合物及其生理上可耐受的盐
其中R1、R2和R3是互相独立的，是H或有2-10个碳原子、优选2到6个原子、特别优选2个原子的酰基；且R4为H或-C(O)(CH2)nCOOH，其中n为1到7，优选1到3，特别优选1或2；但R1、R2、R3和R4不同时全是H。
式I所示化合物的酰基可以是直链或有分支的，饱和的或单不饱和的或二不饱和的。
有2个碳原子的酰基是指例如乙酰基。
饱和的、无分支的酰基的例子有乙酸残基(C＝2)、丙酸残基(C＝3)、丁酸残基(C＝4)、戊酸残基(C＝5)、己酸残基(C＝6)、庚酸残基(C＝7)、辛酸残基(C＝8)、壬酸残基(C＝9)、癸酸残基(C＝10)。
单不饱和的无分支的酰基的例子有丙烯酸残基(C＝3)、丁烯酸残基(C＝4)或乙烯基乙酸残基(C＝4)。
二不饱和的无分支的酰基的例子是山梨酸残基(C＝6)。
卡洛孢苷是活性很弱的抗生素，由一个水杨酸和一个二糖组成。这两个结构单位由一个烷基链连接。式I所示化合物中的糖基元可以是二糖，其在每种情况下由D-吡喃糖型的己醛糖(例如D-吡喃葡萄糖或D-吡喃半乳糖)和己醛糖的糖酸(onic acid)(例如葡萄糖酸)组成。糖基元优选为D-吡喃甘露糖基-D-甘露糖酸，其不被或被上面定义的R2、R3和/或R4所代替。
本发明还涉及
a)式I所示化合物(其中R1＝乙酰基；R2＝R3＝R4＝H(＝卡洛孢苷B分子式C38H62O16，MW 774.9))和其生理上可耐受的盐；b)式I所示化合物(其中R1＝R3＝乙酰基；R2＝H；R4＝丙二酰基(＝卡洛孢苷C分子式C43H66O20，MW 902.99))和其生理上可耐受的盐；c)式I所示化合物(其中R1＝R2＝H；R3＝乙酰基；R4＝丙二酰基(＝卡洛孢苷D分子式C41H64O19，MW 806.96))和其生理上可耐受的盐；d)式I所示化合物(其中R1＝R3＝H；R2＝乙酰基；R4＝丙二酰基(＝卡洛孢苷E分子式C41H64O19，MW 806.96))和其生理上可耐受的盐；e)式I所示化合物(其中R1＝R2＝R4＝H；R3＝乙酰基；(＝卡洛孢苷F分子式C38H62O16，MW 774.9))和其生理上可耐受的盐。
除非另外说明，式I所示化合物手性中心可是R或S构型。本发明涉及旋光纯的化合物，还涉及立体异构体混合物，如对映异构体的混合物和非对映异构体混合物。
根据本发明，可通过在合适的条件下于培养基中发酵Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784或者其变种或突变株，直到在培养基中积累式I所示的一种或多种卡洛孢苷衍生物，由此得到式I所示化合物。通过随后将化合物分离，并在适当时转化成化学等价物和其生理上可耐受的盐得到卡洛孢苷衍生物。
因此，本发明还涉及制备式I所示化合物的方法，该方法包含在合适的条件下于培养基中发酵微生物Gloeoporus dichrous(Fr..Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784或者其一种变种或突变株，直到在培养基中积累一种或多种目标化合物，随后将该化合物从培养基中分离，并在适当时转化成化学等价物和/或其生理上可耐受的盐。
菌株ST 001714，DSM 13784，其突变株和/或变种优选在有碳源和氮源以及常用无机盐的营养溶液或固体培养基(也称作培养基)中发酵，直到在培养基中积累本发明化合物，然后从培养基中分离这些化合物，并在适当时分成单独的活性组分。
本发明的方法可用于实验室规模(毫升到升的范围)和工业规模(立方米的范围)的发酵。
菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714生长在预培养基中。根据布达佩斯条约的规定，于1999年12月14日将分离株保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，3300 Brunswick，Germany)，保藏号DSM13784。
Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784有白色的菌丝体和紫色的孢子。它优先在桦木属中发生，但也可感染其他宿主，例如桤木属、柳属、杨属、榆属、李属。
也可用能合成一种或多种本发明化合物的菌株Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784的突变株和变种将其代替。这样的突变株可用本身已知的方法通过物理手段例如放射(如用紫外线或X射线)或化学突变剂如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)产生。
筛选合成本发明一种或多种化合物的突变株和变种根据下面的方案进行-将平板培养物冻干；-用有机溶剂提取冻干物；-用固相从培养滤液中提取该化合物；和-通过HPLC、TLC或分析生物活性进行分析。
下面描述的发酵条件应用于Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，已保藏的分离株DSM 13784和其突变株与变种。
在含有碳源和氮源以及通常的无机盐的营养溶液中，Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784产生卡洛孢苷衍生物。
合适的且优选的发酵碳源为可同化的糖类和糖醇如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露醇以及含糖的天然产物，例如麦芽膏。合适的含氮营养物为氨基酸、肽和蛋白质以及它们的降解产物如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨，还有肉膏、酵母抽提物，碾磨过的种子如谷物、小麦、豆、大豆或棉树的种子，酒渣、肉粉或酵母抽提物，但还有铵盐和硝酸盐，但特别还有合成的或生物合成的肽。营养溶液可能含有的无机盐为例如，碱金属或碱土金属、铁、锌、钴和锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
在营养溶液中本发明化合物产生的特别好，该营养溶液含有约0.05％到5％、优选1％到2％的麦芽膏，0.05％到3％、优选0.05％到1％的酵母抽提物和0.2％到5％，优选0.5％到2％的葡萄糖，0.5％到3％、优选0.5％到3％的纤维素粉和微量硫酸铵。每种情况的百分数基于整个营养溶液的重量。
在该营养溶液中，Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784产生卡洛孢苷衍生物的混合物。本发明一种或多种卡洛孢苷衍生物的量可能依赖营养溶液的组成而变化。此外，可能通过改变培养基的组成控制各种卡洛孢苷衍生物的合成，以致某种卡洛孢苷衍生物根本不产生或者由微生物产生的量在检测到的极限以下。
该微生物进行需氧培养，就是说，例如在摇瓶或发酵罐中摇动或搅动浸没培养，适当时通入空气或氧气或者在固体培养基中培养。发酵可在温度范围为约18到35℃、优选约20到30℃、特别是在25到30℃进行。pH范围应该在5到8之间，优选5.5和6.5之间。该微生物一般在这些条件下培养24到720小时，优选288到576小时。
培养有利的是分为多个阶段进行，即首先在液体培养基中产生一个或多个预培养物，然后转移到实际的生产培养基，例如体积比为1∶10主培养基中。例如通过将菌丝体转移到营养溶液并让其生长约36到120小时，优选48到72小时得到预培养物。菌丝体可通过例如将菌株在固体或液体营养培养基如麦芽/酵母琼脂或土豆/右旋糖琼脂中生长约3到40天，优选10到30天得到。
可基于培养液的pH或菌丝体的体积和层析方法如高效液相层析(HPLC)或特定生物活力监视发酵的进展。
下面描述的分离方法用于纯化本发明的卡洛孢苷衍生物。
考虑到天然物质的化学、物理和生物特性，用已知的方法从培养液中分离或纯化本发明的卡洛孢苷衍生物。HPLC可用于分析培养液中或各个分离阶段的各种卡洛孢苷衍生物的浓度，用校准液方便地比较所产生物质的量。
为了分离本发明化合物，将培养液或连带固体培养基的培养物冻干，然后用可选地能与水混合的有机溶剂将卡洛孢苷衍生物从冻干物中提取出来。有机溶剂相含有本发明的天然物质，适当时将其真空浓缩并进一步纯化。
本发明的一种或多种化合物的进一步纯化通过在合适的物质上层析进行，例如优选在分子筛、硅胶、氧化铝上，在离子交换剂或吸附树脂或在反相(反相，RP)上进行。卡洛孢苷衍生物通过该层析分离。卡洛孢苷衍生物的层析用缓冲水溶液或水和有机溶液的混合液进行。
水或有机溶液的混合液指所有水混溶的有机溶剂，优选甲醇、丙醇和乙腈，在浓度为5到80％、优选20到50％的溶剂中，或者所有缓冲的和有机溶剂混溶的水溶液。所要用的缓冲液和上面所说的相同。
卡洛孢苷衍生物的分离是基于它们极性的不同时用反相层析进行，例如在MCI(来自Mitsubishi，Japan的吸附树脂)或Amberlite XAD(TOSOHAAS)上，在其他疏水物质如RP-8或RP-18相上进行。还可用正相层析如在硅胶、氧化铝等上进行分离。
卡洛孢苷衍生物的层析用缓冲的或酸化的水溶液或水溶液与乙醇或其他与水混溶的有机溶剂的混合液进行。丙醇和乙腈优选用作有机溶剂。
缓冲的或酸化的水溶液指，例如水、磷酸盐缓冲液，乙酸铵溶液、柠檬酸盐缓冲液，浓度为0到0.5M，以及甲酸、乙酸、三氟乙酸或技术人员所知的所有商业上可得到的酸，优选浓度为0到1％。对于缓冲水溶液，优选0.1％的乙酸铵。
层析以梯度进行，该梯度起始为100％的水，最终为100％的溶剂，优选用20％到100％的丙酸或乙腈的线性梯度进行。
一个备选的方案是进行凝胶层析或疏水层析。
凝胶层析在聚丙烯酰胺或共聚物胶，如Biogel-P 2(Biorad)或Fractogel TSK HW 40(Merck，Germany或Toso Haas，USA)上进行。
上述层析的顺序可以颠倒。
本发明化合物在固态和pH范围在3到8、优选5到7之间的溶液中稳定，这样其可并入常规药物制剂中。
由于它们宝贵的药理学性质，本发明化合物的一种或多种化合物适合用在人或兽药作为药物。
这样本发明涉及式I所示化合物或其生理上可耐受的盐的应用，用于生产治疗癌症的细胞抑制剂。
本发明还涉及本发明式I所示化合物的所有明显的化学等价物。这些等价物为显示出轻微的化学上不同的化合物，也就是说，有相同的功效或在温和条件下能转化成本发明化合物的化合物。上述等价物还包括，例如本发明化合物的盐、还原产物、酯、醚、缩醛或酰胺，以及技术人员用标准方法可制备的等价物，还包括所有旋光对映体、非对映体和所有立体异构的形式。
式I所示化合物的生理上可耐受的盐指其有机和无机盐，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(17thedition，1418页(1985))中有描述。由于物理和化学稳定性和可溶性，优选酸性基团的钠、钾、钙和铵盐；优选碱性基团的盐酸、硫酸、磷酸或羧酸或磺酸如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸和p-甲苯磺酸的盐。
酯、醚和缩醛可通过文献例如在Advanced Organic Synthesis，4thEdition，J.March，John Wiley & Sons，1992或Protective Groups inOrganic Synthesis 3rdEdition，T.W.Greene & P.G.M.Wuts，John Wiley& Sons，1999中描述的方法制备。
羧基可用例如LiAlH4还原成醇。
最初可通过碱水解除去式I所示化合物的苷部分(W.Weber等，J.Antibiotics，47，1188-1194)。然后可通过糖基化作用引入任何想要的糖残基(例如Knigs-Knorr反应)。相应方法在文献例如在CarbohydrateChemistry，J.F.Kennedy，Oxford University Press，1988中有描述。
卡洛孢苷衍生物作用的机理还不知道，但可检测到它们的重要的效应。
通过一种试验检测到CDK的抑制剂，在该试验中，测定了细胞周期蛋白依赖的激酶对特异性肽底物的磷酸化速度。细胞周期蛋白依赖的激酶通过结合特定细胞周期蛋白而被激活。[γ-P]-磷酸盐被该酶从[γ-P]-ATP转移到肽底物。该试验在96孔微量滴定板中进行测定了转移到底物的[γ-P]-磷酸盐的放射性。
卡洛孢苷衍生物的IC50值见表1所示；它是使50％的CDK-4失活的浓度。
本发明还涉及含有至少一种本发明化合物的药物。
本发明卡洛孢苷衍生物的一种或多种化合物原则上可不用稀释而直接给药。优选的应用是和合适的赋形剂或载体物质混合。可用的载体物质是药理学上合适的且药物中常用的载体物质和/或赋形剂。
本发明药物一般口服或胃肠外给药，但原则上也可直肠给药。合适的固体或液体药物制剂为，例如颗粒剂、散剂、(包衣的)片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、混悬剂、气溶胶、滴剂或安瓿注射液的形式以及缓释活性物质的产品，在其生产过程中使用通常的载体和添加剂和/或助剂例如崩解剂或粘合剂、包衣剂、溶胀剂、助流剂或润滑剂、调味剂、增甜剂或加溶剂。可能提到的常用的载体或赋形剂为，例如碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖，滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇、甘油和多元醇。
口服剂量单位可适时微胶囊化以便延迟释放或延长至更长的时期，例如通过将活性物质颗粒包衣或嵌入合适的聚合物、蜡等中。
该药物产品优选以剂量单位生产并给药，每剂量单位含有特定剂量的本发明卡洛孢苷衍生物的一种或多种化合物作为其活性成分。对于固体剂量单位如片剂、胶囊和栓剂，该日剂量可最多约500mg，但优选约0.1到200mg，对于安瓿注射液的形式，每天最多约200mg，但优选约0.5到100mg。
所要施用的日剂量取决于哺乳动物的体重、年龄、性别和身体状况。然而，在某种情况下，高一点或低一点的日剂量也是合适的。日剂量的施用可通过单个剂量单位或多个小剂量单位一次性给药，也可在特定间隔后将分开的剂量多次给药。
本发明的药物通过用常用载体，合适时，添加剂和/或赋形剂将一种或多种本发明化合物转化成合适的剂型生产。
本发明用下面的实施例进一步说明。百分数值基于重量。除非另外指出，液体的混合比基于体积。
实施例实施例1制备Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM13784的甘油培养物置于300ml无菌锥形瓶中的100ml营养溶液(麦芽膏2.0％，酵母抽提物0.2％，葡萄糖1.0％，(NH4)2HPO40.05％，pH6.0)在25℃、140rpm的旋转振荡器上与菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM13784孵育一起7天。取该培养物1.5ml，然后用2.5ml 80％甘油稀释并保存在-135℃。
实施例2在装有Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM13784的锥形瓶中制备预培养物置于100ml无菌锥形瓶中的30ml营养溶液(麦芽膏2.0％，酵母抽提物0.2％，葡萄糖1.0％，(NH4)2HPO40.05％，pH 6.0)在25℃、140rpm的旋转振荡器上与菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784一起孵育4天。然后，2ml该预培养物用于接种平板以制备主要培养物。
实施例3在固体培养平板上制备Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784的主要培养物将无菌25×25cm平板(得自Nunc)中倒入200ml下面的营养溶液20g/l麦芽膏、2g/l酵母提取物、10g/l葡萄糖和0.5g/l(NH4)2HPO4，pH6.0。这些平板每个接种2ml预培养物。约480J时后达到本发明一种或多种化合物的最大产量。
实施例4生产卡洛孢苷衍生物准备50个25×25cm的平板并接种预培养物营养培养基20g/l麦芽膏2g/l酵母提取物10g/l葡萄糖0.5g/l(NH4)2HPO4pH6(灭菌前)孵育时间480小时孵育温度25℃实施例5从Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM13784的平板培养物中分离卡洛孢苷混合物完成Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784的发酵后，将按照实施例3所得的平板培养物冻干，冻干物用5升甲醇提取。将含有活性物质的甲醇溶液过滤除去残渣并真空浓缩。浓缩物用水稀释后加样到事先准备的1.0升MCI GEL，CHP20P柱。用从水到100％乙腈梯度洗脱。将柱流出液(25ml/min)分部收集(每部分25ml)，并将含有卡洛孢苷衍生物的部分(从40％乙腈到100％乙腈洗脱部分)合并。真空浓缩并冻干得到8.5g黄褐色粉末。
实施例6用RP18层析初步分离卡洛孢苷衍生物将0.5g实施例4所得产物加样到Nucleosil100-7 C18 HD柱(柱体40mm×250mm)。用20％乙腈(+水及0.1％乙酸铵)到100％乙腈梯度洗脱，流速为35ml/min。分部(35ml)收集柱流出液。卡洛孢苷衍生物主要在第39到第68部分。将它们合并，真空除去溶剂并冻干。这样得到卡洛孢苷B(22.4mg)和F(10.5mg)的纯度已经大于95％。所得卡洛孢苷C(第41部分；43.4mg)、D(第43-45部分；76.2mg)和E(第43-45部分；76.2mg)纯度约70％，因此用层析进一步纯化。
实施例7纯化卡洛孢苷C、D和E将20mg实施例5中分离浓缩的卡洛孢苷C加样到LUNA5μC18(2)柱(柱体10mm×250mm)并用溶于0.1％乙酸铵/水的25到35％的乙腈梯度层析。洗脱液流速为6.5ml/min，每部分为6.5ml。卡洛孢苷C在第35到42部分中。将上述部分冻干得到纯度大于95％的卡洛孢苷C(7.5mg)。
将25mg实施例5所得的卡洛孢苷D和卡洛孢苷E的混合物加样到LUNA5μC18(2)柱(柱体10mm×250mm)并用溶于0.1％乙酸铵/水的30到40％的乙腈梯度层析。洗脱液流速为6.5ml/min，每部分为6.5ml。卡洛孢苷D在第18和19部分中，卡洛孢苷E在第20到21部分中。将上述部分冻干得到纯度大于95％的卡洛孢苷D(7.0mg)和卡洛孢苷E(6.0mg)。
本发明物质的理化和光谱性质概述于下
卡洛孢苷B分子式C38H62O16分子量774.9UV最大208、244、3101H-和13C-NMR见表2高分辨FAB质谱表明在m/z 775.4120Da处有强MH+信号，和计算得到的质量(对C38H63O16，单种同位素)775.4116Da很好的吻合。
卡洛孢苷C分子式C43H66O20分子量902.99UV最大208，244，3101H-和13C-NMR见表3高分辨FAB质谱表明在m/z 903.4264Da处有强M+H+信号，和计算得到的质量(对C36H71O25，单种同位素)903.4284Da很好的吻合。
卡洛孢苷D分子式C41H64O19分子量860.96UV最大208、244、3101H-和13C-NMR见表4高分辨FAB质谱表明在m/z 883.3942Da处有强M+Na+信号，和计算得到的质量(对C41H64O19Na，单种同位素)883.3939Da很好的吻合。
卡洛孢苷E分子式C41H64O19分子量860.96UV最大208、244、3101H-和13C-NMR见表4高分辨FAB质谱表明在m/z 833.3942Da处有强M+Na+信号，和计算得到的质量(对C41H64O19Na，单种同位素)883.3939Da很好的吻合。
卡洛孢苷F分子式C38H62O16分子量774.9UV最大208、244、3101H-和13C-NMR见表5高分辨FAB质谱表明在m/z 775.4128Da处有强M+H+信号，和计算得到的质量(对C38H63O16，单种同位素)775.4116Da很好的吻合。
表2在甲醇-d4和DMSO-d6中于300K测定卡洛孢苷B的1H和13C化学位移
a)在MeOD或DMSO(聚集)中没有观察到这些质子/碳原子的信号。
表3在甲醇-d4中于300K测定卡洛孢苷C的1H和13C化学位移
a)没有观察到这些原子核的信号(信号变的很宽)。
b)信号变宽c)8’位的质子信号仅在新鲜制备的溶液中观察到(与氘快速互换)。
表4在甲醇-d4中于300K测定卡洛孢苷D和E的1H和13C化学位移
a)这些信号不能清楚的匹配。
表5在甲醇-d4中于300K测定卡洛孢苷F的1H和13C化学位移
实施例8CDK-4抑制剂的生物分析为了确定IC50，所制备的本发明天然物质的储备液浓度为10mM。将384孔闪光板在室温用50μl(50μg/孔)生物素标记的肽底物包被2小时后用PBS缓冲液洗涤3次。反应时，将30μl用缓冲液稀释的卡洛孢苷衍生物和20μl事先混合的ATP/细胞周期蛋白D1/CDK4溶液(终浓度1μCi33P-γ-ATP，2μM ATP和1μg酶混合物)吸移到板上。37℃反应2小时后，将板每次用80μl3％的磷酸洗涤3次，然后用MicroBeta计数器计数30秒。用数学方程式确定抑制百分比。为了确定IC50值，分析10个浓度的新鲜稀释的本发明物质的DMSO溶液。
国际保藏证明相关部分的中文译文安万特医药德国有限公司65926法兰克福1.微生物特征保藏人赋予的特征参考号ST 001714国际保藏机构赋予的保藏号DSM 137842.科学描述和/或分类名称给出的分类名称3.收到日本国际保藏机构于2000年10月13日收到上述1中的微生物。
4.略。
5.国际保藏机构名称德意志微生物保藏中心
权利要求
1.式I所示化合物及其生理上可耐受的盐 其中R1、R2和R3是互相独立的，为H或有1-10个碳原子的酰基；R4为H或-C(O)(CH2)nCOOH，其中n为1到7；但R1、R2、R3和R4不同时全是H。
2.权利要求1中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1、R2和R3是互相独立的，为H或乙酰基；且R4为H或丙二酰基(n＝1)。
3.权利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1为乙酰基；且R2、R3和R4为H。
4.权利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1和R3为乙酰基；R2为H；且R4为丙二酰基。
5.权利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1和R2为H；R3为乙酰基；且R4为丙二酰基。
6.权利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1和R3为H；R2为乙酰基；且R4为丙二酰基。
7.权利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的盐，其中R1、R2和R4为H；且R3为乙酰基。
8.权利要求1-7中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐，其可通过微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM 13784或其变种或突变株之一在合适的条件下发酵、分离一种或多种卡洛孢苷衍生物并在适当时将其转化成生理上可耐受的盐得到。
9.制备权利要求1-7中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐的制备方法，其包括将微生物Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714，DSM 13784或其变种或突变株之一在合适的条件下发酵、分离一种或多种卡洛孢苷衍生物并在适当时将其转化成生理上可耐受的盐。
10.权利要求9所要求的方法，其中发酵在有氧、温度18到35℃，pH5到8的条件下进行。
11.用作药物的权利要求1-8中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐。
12.用作CDK抑制剂的权利要求1-8中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐。
13.权利要求1-8中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐的应用，用于生产治疗癌症或其他有细胞增殖病理障碍的疾病的药物。
14.含有至少一种权利要求1-8中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐的药物。
15.权利要求14所要求的药物的生产方法，其包括将至少一种权利要求1-8中之一项或多项所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的盐及合适的赋形剂和/或载体转化成合适的剂型。
16.微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM13784。
全文摘要
本发明涉及新的活性物质(卡洛孢苷衍生物)，其是在微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM13784发酵时形成的。本发明还涉及生产上述活性物质的方法、它们作为药物的应用、含有卡洛孢苷衍生物的药物，还涉及微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714，DSM 13784本身。
文档编号A61K35/74GK1499976SQ02807479
公开日2004年5月26日 申请日期2002年2月23日 优先权日2001年3月9日
发明者C·埃德, M·库尔茨, M·布伦斯特鲁普, L·托蒂, C 埃德, 姿固芈称 申请人:安万特医药德国有限公司