专利名称：从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种从血液中提取刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，尤其涉及一种采用超滤等生物技术手段从猪血中提取促进细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用物质的方法。
背景技术：
猪血去蛋白提取物是以猪血液为原料制备的小分子(分子量＜6000D)肽、核苷酸和寡糖类物质。其主要药理作用是促进细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用，使细胞中葡萄糖的无氧代谢转向有氧代谢，促使能量物质生成增多，延长细胞生存时间，促进组织细胞代谢及功能恢复和组织修复。
目前，国内外尚未有关于从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法及相关产品的报道。
中国专利(专利号为96120777.9)公开了一种提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法采用乙醇为溶媒去蛋白，然后去除溶媒，这种方法使提取的物质的活性损失，并且还存在处理量低、生产周期长、产量和收率低等问题。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效方法——可以从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，该方法解决了目前相关技术上存在的处理量低、生产周期长、产量收率低以及活性损失较高等问题，而且应用该方法从猪血中提取的产品相对于传统工艺的小牛血提取物具有更高的生物活性。
为了解决上述技术问题，本发明是这样实现的
一种从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，包括下述步骤①取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血，在采集过程中或采集后2小时内，用已消毒灭菌的棒状器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的棒状器具上，并将纤维蛋白除去，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血；②将去纤维蛋白猪血在-20℃～30℃下反复冻融，于低温(0～8℃)条件下的胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；③将匀浆液过滤，用不同截留分子量超滤膜分级超滤，超滤最终截留分子量＜6000D，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩和病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。
所述的步骤②为将去纤维蛋白猪血在-20℃～40℃下反复冻融2～4次，于0～8℃条件下的胶体磨中匀浆2分钟，重复3次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液。
所述的步骤③为取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟后，弃去沉淀，取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；取滤液A，用截留分子量30000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量10000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤液D；将超滤液D经低温(25℃)减压浓缩5～8倍(至总固体含量40mg/ml以上)，得浓缩液；并将浓缩液除菌过滤，在55～65℃下进行病毒灭活10～15小时；将检验合格的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温(-18℃±2℃)贮存，即得猪血去蛋白提取物。
本发明的优点和效果如下1.采用生物技术及分级超滤手段在本产品的制造工艺中，首次采用分级超滤手段。超滤膜分离技术作为二十一世纪六大高新技术之一，以其常温低压下操作、无相变、能耗低等显著特点已成为一种分离过程的标准方法，在欧美等发达国家和地区得到了广泛的使用，超滤膜分离过程具有以下几个显著特点①在常温和低压下进行分离，因而能耗低，因此设备的运行费用低。
②设备体积小、结构简单，故投资费用低。
③超滤分离过程只需简单的加压输送液体，工艺流程简单，易于操作管理。
④超滤分离过程中的超滤膜是由高分子材料制成的均匀连续体，该过程属于纯物理方法过滤，物质在分离过程中不发生质的变化，并且超滤膜在使用过程中不会有任何杂质脱落，保证超滤液的纯净。
采用分级超滤技术手段，使本品中活性物质的活性状态保持良好；不经过除溶媒过程，提高产品质量和收率；可进行工业规模化生产，生产周期短、成本低。
2.以猪血为原料提取其中具有刺激细胞呼吸活性作用的物质目前国内外同类产品(包括奥地利的“爱维治”、瑞士的“素高捷疗”；国内已批准上市的“爱维治”仿制品“奥德金”等)均以小牛血为原料。但现今由于疯牛病的肆虐，世界卫生组织严格限制使用牛血原料产品，并且广大民众对牛血生物制品也产生一种恐慌心理。目前，中国也严格限制牛资源制品，尤其是西方国家的食品和药品的进口。因此，不远的将来，此类品种在临床应用上将受到广泛的限制。所以，有必要寻求新的原料来源以替代小牛血生产具有相同功能的生化药物。
由于上述原因，考虑到该类产品的原料问题，为了控制疯牛病可能对人类健康造成的不良影响，本发明研制出一种“猪血去蛋白提取物”。实验结果表明猪血去蛋白提取物的有效成份类似于小牛血去蛋白提取物，其比活性略高于小牛血去蛋白提取物，并且，该品种易提取，收率高，成本低，更易于规模化生产。由于猪血去蛋白提取物原料来源安全，有效成分清楚，作用机理明确，必将替代或大部分替代牛血来源的同类产品，应用本发明工艺提取猪血活性物质与应用传统工艺提取小牛血活性物质的对比，结果见下表

具体实施方式
实施例一①取非传染区经检验合格出生5个月的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血。在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的棒状器具上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-20℃冷冻，30℃下融化，反复3次，于低温0℃或4℃或8℃条件下的胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③将匀浆液过滤，用不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤最终截留分子量＜6000D，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩及病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。
实施例二①取非传染区经检验合格出生6个月的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血。在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的棒状器具上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-20℃冷冻，20℃下融化，反复3次，于低温4℃或8℃条件下的胶体磨中反复匀浆，显微镜检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③将匀浆液过滤，用不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤最终截留分子量＜6000D，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩及病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。
实施例三①取非传染区经检验合格出生3个月的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血。在采集过程中或采集后2小时内，不断用表面已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的棒状器具上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-15℃冷冻，40℃下融化，反复3次，于低温1℃或3℃条件下的胶体磨中反复匀浆，显微镜检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③将匀浆液过滤，用不同截留分子量的超滤膜分级超滤，最终截留分子量＜6000D，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩及病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。
实施例四①取非传染区经检验合格出生4个月的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血，收集在180℃干烤灭菌的不锈钢桶内。在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在器具上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-20℃冷冻，40℃下融化，反复4次，于3～5℃条件下的胶体磨中匀浆2分钟，重复3次，显微镜检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；将滤液A用截留分子量30000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得超滤液C；取超滤液C，用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤液D；将超滤液D经低温(25℃)减压浓缩8倍(至总固体含量40mg/ml以上)，得浓缩液；将浓缩液除菌过滤，并在60℃条件下进行病毒灭活12小时左右；将检验合格的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温-20℃贮存，即得猪血去蛋白提取物。
实施例五①取非传染区经检验合格出生2个月的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血，收集在180℃干烤灭菌的不锈钢桶内。在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在器具上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-5℃下冷冻，20℃下融化，反复冻融2次，于0～5℃条件下的胶体磨中匀浆2分钟，重复3次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③取匀浆液经4000转/分钟离心20分钟后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；将滤液A用截留分子量30000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得超滤液C；取超滤液C，用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤液D；将超滤液D，经低温20℃减压浓缩6倍(至总固体含量40mg/ml以上)，得浓缩液；将浓缩液除菌过滤，并在65℃下进行病毒灭活15小时左右；将检验合格的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，-18℃±2℃贮存，即得猪血去蛋白提取物。
实施例六①取非传染区经检验合格出生6个月以内的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血，收集在180℃干烤灭菌的不锈钢桶内。在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具(木棒或玻璃棒等)进行搅拌，使纤维蛋白吸附在器具上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血。
②将去纤维蛋白猪血在-20℃下冷冻，10℃下融化，反复冻融4次，于0～8℃条件下的胶体磨中匀浆2分钟，重复3次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液。
③取匀浆液经4000转/分钟离心20分钟后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；将滤液A用截留分子量30000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量10000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤液D；将超滤液D经25℃减压浓缩5倍，至总固体含量40mg/ml以上，得浓缩液；将浓缩液除菌过滤，并在55℃条件下进行病毒灭活10小时；将检验合格的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，-18℃±2℃贮存，即得猪血去蛋白提取物。
使用本发明提供的上述方法取得的猪血去蛋白提取物性状为淡黄色澄明液体，其检测情况如下[检查]pH值应为6.5～7.5(中国药典2000年版二部附录VIH)吸收度420nm波长处的吸收度小于0.25(中国药典2000年版二部附录IVA)蛋白质阴性细菌内毒素每1ml中含细菌内毒素量应小于1EU(中国药典2000年版二部附录XIE)照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)测定大分子量物质。用凝胶色谱柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)为流动相，检测波长为214nm，按面积归一化法计算，含高分子量物质(分子量＞5800D)的量不得超过2.0％。
采用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力，从测得的耗氧量计算出呼吸活力QO2为4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指数(SI)为2.5～4.0。
(1)总固体量，精密量取2ml，置称量瓶中，在55℃下真空干燥至恒重，每1ml中应含固型物为38～60mg。
(2)采用中国生物制品规程附录蛋白质含量测定法，测定本发明中产品的多肽含量，每1ml应为0.90～1.5mg。
(3)游离氨基酸含量，用高效液相进行氨基酸分析，游离氨基酸含量每1ml应不少于1.0～1.5mg。
权利要求
1.一种从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，包括以下步骤①取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌动脉采血方法采血，在采集过程中或采集后2小时内，不断用已消毒灭菌的棒状器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的器具上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白猪血；②将去纤维蛋白猪血在-20℃～40℃下反复冻融，于0～8℃条件下的胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；③将匀浆液过滤，用不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩及病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，其特征在于所述的步骤②为将去纤维蛋白猪血在-20℃～40℃下反复冻融2～4次，于0～8℃条件下的胶体磨中匀浆2分钟，重复3次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液。
3.根据权利要求1所述的从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，其特征在于所述的步骤③为取匀浆液经4000转/分钟离心20分钟后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；取滤液A，用截留分子量30000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量10000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤液D；将超滤液D经低温(25℃)减压浓缩5～8倍，至总固体含量40mg/ml以上；将浓缩液在55～65℃下进行病毒灭活10～15小时；将检验合格的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，-18℃±2℃贮存，即得猪血去蛋白提取物。
全文摘要
本发明公开了一种从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法，它包括下述步骤取健康猪，采用无菌动脉采集方法采血，不断用已消毒灭菌的棒状器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的器具上，除去纤维蛋白得到去纤维蛋白猪血；－20℃～40℃下反复冻融，于0～8℃条件下的胶体磨中反复匀浆，得匀浆液；将匀浆液过滤，用不同截留分子量的超滤膜分级超滤，得猪血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩及病毒灭活后得猪血去蛋白提取物。该方法所用设备体积小、结构简单，投资费用低；制备的活性物质活性状态保持良好且活性较高，不经过除溶媒过程，提高产品质量和收率；可进行工业规模化生产，生产周期短、成本低。
文档编号A61K35/14GK1698652SQ200510046289
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者王光, 李莉, 史晓丹, 马骉 申请人:沈阳斯佳科技发展有限公司