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鸡新城疫和h9n2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法

发布时间:2025-04-25

专利名称:鸡新城疫和h9n2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体涉及一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟,具有很高的发病率和病死率,是危害养禽业的一种主要传染病,OIE将其列为A类疫病。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病,以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高,对养鸡业危 害严重。1926年首先发现于印度尼西亚,不久又在英国新城发现,世界各国均有流行记载。
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属,因为该病毒是AIV负链、分节段的RNA病毒,所以该病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍,引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来,该亚型的病毒不断传播,目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染,H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型,占禽流感总发病率的90%以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30%),但常导致呼吸道症状,蛋鸡的产蛋下降,并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病,影响家禽生产性能。AIV不仅对我国的养殖业造成了严重的损失,而且对人类健康也构成了威胁。目前新城疫、H9N2亚型禽流感严重危害家禽养殖业的发展,在各种防控措施中,疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、H9N2亚型禽流感,已有相应的灭活单苗及二联灭活苗,但是免疫剂量大,抗体水平低,对流行毒株的交叉免疫保护率不高,给免疫鸡群带来一定的风险。因此,研制出免疫剂量小,交叉免疫效果更好的新城疫、禽流感H9N2亚型二联苗是一项具有重要意义的工作。

发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,该二联灭活疫苗中含有的H9亚型禽流感病毒HN03株,免疫原性好,产生的抗体水平高,不仅能够抵抗同源病毒攻毒,而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒;该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体,持续期长。本发明的另一目的在于提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法,该方法简单,安全。本发明采用如下技术方法来实现发明目的
一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,含有鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株;所述禽流感病毒 A/chicken/HeNan/03/2009/ (H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株,保藏号为CGMCC NO :6258。所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: I 30一种制备所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,包括如下步骤
Cl)病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚,分别收获鸡胚液,作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液;
(2)病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩,然后分别加入丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液;
(3)水相制备将鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液混合,获得混合病毒液;将混合病毒液与吐温-80混合,制得水相;
(4)油相制备将注射用白油和司本一80混匀,作为油相;
(5)乳化将水相和油相混合均匀,即得鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗。步骤(2)中,所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3X108_° EID5tl 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亚型禽流感病毒HNO3株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后禽流感Η9病毒液中病毒含量为3Χ IO8'0 EID50 3 XlO8- 5EID500所述步骤(2)中各灭活病毒液中β -丙内酯的体积百分数为O. 04% O. 06%。步骤(3)中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液与Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液的体积比为2:1 3 ;步骤(3)中所述混合病毒液与吐温_80混合的体积比为96 4。步骤(4)中所述注射用白油和司本一 80混合的体积比为94 6。步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:3。有益效果
本发明鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗中含有的Η9亚型禽流感病毒ΗΝ03株,是发明人自行分离、筛选、鉴定的,该毒株免疫原性好,产生的抗体水平高,不仅能够抵抗同源病毒攻毒,而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SHOl、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒;该二联灭活疫苗能够使接种对象产生高水平的抗体,持续期长,不仅能够抵抗Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒,而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SH01、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒。本发明制备鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗的方法,简单,安全。因为制备方法中对病毒液进行了浓缩,所以提高单位体积疫苗中的抗原含量,有效降低了使用剂量,成年鸡由原来免疫剂量O. 5ml/羽降到O. 3ml/羽,达到同样的免疫效果;使用了使用了丙内酯作为灭活剂,使产品中不含甲醛,确保受免动物体内无甲醛残留,提高畜产品的品质。
具体实施例方式实例I Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株的分离与鉴定
I.病料
病料为无菌采集死亡病鸡的心血、肝、脑、肺组织。
2.组织触片
将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片,并进行染色镜检,发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。3.细菌培养
将上述病料,分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制),结果显示无菌落生长,说明所述病料中不含有细菌。4.病料处理
将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎,用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作I : 5倍稀释,反复冻融三次后,3000r/min离心20分钟,取上清液保存于_20°C备用。 5.病毒分离、接种及收获
将本实施例标题4中获得的上清液,尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚,每胚接种量
O.2ml,接种后置37°C条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去,收获24小时以后死亡鸡胚尿囊液,测定尿囊液红细胞凝集价,将红细胞凝集价不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存,为鸡胚扩繁的第一代种毒,简称El代种毒。将El代种毒继续传3代,即为E4代种毒,用于病毒生物学特性鉴定。红细胞凝集价采用红细胞凝集试验(微量法)进行检测,具体方法如下在96孔(角度为110° )微量板上,从第I孔至12孔,每孔加入生理盐水30 μ 1,用加液器吸取含毒尿囊液30 μ 1,从每排第I孔起,依次作倍比稀释,至11孔,弃去加液器内30 μ I液体,最后I个孔不加作为空白对照。每孔加入1%鸡红细胞悬液30 μ 1,立即在微量振荡器上摇匀,置20°C室温,20分钟后观察结果,使红细胞完全凝集的最高稀释度,作为判定终点。结果表明El代种毒的红细胞凝集价为I : 256,E4代种毒的红细胞凝集价为I : 1024。6.血凝抑制试验
将E4代种毒用灭菌生理盐水作I : 256稀释,即为4个血凝单位抗原。分别用购自中国兽医药品监察所的鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感(H9)、禽流感(H5)标准阳性血清进行血凝抑制试验(参照现行《中国兽药典》中方法),结果显示被检E4代种毒只可被禽流感(H9)标准阳性血清抑制,其它三种血清均不能抑制,初步说明本株病毒为H9亚型禽流感病毒。7.病毒含量测定
将E4代种毒10倍倍比稀释,取10_7、10_8、10_9三个稀释度,分别通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚O. 1ml,置37°C孵育120小时。120小时后,逐胚测定红细胞凝集价(方法同前),以红细胞凝集价不低于I : 16判为感染,按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明E4代种毒的病毒含量为108 5EID5(i/0. Iml08.静脉致病指数(IVPI)测定
参照二 000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称《规程》)附录448页方法进行。结果表明E4代种毒的静脉致病指数为0,表明该毒株为低致病禽流感H9亚型病毒。9.鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)测定
按《规程》附录447页方法进行。结果表明E4代种毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间为81. 5小时/10'10.免疫原性测定
将E4代种毒按常规方法制成含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗。按O. 2ml/羽份免疫I月龄SPF鸡10只,另取5只不免疫,作为空白对照。免疫21天后,所有试验鸡采血,分离血清,参照现行《中国兽药典》中方法进行血凝抑制试验。同时对免疫组和对照组进行攻毒,静脉注射E4代种毒IO5 tlEID5tl/只,免疫后第5天逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物,过滤除菌,接种9 10日龄SPF鸡胚,每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚,O. 2ml/胚。37°C孵育120小时,测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚,应盲传一次。结果表明 ,该疫苗按照O. 2ml/羽份剂量免疫后21天,免疫组血清中E4代种毒血凝抑制抗体水平不低于I 128 (微量法),空白对照组均不高于I : 4 (微量法),免疫攻毒保护试验结果表明,免疫组10/10病毒分离为阴性,对照组5/5病毒分离为阳性。11.血凝素HA基因及神经氨酸酶NA基因鉴定
由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室进行,鉴定结果为E4代种毒的HA基因(如SEQ ID NO: I所示)属于A型流感病毒H9亚型,NA基因(如SEQ ID NO: 2所示)属于A型流感病毒N2亚型。因此,将该毒株命名为禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株,缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。将E4代种毒进行保藏。保藏信息如下
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。分类命名禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株。保藏号CGMCCNO :6258。保藏日期2012年7月2日。为了方便描述,将禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。12.对流行毒株的交叉攻毒保护性研究 A/Chinken/Shanghai/01/2011/ (H9N2)(简称 H9N2 亚型禽流感病毒 SHOl ),由上海兽
医研究所2011年于上海分离。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/ (H9N2)(简称H9N2亚型禽流感病毒JX02)由南京天邦公司生物技术研究所2011年于浙江嘉兴分离。将H9N2亚型禽流感病毒HN03株按常规方法制成病毒含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗,免疫I月龄SPF鸡30只;另取15只I月龄SPF鸡,分为3组,5只/组,不免疫作为空白对照组。免疫后21天,将免疫组随机分成三组,其中一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒,另一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒SHOl尿囊液攻毒,剩余的一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒;3个空白对照组的攻毒方法同免疫组。攻毒后第5天,逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物,过滤除菌,接种扩10日龄SPF鸡胚,每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚,O. 2ml/胚。37°C孵育120小时,测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒分离阴性的样品,肓传一代。结果表明H9N2亚型禽流感病毒HN03株对同源毒及非同源毒保护率均为100%,表明该毒株不但可以针对同源毒提供良好保护,对2011新分离的流行毒株也同样具有良好的保护性。H9N2亚型禽流感病毒HN03株生物学特性研究结果表明,该毒株可在鸡胚中高滴度增殖,血凝效价较高,为I : 1024(微量法),免疫原性好,能完全抵抗同源病毒攻击,异源攻毒保护率也高达100%。因此可作为H9N2亚型禽流感疫苗候选毒株,用于制备灭活疫苗。
实施例2鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备
I.制苗用毒种来源
制造本品用的毒种为鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株 CGMCC NO :6258,其中禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。
鸡新城疫病毒La Sota株(中国兽医药品监察所菌毒种编号CVCC AV1615株)购自中国兽医药品监察所,H9N2亚型禽流感病毒HN03株由国家兽用生物制品工程技术研究中心按照实施例I方法分离,经哈尔滨兽医研究所鉴定,提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。2.病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚,分别收获鸡胚液,作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液;
(I)鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚,收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。具体方法如下
接种取鸡新城疫病毒La Sota株,用灭菌生理盐水作适当稀释(如10_4或10_5),尿囊腔内接种9 10日龄SPF鸡胚,每胚O. 1ml,接种后密封针孔,置36 37°C继续孵育,不必翻蛋。孵育和观察鸡胚接种后,每日照蛋I次,将60小时以前死亡的鸡胚弃去。此后,每Γ8小时照蛋I次,死亡的鸡胚随时弃去。当孵育时间达到96或120小时,不论死亡与否,全部收回,气室向上,置于2 8°C冷却12 24小时。收获将冷却的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术剥除气室部位卵壳,揭去卵壳膜,剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂),吸取鸡胚液作为鸡新城疫病毒LaSota株病毒液。在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中,加入适宜抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位,链霉素终浓度800单位),每组抽样测定红细胞凝集价,红细胞凝集价低于I 512 (微量法)者应弃之,同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。注意在吸取胚液前,对每个鸡胚均应注意检查,凡出现腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者,弃去不用。死胚和活胚分别收获。(2)H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液的制备将H9N2亚型禽流感病毒HN03株接种SPF鸡胚,收获鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。具体方法如下
接种将H9N2亚型禽流感病毒HN03株用灭菌生理盐水作I : 5000稀释,尿囊腔内接种9 11日龄SPF鸡胚,每胚O. 1ml,接种后密封针孔,置36 37°C继续孵育,不必翻蛋。
孵育和观察鸡胚接种后,24小时内照蛋I次,弃去死胚。此后,每4 8小时照蛋I次。当孵育时间达到96 120小时,随时收回死亡的鸡胚,气室向上,置2 8°C冷却4 24小时。收获将冷却的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术剥除气室部卵壳,揭去卵壳膜,剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂),吸取鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中,加入适宜抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位,链霉素终浓度800单位),每组抽样测定红细胞凝集价,红细胞凝集价低于I 256 (微量法)者弃去,同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。注意在吸取胚液前对每个鸡胚均应注意检查,凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者,弃去不用。死胚和活胚分别收获。每若干枚鸡胚的胚液分为一组。3.病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感 病毒HN03株病毒液分别浓缩,然后分别加入β-丙内酯获得灭活病毒液。各灭活病毒液中β -丙内酯的体积百分数为O. 04% O. 06%ο所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3Χ 108_° EID50 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液浓缩至每O. I毫升浓缩后禽流感Η9病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3Χ IO8 5EID5tlt5 —般来说,浓缩至原体积的1/2 1/4,即能达到要求。(I)病毒液的浓缩
将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液分别连续离心澄清(连续离心转速10000转/秒),除去病毒液中的大颗粒,使其成为透明或半透明溶液。然后,用病毒超滤浓缩系统(购自美国Millipore公司,超滤膜孔径300KD)分别将上述病毒液滤浓至原体积的1/3,获得浓缩病毒液。用超滤浓缩过程中产生的滤出废液接种鸡胚,均应无血凝性,且不引起鸡胚死亡。(2)病毒液的灭活
将上述两种浓缩病毒液分别置无菌灭活罐内,加入β -丙内酯溶液,随加随搅拌,使其充分混合。加完丙内酯溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内,置4°C下灭活24小时,期间每隔4小时搅拌I次,即获得灭活病毒液。灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.05%。从灭活病毒液中取样进行灭活检验。灭活病毒液置2 8°C保存。4.半成品检验
(I)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。(2)病毒含量测定
鸡新城疫病毒La Sota株浓缩病毒液的含量测定将浓缩病毒液作3倍稀释后,测病毒含量。每O. Iml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为108_° 109_°EID5(I,所以每O. Iml浓缩病毒液中病毒含量为3X108_° EID50 3X IO9 tlEID5tl ;同时进行红细胞凝集价测定(同实施例I ),红细胞凝集价为I : 512 1024 (微量法)。H9N2亚型禽流感病毒HN03株浓缩病毒液的含量测定将浓缩病毒液先作3倍稀释后,测病毒含量,每O. Iml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为108_° IO8 5EID5tl,所以每O. Iml浓缩病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3X IO8 5EID5tl ;红细胞凝集价测定,红细胞凝集价(检测方法同实施例I)为I : 512 1024 (微量法)。(3)灭活检验
鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液灭活检验取灭活病毒液,经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚,每胚O. 2ml,置36 37°C孵育,弃去24小时内死亡鸡胚,观察120小时,鸡胚非特异性死亡应不超过I枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价,均应不出现血凝,并盲传I代,测定红细胞凝集价,均应不出现血凝。H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液灭活检验取灭活病毒液,经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚,每胚O. 2ml,置36 37°C孵育,弃去24小时内死亡鸡胚,观察120小时,鸡胚非特异性死亡应不超过I枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价,均应不出现血凝,并盲传I代,测定红细胞凝集价,均应不出现血凝。5.鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备
每羽份(O. 3ml)鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗,鸡新城疫病毒La Sota株含量IO8 0EID50 IO9 0EID50, H9N2 亚型禽流感病毒 HN03 株含量 IO8 0EID50 IO8-5EID500(I)油相制备将注射用白油和司本一 80按照体积比为94 6混匀,作为油相。(2)水相制备
将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液等体积混合制备混合病毒液;将混合病毒液与吐温-80按照体积比96 4混合,充分搅拌直至吐温-80完全溶解,即得水相溶液。(3)乳化
将油相和水相按照体积比3 I混合,搅拌均匀获得鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗。具体操作步骤如下将3份油相放入乳化罐内,启动乳化罐搅拌机搅拌,同时徐徐加入水相一份,加完后继续搅拌l(Tl5min,打开均质机进出口开关,启动均质机,使乳化液经均质机进入另一罐,如此反复乳化数次(一般6 8次),乳化后取IOml疫苗,以3000r/min离心15分钟,应不出现分层现象。实施例3鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种安全试验
按实施例2制备5批次鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗(批号20100301、20100502、20100603、20110104、20110305),灭活前鸡新城疫病毒 La Sota 株及禽流感(H9亚型)HN03株抗原含量均为108_°EID5Q/0. 3ml/羽份。考察对象为7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后,适应数天,核实鸡的全身状况和临床疾病情况,剔除弱鸡,选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(O. 6ml/只)颈部皮下注射五批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗,每次设I组不接种,作为对照;对三黄肉鸡分别双倍剂量(O. 6ml/只)颈部皮下注射三批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗,每次设I组不接种,作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应,接种后14天、28天各随机抽取试验鸡5 10只,剖检注射部位,检查疫苗的吸收情况。结果用双倍剂量鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗对7日龄SPF鸡和7日龄三黄肉鸡进行接种。接种后14日内,未观察到临床异常,采食、饮水正常,健康情况良好,未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应,具体见表I。接种后14天,各组取5 10只鸡剖检注射部位,80%以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全;注射后28天剖检,70%以上疫苗已基本吸收,注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应,具体见表2。因此,鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。表I双倍剂量接种鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗后14天内临床观察结果
权利要求
1.一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株;所述禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株,保藏号为CGMCC NO :6258。
2.根据权利要求I所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: I 3。
3.一种制备权利要求I所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于包括如下步骤 (1)病毒液的制备将鸡新城疫病毒LaSota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚,分别收获鸡胚液,作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液; (2)病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩,然后分别加入¢-丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液; (3)水相制备将鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液混合,获得混合病毒液;将混合病毒液与吐温-80混合,制得水相; (4)油相制备将注射用白油和司本一80混匀,作为油相; (5)乳化将水相和油相混合均匀,即得鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于步骤(2)中,所述鸡新城疫病毒LaSota株病毒液浓缩至每0. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3X 108_° EID50 3X IO9 ciEID5tl ;所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液浓缩至每0. I毫升浓缩后禽流感H9病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3X 108 5EID5Q。
5.根据权利要求3或4所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于所述步骤(2)中各灭活病毒液中P -丙内酯的体积百分数为0. 04% 0. 06%。
6.根据权利要求5所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于步骤(3)中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液与H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液的体积比为2:1 3。
7.根据权利要求6所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于步骤(3)中所述混合病毒液与吐温-80混合的体积比为96 4。
8.根据权利要求7所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于步骤(4)中所述注射用白油和司本一80混合的体积比为94 6。
9.根据权利要求8所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,其特征在于步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:3。
全文摘要
本发明提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法,涉及生物工程领域。所述二联灭活疫苗,含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株。制备所述疫苗的方法病毒液的制备、浓缩与灭活,水相制备,油相制备,乳化,即得二联灭活疫苗。本发明鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗,免疫原性好,产生的抗体水平高,不仅能够抵抗同源病毒攻毒,而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒;该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体,持续期长;其制备方法简单,安全。
文档编号A61P31/16GK102805864SQ20121032077
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者于漾, 揭鸿英, 朱亚露, 何家惠, 邓碧华, 张小飞, 艾玉春, 刘志凌, 顾巍巍 申请人:江苏省农业科学院

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