专利名称：：稳定的转基因植物药的相关方法和组合物以及它们作为抗孕药的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来源于转基因植物的具有药物活性的蛋白如疫苗、抗体或其它用于治疗的化合物生产中的处理技术，也涉及到了动物服用这些化合物用于免疫抗孕、病原体所致疾病的疫苗接种或其它免疫反应性组合物感染时的治疗处理。植物源性疫苗的开发已经大大地促进了可用于人类和动物疫苗接种的技术。转基因植物可用于疫苗、抗体以及其它的人、兽疾病的治疗性药剂的开发，既提高了治疗性蛋白的生产效率，也极大地降低了主要的生产成本。
背景技术：
：关于植物源性疫苗的生产，在转基因植物中蛋白表达方面已经获得了重要进展。例如，不同的表达形式、聚集物或融合体已经被用于提高疫苗亚单位、抗体和治疗药剂或抗孕蛋白的产量，这些资料已经描述在美国专利第5,679,880、5,484,719、5,686,079号以及美国专利申请第2002/0006411号中。但是，目前有关转基因植物疫苗技术的规定仍然要求将药物蛋白从转基因植物材料中纯化出来，或者要求采用标准化处理后的植物组织生料。不幸的是，这样的方法用于生产可服用性植物源性药品有其固有的缺陷。优选的植物源性药品是可口服的、标准化处理后的植物组织。更确切的是，要求植物材料可在环境温度下保存、运输和给药。但是，未纯化的转基因植物源性疫苗有其下列固有的问题1)不同的植物其蛋白表达水平不同，2)由植物组织腐烂而导致的蛋白降解。与传统的制药学要求相比，因其相对短的保鲜期，新鲜收获的产品比如水果、块茎、根、树叶或其它任何植物组织的数量是有限的。此外，因为转基因蛋白在不同的植物、细胞克隆或植物组织中具有不同的聚集水平，这就使保持剂量的一致性变得异常困难，而那正是药物的实际应用所强制要求的。传统的制药技术提供了提取、纯化和浓缩药物蛋白的方法，但代价昂贵，并且要求对纯化后的产品进行冷冻，而不允许用植物细胞本身对转基因蛋白进行保护性包装。因此，需要应用新的方法来生产稳定的转基因植物源性药物，既可避免不同植物有不同蛋白表达水平的缺陷，也不需要从原始植物材料中进行纯化。本文描述的加工方法提供了生产一种室温下稳定、用途广泛的匀浆混合物的方法。另外，在环境温度下稳定的匀浆可收集在一起并进行以每批为基础的质量控制。而且，本发明所描述的转基因植物加工方法允许在整个加工的过程中方便地加入佐剂、缓冲液、抗氧化剂、稳定剂或抗原粉末，这样就可生产多种不同的药物剂型，其效率以及效价比都高。该稳定的干燥匀浆既可用于疫苗和病原体所致疾病的治疗，也可用于抗孕。受精是精子和卵子细胞表面重要调控分子间的复杂反应。它们在生殖过程中所扮演的重要角色使得它们有可能成为控制哺乳动物生育率的重要目标分子。所有的哺乳动物卵子被透明带所包绕，透明带是一个由三种糖蛋白(ZP1，ZP2和ZP3)所组成的相对简单的膜，它使得卵子具有精子受体。一些非哺乳物种的透明带还有第四种糖蛋白，即ZP4。透明带的糖蛋白成分在受精和早期发育中起着特殊的作用，这在小鼠中得到了很好的证实。ZP1是一种和ZP2、ZP3的纤丝交联的结构蛋白。在受精的过程中，精子首先和ZP3结合，使精子发生顶体反应。次后，ZP2成为了精子二级受体，这对精子穿过透明带是必须的。受精后，ZP2的蛋白酶解以及ZP3的修饰被认为与阻止多精入卵有关。透明带在受精中扮演的重要作用，它在生长的卵母细胞中的特异性表达以及它所具有的高度免疫原性，使得它成为开发免疫抗孕疫苗中具有吸引力的目标(EpifanoandDeanReprodFertilDev.1994；6319)。对整个透明带或其成分进行免疫已经被证明能抑制数个物种包括灵长类，兔子、啮齿类和狗的受精((Prasadetal.，(1996)JREPRODFERTILSUPPL.50143)。在这些参考文献中所描述的合成物或许可抑制受精作用，但它们必须通过胃肠外给药，如针刺注射，因此其经济的、广泛的应用是不切实际的。在这些文献中所描述的合成物，与本发明相比，不能以生饵料、食物或可消化性加工材料的形式进行有效的口服给药。Fitchen等((1995)VACCINE131051)曾试图生产一种纯化的植物性抗孕蛋白，通过注射的方式在模型动物中给药。在该实验中，鼠ZP3的抗原决定族被设计在烟草花叶病毒(TMV)的膜蛋白序列中，并在TMV感染时表达在烟草中。该病毒颗粒(ZP抗原决定族在病毒的外表面表达)被从植物材料中粗略地纯化，用于胃肠外给药。但是，该病毒颗粒在鼠模型中不能有效地减少幼仔数量。Fitchen等没有将此实验结果和诱导动物抗孕的方法或经口饲喂动物一种转基因植物的方法联系起来，在他们的实验中，口服给药平均减少幼仔数量至少50％。在本专业中，需要一种可作为生饵料或是可消化性食物、能方便地饲喂给动物、并能明显地减少被饲喂动物幼仔数量的植物成分。同时需要避免应用植物病毒来表达蛋白。因此，需要在植物细胞自身中直接表达抗孕蛋白，从而在动物消化植物材料时产生一种黏膜免疫反应。预计世界人口将继续膨胀超过60亿，其它野生物种的种群分布将继续极大地受到工业化人类环境活动的影响。在20世纪，人类对土地和水资源的利用对动物物种的增长有着越来越深刻的影响。世界野生生物基金会预测多至1/3的世界物种在未来的20年内可能灭绝。除了某些动物区系和植物群落将减少直至灭绝或处于危险的边缘，现代人类的活动也导致了一些动物物种的过度膨胀。一个特别的例子是，多年来食草动物的存活状况受到地理限制因素、自然天敌、气候条件和获得食物的能力等自然力的影响而保持平衡。在这不胜枚举的影响因素中，工业化世界毁灭森林以用于农业和建设用途，减少了肉食动物的种群和自然活动范围，出现了突破地理屏障的物种，为物种适应极端的气候变化提供非自然的庇护，并孵育了一种动物权利和人类利益相互冲突的社会文化。已有哺乳动物的例子表明，食草动物物种数量的过度膨胀已经和人类共生以及农业生产直接相冲突。由于众多的原因，还没有实现对这些哺乳动物种群数量的有效控制，需要寻找另外的办法。因此，人类需要开发种群控制的技术，以减轻失控动物物种的过度繁殖而导致的破坏性影响，不管这种影响是经济的、环境的或动物保护方面的。而且也需要采取高效的方法来达到此目的。
发明内容乐盈VI本发明提供了转基因植物源性生物药品的生产方法。本文描述的方法允许生产一种干燥的转基因植物源性材料，它在室温下稳定、均一、药效充分。一般用已有的食品加工技术对完整的或分割后的转基因植物进行干燥或冷冻干燥。含有生药产物的干燥匀浆可用于治疗而不需要进一步的提取、纯化或沉淀药物蛋白。稳定性干燥匀浆可用作疫苗、病原菌所致疾病的治疗以及抗孕药。本发明进一步提供了一种控制生育安全有效的疫苗。因此，本发明满足了生产稳定的植物源性药品所需要的有效方法，也满足了家畜、饲养的物种、动物园动物、竞技动物以及人类的数量控制所需要的方便和效价比高的方法。本文描述植物源性药物的生产和应用。本发明提供了生产表达异种蛋白的转基因植物稳定干匀浆的方法，具体方法包括1)完整的或分割后的转基因植物材料的获得；2)转基因植物材料的脱水；3)在脱水前/后，混合转基因植物材料成匀浆，从而生成一种表达异种药物蛋白的转基因植物的稳定干燥匀浆。在一个实施例中，通过对材料的冷冻干燥、空气干燥或喷射干燥而实现其脱水过程。在另一个实施例中，该方法还包括在混匀之前对脱水后的材料进行分割的步骤。在另一个实施例中，该方法还包括加入赋形剂的步骤。本发明还提供由上述方法生产的稳定干匀浆。在一个实施例中，该稳定干匀浆含有一种抗原或一种抗体。本发明还提供了一种含有转基因蛋白的脱水后的转基因植物材料所组成的稳定干匀浆。本发明还提供了一种含有稳定干匀浆的药物组合物，该匀浆含有脱水的、含有一种转基因蛋白并可选的与制药学上可接受的佐剂混合后的转基因植物材料。本发明还提供了一种给动物饲喂由稳定干匀浆组成的药物组合物以防止病原体致病的一种方法，该匀浆含有脱水的、含有一种转基因蛋白并可选的与制药学上可接受的佐剂混合后的转基因植物材料。本发明还提供了一种给动物饲喂转基因蛋白的方法，该药物组合物由稳定干匀浆组成，而匀浆由脱水后的、含有一种转基因蛋白并可选的与制药学上可接受的佐剂混合后的转基因植物材料组成。在一个实施例中，稳定干匀浆中的转基因蛋白即为一种疫苗。本发明还提供了利用转基因植物源性药物抗孕的方法。本发明利用植物染色体来表达抗孕蛋白而无需病毒干预。本发明提供了一种抗孕的方法给动物饲喂一种含有编码一种抗孕多肽的核苷酸分子的转基因植物材料；上述处理使动物的每个生育周期的平均幼仔数目至少减少了50％。本发明提供了一种抗孕的方法包括给动物饲喂足够数量含有编码一种抗孕多肽的核苷酸分子的转基因植物材料以有效地诱发抗孕；上述处理在动物中诱导了针对抗孕蛋白的黏膜免疫反应。本发明提供了一种抗孕的方法包括给动物饲喂含有编码一种抗孕多肽的核苷酸分子的转基因植物材料，核苷酸被整合到植物染色体；上述处理使被饲喂转基因植物材料的动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。本发明还提供了一种抗孕的方法包括给动物饲喂足够数量的含有编码一种抗孕多肽的核苷酸分子的转基因植物材料以有效地诱发抗孕，核苷酸被整合到植物染色体；上述抗孕方法使被饲喂转基因植物材料的动物每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。在一个优选的实施例中，从由叶、根、芽、杆、果实、块茎、花和种子等组成的群体中挑选出所述的转基因植物材料。在一个更优选的实施例中，所述的转基因植物材料是可食用的。在另一个优选的实施例中，所述的由核苷酸编码的抗孕多肽是从一个由透明带糖蛋白(ZP)、GnRH(GnRH)、促黄体激素释放激素(LHRH)、促黄体激素(LH)、乳酸脱氢酶(LDH)和抗精子抗原等组成的群体中挑选出来的。在一个更优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白是从由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等组成的群体中挑选出来的。在一个更优选的实施例中，在一个更优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白即ZP3。在一个优选的实施例中，所述的抗孕蛋白呈种系特异性。在另一个优选的实施例中，所述的编码抗孕蛋白的核苷酸包括了编码一种黏膜靶蛋白的序列。在一个更优选的实施例中，所述的黏膜靶蛋白是大肠杆菌肠毒素亚单位B。在另一个优选的实施例中，所述的转基因植物材料是整体给药。在另一个优选的实施例中，所述的转基因植物材料是通过黏膜给药。在另一个优选的实施例中，所述的黏膜给药是经口、鼻或眼来进行。本发明还提供了一种诱导黏膜免疫反应的方法包括给动物饲喂一种含有编码抗孕多肽的核苷酸分子的转基因植物材料，上述给药在动物中诱发了针对抗孕蛋白的黏膜免疫反应，并且使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。在一个优选的实施例中，所述的转基因植物材料是从由叶、根、芽、杆、果实、块茎、花和种子等组成的材料群体中挑选出来的。在另一个优选的实施例中，所述的转基因植物材料是可食用的植物。在另一个实施例中，所述的由上述核苷酸编码的抗孕多肽是从一个由透明带糖蛋白、GnRH、促黄体激素释放激素、促黄体激素、乳酸脱氢酶和抗精子抗原等组成的群体中挑选出来的。在一个优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白是从由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等组成的群体中挑选出来的。在一个更优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白即ZP3。在另一个实施例中，所述的抗孕蛋白是种系特异性的。在一个优选的实施例中，所述的编码抗孕蛋白的核苷酸包括了编码一种黏膜靶蛋白的序列。在一个更优选的实施例中，所述的黏膜靶蛋白是大肠杆菌肠毒素亚单位B。本发明还提供了含有一种编码抗孕多肽的核苷酸序列的转基因植物材料的转基因植物，给动物饲喂转基因植物材料可在动物中诱发针对抗孕蛋白的黏膜免疫反应，上述给药使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。本发明还提供了一种含有编码抗孕多肽的核苷酸序列的转基因植物材料的转基因植物，编码抗孕多肽的核苷酸序列在病毒颗粒中没有表达，而给动物饲喂转基因植物材料可在动物中诱发针对抗孕蛋白的黏膜免疫反应。本发明还提供了一种含有编码抗孕多肽的核苷酸序列的转基因植物材料的转基因植物，上述给药使被饲喂转基因植物材料动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。本发明还提供了一种含有编码抗孕多肽的核苷酸序列的转基因植物材料的可食用转基因植物，而给动物饲喂转基因植物材料可在动物中诱发针对抗孕蛋白的黏膜免疫反应，核苷酸被整合到植物染色体。在一个实施例中，抗孕多肽是从一个由透明带糖蛋白、GnRH、促黄体激素释放激素、促黄体激素、乳酸脱氢酶和抗精子抗原等组成的群体中挑选出来的。在一个优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白是从由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等组成的群体中挑选出来的在一个更优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白或其片段是种系特异性的。在另一个更优选的实施例中，所述的透明带糖蛋白是ZP3或其中的一个片段。在一个实施例中，所述的核苷酸序列可编码一种黏膜靶蛋白。在一个优选的实施例中，黏膜靶蛋白是大肠杆菌肠毒素亚单位B。在另一个优选的实施例中，所述的植物属单子叶植物。在另一个优选的实施例中，所述的植物属双子叶植物。在另一个优选的实施例中，所述的植物是从由番茄、稻谷、小麦、玉米、胡萝卜、马铃薯、苹果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果植物所组成的群体中挑选出来的。本发明提供的一种植物细胞含有核酸载体，而该核酸载体编码一种抗孕多肽，它被整合并表达在植物细胞染色体上，而给动物饲喂该植物细胞使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少了50％。在一个实施例中，由该核酸载体编码的抗孕多肽是从一个由透明带糖蛋白、GnRH、促黄体激素释放激素、促黄体激素、乳酸脱氢酶和抗精子抗原等组成的群体中挑选出来的。在一个进一步的实施例中，透明带糖蛋白是从由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等组成的群体中挑选出来的。还是在进一步的实施例中，抗孕蛋白是种系特异性的。在一个优选的实施例中，该透明带糖蛋白是ZP3。在一个实施例中，该核酸载体编码一种黏膜靶蛋白。在一个优选的实施例中，该黏膜靶蛋白是大肠杆菌肠毒素亚单位B。在一个实施例中，该植物细胞是从单子叶植物中获得。在一个实施例中，该植物细胞是从双子叶植物中获得。在一个优选的实施例中，该植物细胞是从由番茄、稻谷、小麦、玉米、胡萝卜、马铃薯、苹果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果等植物细胞所组成的群体中挑选出来的。本发明还提供了一种用于转化植物细胞的质粒载体，它包括编码一种抗孕多肽的核酸序列，一个植物特异的启动子连接到编码抗孕多肽的核酸序列，这样就能指导抗孕蛋白在植物细胞中的合成。因此，给动物饲喂含有该质粒载体的植物细胞可在动物体内诱发黏膜免疫反应，而那样的给药可使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少50％。在一个实施例中，由该核酸序列编码的抗孕多肽是从一个由透明带糖蛋白、GnRH、促黄体激素释放激素、促黄体激素、乳酸脱氢酶和抗精子抗原等组成的群体中挑选出来的。在一个优选的实施例中，该透明带糖蛋白是从由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等组成的群体中挑选出来的。在一个进一步的实施例中，该植物细胞是从一种可食用植物中获得。在一个实施例中，该质粒载体包含了编码一种黏膜靶蛋白的核酸序列。在一个优选的实施例中，该黏膜靶蛋白即大肠杆菌肠毒素亚单位B。本发明也提供了一种至少含有部分上述转基因植物的食品组合物，可被动物摄入，而转基因植物的摄入可在动物中诱发黏膜免疫反应。因此，转基因植物的的摄入可在动物中诱发黏膜免疫反应，从而使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少50％。本发明也提供了一种药物组合物，它至少部分地是由上述的转基因植物与制药学上可接受的载体混合组成，而给动物饲喂该药物组合物可使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少50％。本发明也提供了一种组合物，它由皂甙佐剂和加工后的转基因植物材料混合组成，用于经口饲喂动物，而该组合物的饲喂可使动物的每个生育周期中平均幼仔数目至少减少50％。在本文中，“抗孕品”指用于抗孕的药剂。“抗孕”被定义为减少单只动物在单次生育周期中所生育的幼仔数目，或者是阻止有性生殖活动中精子与卵母细胞的受精作用。如下所述，该阻止受精的作用可被单只雌性动物在饲喂抗孕剂后所产幼仔数目的减少所证实。在本文中，“抗孕剂”指上述的减少或阻止受精，或阻止受精卵植入的作用，使得每个生育周期的幼仔数目最少。在本文中，“有性繁殖”是指哺乳动物特有的繁殖方式。它包括一种性细胞对另一种性细胞的受精作用(配子雌性为卵子，雄性为精子)，从而产生一种新细胞(被叫做受精卵)，它可发育成一个新的生物体。卵子或精子是在雌性或雄性动物的生殖器官中产生的。在单个的有性生殖过程中，卵子和精子受精后，携带受精卵的雌性动物常常不能再产生更成熟的卵子直到幼仔生下后。在本文中，一个“生育周期”是指单个的有性生殖过程，包括成熟卵子的受精和幼仔的生产，均发生在下一个生育周期发生之前。依照本发明，一个“生育周期”也指被抗孕剂所阻断的一个潜在的繁殖过程。在本文中，“抗孕蛋白”是指能减少单只动物的单个生育周期中的幼仔数目的多肽或多肽片段。对于那些平均产仔数目是3或更多的动物物种来说，“抗孕蛋白”是指能减少幼仔数目至少达60％、70％、80％、90％甚至达100％的多肽。对于那些平均产仔数目是1或2的动物物种来说，“抗孕蛋白”是指能减少幼仔数目至少达50％(即从2个减到一个)或100％(即从1个或2个减到没有)的蛋白或多肽。此外，如上所述，抗孕蛋白也可指能阻断卵子和精子的受精作用或阻止受精卵在动物子宫的着床从而减少平均幼仔数目的多肽。另外，“抗孕蛋白”是指一种可刺激动物产生黏膜免疫反应的多肽，该免疫反应可使针对抗孕蛋白的抗体增加。抗体可与性激素、卵母细胞或精母细胞的位点结合，从而阻断性成熟、卵母细胞的受精和/或受精卵在动物子宫的着床，因此减少幼仔数目。本发明中有用的“抗孕蛋白”包括但不限于透明带糖蛋白、GnRH(GnRH)、促黄体激素释放激素(LHRH)、促黄体激素(LH)、乳酸脱氢酶(LDH)和抗精子抗原。“抗精子抗原”包括但不限于SP5、SP56、fertilin、PH30、LDH-C4和P10。在本文中，“有效诱发抗孕的数量”是指能诱发抗孕的转基因植物材料的数量。有效诱发抗孕的转基因植物材料数量是指将幼仔数目减少10％、30％、60％，、80％至100％的植物材料的数量。对于那些每个生育周期的平均产仔数目是1或2的动物物种来说，有效诱发抗孕的转基因植物材料数量是指能减少幼仔数目至少达50％或100％的植物材料。在本文中，有效诱发抗孕的数量是指诱发抗孕的转基因植物材料的数量至少是每克干重的转基因植物材料里含抗孕蛋白5μg，优选是每克干重的转基因植物含抗孕蛋白至少10μg、20μg、40μg、60μg、80μg，、100μg、120μg、140μg和150μg或更多。在本文中，“转基因植物”是一种植物，其细胞能稳定表达一种异种外源基因，该外源基因被整合到植物细胞的染色体上，但没有携带病毒特异的病毒载体序列，该外源基因可传代到下一代植物个体，并能在植物宿主染色体上表达。一种转基因植物有多种转基因植物细胞。文中的“转基因植物”是指整个植物，或是它包括的一部分，而不是仅限于根、茎、叶、杆、种子、果实、块茎、花、花粉或诸如此类。异种外源性基因的例子包括但不限于诺瓦克病毒外壳蛋白(NVCP)，禽流感病毒血凝素(AIV-HA)，新城疫病毒神经酰胺酶(NDV-HN)，透明带糖蛋白3(ZP3)，和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。在本文中，“异种蛋白”是指由异种基因表达的蛋白，异种基因是指编码一个或多个其它来源的蛋白的基因或其片段，而不是来自该蛋白最终在其中表达的植物种类的染色体。基因的来源可以是自然的，例如，基因可来自另外的活体生物，比如细菌、病毒、酵母菌、霉菌以及诸如此类，或来自不同类的植物；基因也可以是合成的，例如，基因或基因片段可在体外化学合成。“异种”一词也可用于当基因片段的来源不是来自其最终在其中表达的植物染色体。异种蛋白可以是抗原，或其它治疗性蛋白，例如内皮他丁、血管他丁等(但不限于此)。异种蛋白也可以是抗体或抗体复合体，例如植物抗体。植物抗体是在植物中产生的抗体。在本文中，“转基因植物材料”是指加工或未加工的的转基因植物。根据本发明，文中的“转基因植物材料”是指整个转基因植物，或是它包括的一部分，而不是仅限于转基因叶、转基因根、转基因芽、转基因茎、转基因果实、转基因块茎、转基因花、转基因种子。转基因植物材料也指一个或多个转基因植物细胞。转基因植物细胞是指稳定表达一个外源基因的植物细胞，其中的外源基因被整合到植物细胞的染色体而没有携带病毒特异的病毒载体序列。该外源基因可传代到下一代细胞个体，并能在宿主植物细胞染色体上表达。此外，转基因植物材料是指含有一种或多种通过常规的细胞培养技术获得的转基因植物细胞的细胞悬浮液。(Street，HE.1973，Planttissueandcellculturebotanicalmonographs.VolII，UniversityofCalifornia，Berkely)在本文中，完整的转基因植物材料是指整个植物或植物的部分，它们没有被诸如切片、切断或垛碎等进一步的加工而减小它们的大小。总之，该植物材料在收获时是完整的，但可能仅是转基因植物的一部分。例如，完整的转基因叶子，转基因根、转基因芽、转基因茎，转基因果实，转基因块茎、转基因花或转基因种子。在本文中，分割的转基因植物材料是指完整植物的某些部分，通过常规的工艺已使它们的尺寸减小。分割的方法包括(但不限于此)二等分、四等分、切碎、切片、切方、垛碎或制浆、碾磨、压碎、压榨或裂化。转基因植物材料，无论是切断或不切断、烹饪过或未烹饪过，都可用该工艺中的技术处理来成浆，包括室温下在厨房的搅拌器中压汁、混匀或碾碎。成浆后的植物材料可与适当的赋形剂混合，该赋形剂必须是制药学上可以接受并且与该转基因蛋白相容。转基因植物材料可被研磨成精细的粉末。在本文中，匀浆是指将较大的植物器官缩减成均衡的混合物，其中不同组织的不同数量的同源蛋白被混合成统一成批的材料。因此，术语“同质物”或“匀浆”也指被分割或缩减的植物材料，如此，含不同数量植物蛋白和或转基因蛋白的不同植物组织被混合成含有统一蛋白量、成批的植物材料。在本文中，可食用的植物是指那些可被动物消化、有营养价值而没有毒性的植物。可食用的植物是指可作为食物而被人类或其它动物吸收的植物或从植物上获得的材料。术语“食物”特别包括可供人类或其它动物食用的植物材料或加工过的植物材料。从植物中获得的材料还特别地包括最终可被人类或其它动物吸收的植物成分。可食用植物包括(但不限于此)番茄、稻谷、小麦、玉米、胡萝卜、马铃薯、苹果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果。在有些情况下，一种可食用植物因其营养价值而被吸收，它是指可提供可代谢能量、辅助或必需维生素或协同因子、粗饲料的来源或其它对动物吸收有益的效应。因此，当本发明所提供方法处理的对象是可凭借细菌来辅助消化纤维素的食草动物时，那样的食物可用转基因草本植物来代表。其它的可食用植物包括蔬菜和水果。类似的，虽然转基因莴苣植物不能充分地提供能源、结构大分子如蛋白、碳水化合物或脂肪，也不能提供其它的必需或非必需维生素或协同因子，如本文所述，如果莴苣植物的吸收因为提供了粗饲料而给动物带来益处，并且其核酸分子被转基因，那么被动物当作食物的转基因莴苣植物也归入本文的有关食物的定义，纵使动物不能消化莴苣的纤维性内容物也是如此。可食用植物不包括烟草。在本文中，“加工过的”转基因植物材料是指切割或将植物材料细分为最小尺寸约为1mm2大小的较小片块，其中切割又指剁碎、切碎或切方。不管是切割过的还是没有切割过的转基因植物材料都可以用烹饪植物材料来进一步加工，应用的是该工艺中已知的方法包括(但不限于此)煮沸、烘烤和嫩煎，此时植物材料的温度被提高到至少140℃、160℃、180℃，最高200℃至少5分钟、最多30分钟。被烹饪过的转基因植物材料，在本发明中是有用的，它可不需要将抗孕蛋白纯化而直接饲喂，因为烹饪过的植物材料可含有裂解的植物细胞。不管是切割过的还是没有切割过、烹饪过或没有被烹饪过的转基因植物材料都可以通过与非转基因植物或非植物材料混合而进一步地被加工，其中转基因植物材料至少占混合物总重量的50％。例如，转基因玉米可通过把玉米颗粒与其它的蔬菜混合而得到加工，再如，转基因豆类植物可通过与香料或其它的调味品混合制成诸如大豆汉堡包、大豆冰淇淋搅合饮料或豆奶等而得到加工。或者，在本发明中有用的转基因植物材料可通过应用该工艺技术中已知的方法，包括室温下在厨房的搅拌器中压汁、混匀或碾碎至少20分钟，使切割过或没有切割过的、烹饪过或没有烹饪过的植物材料液化，从而使其得到加工。液化后的植物材料可直接饲喂给动物，也可将液化后的植物材料与适当的赋形剂混合而使其得到进一步的加工，该赋形剂必须是制药学上可以接受并且与该转基因蛋白相容。液化后的植物材料可通过将其与制药学上可接受的乳膏、软膏或油膏等混合而得到进一步加工。在转基因植物材料的液化过程中，转基因植物细胞可能破裂，从而将其内容物释放到液化后的混合物中。在转基因植物细胞的抗孕蛋白没有被从液化后的植物材料中纯化出来的情况下，该液化混合物在本发明中是有用的。或者，在本发明中有用的转基因植物原料，切割过或没有切割过的，烹饪过或没有烹饪过的，都可通过将植物原料冻干或脱水处理去除水分而得到加工。可通过空气干燥或喷射干燥或冻干而实施脱水，其中冻干是指通过快速冷冻和冻结状态的脱水(有时指升华)而制备一种干燥植物组合物。该处理发生在真空状态，此时压力足够地低而保持产物的冻结状态，优选是少于500毫托，更好一点是少于约200毫托，再好一点是少于约1毫托，持续时间在1-72小时之间。植物材料也可以放在温度约为60-200℃的烘箱中脱水约1-72小时。当植物原料的重量不随时间而变化时，它被认为已经充分地冻干或脱水。例如，当将植物原料放置在如上述温度的烤箱内时，其水分被蒸发，因而它的重量将随时间而减少。当其重量停止变化时，所有的水分被蒸发，此时植物原料可认为是被脱水。不过应用何种干燥方法，优选是在最后时，原料的水分重量至少被除去90％而被充分地脱水。冻干或脱水后的植物原料可通过与制药学上可接受的并与抗孕多肽相容的赋形剂乳化而得到进一步的加工。举例来说，适当的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物及其组合，在它与赋形剂的混合物中，″冻干″或″脱水″的植物材料至少包含40％、优选是50％的重量。此外，必要时，″冻干″或″脱水″的植物材料可含较小量的附加物质如湿化或乳化剂，pH缓冲剂，或提高植物材料效力的佐剂。在本文中，″冻干″或″脱水″的植物材料可通过与制药学上可接受的乳膏、软膏、油膏或栓剂混合而得到进一步的加工，其中植物材料至少占混合物40％优选是50％的重量。或者，″脱水″植物材料可用液体如果汁、蔬菜汁、牛奶、水或其它的疫苗配方的方法来重构植物材料而使其得到进一步的加工，从而形成多效价或多成分疫苗。在本文中，赋形剂是指在加工的任何阶段加入的外源性原料。例如，可在分割转基因植物材料时，或脱水时，或脱水前后混匀时加入赋形剂。适当的赋形剂包括(但不限于此)佐剂、缓冲液、糖、抗氧化剂、稳定剂或抗原粉。在本文中，″多肽″表示一系列的氨基酸残基，它们通过一个氨基酸的羧基碳原子与下一个氨基酸羧基氮原子间的肽键相联。此处的“多肽”可以是整个蛋白、蛋白的片段或蛋白的免疫表位。用在此处，″透明带糖蛋白″是指组成哺乳动物透明带的三个硫化的糖蛋白。该透明带还包括一层由卵母细胞微绒毛以及卵泡细胞的细胞突起。透明带糖蛋白，特别是ZP3，是作为哺乳动物精子的主要结合部位。透明带，特别是透明带糖蛋白ZP3可应用ZP3特异性抗体和标准免疫组化技术而被鉴定(在East等，1985，Dev.Biol.109268中有很好的描述)。在文献中用来描述ZP糖蛋白的命名法是不同的。例如，ZP糖蛋白包括(但不限于此)，从猪分离的ZP蛋白有PZI，PZIII，90K，65K，55K，25K，ZP1，ZP2，ZP3(PPZA)，ZP4，87K(ZP1/ZP2)，58K等；从兔分离的ZP蛋白有RZI，RZII，RZIII，ZP1，ZP2，ZP3，RZII等；从小鼠分离的ZP蛋白有ZP1，ZP2，ZP3；从猫分离的ZP蛋白有CZI和CZII；从狗分离的ZP蛋白有DZI，DZII，和DZIII；从松鼠猴分离的ZP蛋白有ZP1，ZP2，ZP3，和ZP4；从人分离的ZP蛋白有ZP1，ZP2，和ZP3。除了上述的ZP肽外，许多物种(如小鼠、人、仓鼠、兔)的ZP糖蛋白编码核苷序列已被阐明，在本发明中它们是有用的，因为它们可编码抗孕蛋白。本发明对其糖蛋白分别命名为ZP1，ZP2，ZP3。然而，其它的文献将ZP糖蛋白分成ZPA、B和C，其中ZPA包括ZP1、ZP2所指的肽，ZPB包括ZP3∝和rc55所指的肽，ZPC包括ZP3β和ZP3所指的肽(参见美国专利5,989,550)。在此处，″免疫抗孕″指由针对抗孕蛋白的免疫反应引起的暂时的、可逆性的抗孕，也指永久性非可逆性抗孕或绝育。对于平均每窝的幼仔数目为3个或更多的动物物种，当接受免疫抗孕动物的每个生育周期的平均幼仔数量减少了至少60％、70％、80％、90％甚至到100％，那么可认为免疫抗孕是″有效的″。对于每窝的平均幼仔数目少于3的动物物种，有效的免疫抗孕将导致幼仔数量减少至少50％甚至达100％。此处，免疫反应是指生物体的免疫系统对包括(但不限于此)外源性或自身蛋白等物质引起的反应。普通类型的免疫反应包括(但不限于此)黏膜、体液和细胞免疫反应。黏膜免疫反应是由覆盖呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的黏膜的分泌型IgA以及来自所有分泌腺的分泌物中的分泌型IgA(sIgA)抗体的产生引起的免疫反应(McGHee，J.R.etal.，1983，annalsNYacad.Sci.409)。这些分泌型IgA抗体可阻止病原体在黏膜表面的定植(Williams，R.C.etal.，Science177，697(1972)；McNabb，P.C.etal.，Ann.Rev.Microbiol.35，477(1981))，因而是阻止病原体通过黏膜入侵或定植的第一道黏膜保护屏障。可通过对分泌腺或组织的局部免疫或暴露抗原给肠道相关淋巴组织(GALT或Peyer′s斑)或支气管相关淋巴组织等方法来刺激sIgA的产生(BALT；Cebra，J.J.etal.，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.41，210(1976)；Bienenstock，J.M.，Adv.Exp.Med.Biol.107，53(1978)；Weisz-Carrington，P.etal.，J.IMMUNOL123，1705(1979)；McCaughan，G.etal.，InternalRev.Physiol28，131(1983))。膜性小结相关上皮细胞，也叫做M细胞，覆盖了肠道相关淋巴组织或支气管相关淋巴组织的表面，并且可能和其它的分泌黏膜表面有关。M细胞可从邻近黏膜表面的体腔内提取抗原并将其转移到抗原递呈细胞(树状突细胞和巨噬细胞)，后者依次将抗原递呈至T淋巴细胞(当抗原是T细胞依赖性时)，T淋巴细胞将抗原处理后呈送给待命的B细胞。然后B细胞被刺激而增殖，迁移并最终被转化成抗体分泌型浆细胞而产生针对所递呈抗原的IgA。当该抗原被覆盖在肠道相关淋巴组织或支气管相关淋巴组织的M细胞所俘获时，全身的分泌组织都可产生针对抗原的分泌型免疫球蛋白(sIgA)主导的全身黏膜免疫反应。(Cebra等，supra；Bienenstock等，supra；Weinz-Carrington等，supra；McCaμghan等，supra)。因此经口接种是刺激全身免疫反应的重要途径，它可引起口腔和胃肠道的局部刺激分泌免疫反应。免疫反应可用文献中介绍的方法检测到。例如，可从被怀疑发生了免疫反应的生物体中获得血清、全血或其它的分泌物，再用酶联免疫吸附实验来检测上述免疫球蛋白的出现(ELISA；美国专利5,951,988；Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology3rdEd.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。依照本发明，当在经过抗孕蛋白处理过的动物中定量检测到的免疫球蛋白水平与没有经过抗孕蛋白处理过的动物中检测到的免疫球蛋白水平在统计学上有差异时，就可以说，本发明中的抗孕蛋白激发出免疫反应，其中免疫球蛋白是特异性地针对该抗孕蛋白的。可用文献中提供的统计学方法包括(但不限于此)单因素方差分析、Student氏T-检验以及其它类似的方法来检验检测到的免疫球蛋白的差异，其中的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005＜0.001，和＜0.0001。可用其它的方法如免疫组化来检测免疫反应，所用的抗体是特异性针对在免疫反应中升高的免疫球蛋白的标记抗体。根据本发明中的方法饲喂过抗孕蛋白的动物的组织(如卵巢组织)获得后可用文献中常规的方法处理以备免疫组化检测Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology3rdEd.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。通过扫描免疫组化染色的组织标本并用文献中介绍的电脑软件包括(但不限于此)NIHIMAGE(美国国立卫生研究所，Bethesda，MD)，来定量染色的水平，从而对免疫组化方法获得的显微镜下的资料进行定量。依照本发明，当在经过抗孕蛋白处理过的动物中用免疫组化染色定量检测到的免疫球蛋白水平与没有经过抗孕蛋白处理过的动物中用免疫组化染色定量检测到的免疫球蛋白水平统计学上有差异时，就可以说，本发明中的抗孕蛋白激发出免疫反应，其中组织化学染色需要特异性地结合该抗孕蛋白。可用文献中提供的统计学方法包括(但不限于此)单因素方差分析、Student氏T-检验以及其它类似的方法来检验检测到的免疫组化染色水平的差异，其中的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005＜0.001，和＜0.0001。可用上述的方法中的一种来检测黏膜免疫反应。例如使用抗-IgA抗体的酶联免疫吸附实验可被用来检测黏膜特异性免疫球蛋白(Dickinson，B.L.&Clements，J.D.DissociationofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinadjuvanticityfromADP-ribosyltransferaseactivity.InfectImmun63，1617-1623(1995))。在此处，佐剂是指与抗原共同饲喂给动物后可增强对该抗原的免疫反应的化合物(ColiganLGetal.eds.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995)。一种佐剂之所以有效，是因为它可通过延迟抗原的破坏而使其在组织中保持较低的、但有效的抗原水平或通过激发一种炎症反应或其它可提高免疫敏感性的免疫反应而非特异性地激活免疫系统。在本文中，种系特异性是指核酸或氨基酸序列是其来源的种系所特有的。例如，编码透明带糖蛋白的种系特异性核酸序列是指该核酸序列与不同物种来源的编码对应的透明带糖蛋白的核酸序列的同源性不超过95-70％、80-50％和60-40％。特定核酸和氨基酸序列的种系特异性可用文献中常规的方法包括染色体区带分析来检测。在本文中，黏膜靶蛋白是指一种多肽，当它与第二种蛋白共轭结合或者以与之成融合蛋白的形式表达就可增加组合肽激发黏膜免疫反应的潜能。黏膜靶蛋白可以不是所引入生物体的内源性多肽。有证据显示，当黏膜靶蛋白和一种抗原(如ZP糖蛋白)一起经口用药时，它可作为佐剂而增强保护性免疫反应(Black等，INFECT.IMMUNOL.551116(1987))。因此，当至少以10μg、1μg、500ng甚或1ng的剂量给药时，黏膜靶蛋白是对黏膜上皮细胞有神经节苷脂亲和力的一种蛋白，它能促进蛋白在黏膜上皮细胞膜上的转位，所以黏膜靶蛋白可能对诱发分泌免疫反应来说是重要的。可预见的是，抗孕蛋白和黏膜靶蛋白的基因融合产物可能比较容易转运到黏膜细胞并引起局部分泌免疫反应增强。黏膜靶蛋白的例子包括(但不限于此)大肠杆菌肠毒素亚单位B和A，霍乱毒素、志贺氏菌毒素B(StxB)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、诺瓦克病毒外壳蛋白(NVCP)，以及乙型肝炎病毒表面抗原。可通过用一些方法如酶联免疫吸附实验或免疫组织化学方法检测由于组合蛋白的应用而引起的黏膜免疫反应(如检测分泌型IgA的水平)并用上述的统计学方法观察，并且与只应用抗原蛋白而不用黏膜靶蛋白时的情况相比较，观察该免疫反应有无明显增加，以判断一种多肽将抗原的免疫原性传导给黏膜的能力。在此处，动物是指在动物类目中分类的一种生物体。在本文中，动物是指哺乳动物。在本发明中有用的动物包括(但不限于此)哺乳动物，有袋类，老鼠，狗，猫，母牛，人，鹿，马，羊，家畜类，家禽，鸡肉，火鸡，驼鸟，鱼，鳍鱼，贝壳鱼以及诸如此类。在本文中，单子叶植物是指胚芽只有一个子叶的一种类型植物。单子叶植物包括(但不限于此)百合；草；玉黍蜀；谷粒，包括燕麦，小麦和大麦；兰花；野鸢尾；洋葱和棕榈树。在本文中，双子叶植物是指胚芽有两个子叶的一种类型植物。双子叶植物包括(但不限于此)烟草；蕃茄；包括紫花苜蓿的豆类；橡树；枫；玫瑰；白苏；南瓜；雏菊；胡桃；仙人掌；紫罗兰和毛良。在本文中，核酸载体是指一种核酸分子，它能转运与其连接在一起的另一种核酸。一类载体是质粒，它是一种环形双链的核酸分子，另外的核酸序列片段可与其连接。某些类型的载体可在其被导入的宿主细胞内自动复制(如有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳类载体)。另外的载体(如非游离型哺乳类载体)在导入到宿主细胞后可与宿主细胞的基因组整合，并与其一起复制。此外，某些载体能指导和它们适当地连接基因的表达。那样的载体在这里被称作表达载体。一般来说，用于核酸重组技术的表达载体常常以质粒的形式出现。在本发明中，质粒和载体在应用时可互换，因为质粒是最常用的载体类型。在本文中，启动子是指一段DNA序列，常常位于一个结构基因编码区域的上游(5′端)，它可提供识别和结合位点给核糖核酸聚合酶以及在复制启动中需要的其它因子，并因此控制编码区的表达。启动子的选择依赖于研究者感兴趣的核酸序列。一个植物功能性启动子是指能在植物细胞中支持复制启动。在本发明中有用的植物功能性启动子包括(但不仅限于此)菜花样花叶病毒(CaMV)的启动子(35S)、种子存储基因如Zma10Kz和Zmagl2的启动子、光感应基因如核酮糖二磷酸羧化酶小亚单位(rbcS)、应激诱导基因如乙醇脱氢酶(Adh1)，或在所有细胞中表达的看家基因(如Zmact，一个玉米肌动蛋白基因)、番茄E8启动子、泛素、甘露糖合成酶(mas)、稻谷肌动蛋白、大豆球蛋白(Gyl)、大豆营养存储蛋白(VSP)、颗粒结合淀粉合成酶(gbss)。其它的植物功能性启动子包括在可食用植物部分高表达的基因的启动子，如来自马铃薯的patatin基因启动子。在本文中，可操作的连接是指联合核酸序列适当的位置和次序，其中上述核酸成分相互间的位置关系允许它们以特定的方式行使其功能。当一个控制序列以可操作的方式与一个编码序列连接时，其结合方式必要能使编码序列在与控制序列相容的条件下完成其表达。当一个启动子序列控制基因转录的转录起始位点有足够的相似性时，就可认为该启动子是以可操作的方式连接到一个基因上。用在此处，给药是指将本发明中转基因植物材料、细胞、组合物以及药物配方递送给动物，具体的递送方式要求保证递送的材料与被给药动物的黏膜表面接触。本发明中有用的递送途径包括(但不仅限于此)，经鼻，经直肠或经阴道递送(如栓剂或局部给药)，或被递送的材料与黏膜表面直接接触的递送途径(即经黏膜递送)。在本文中，“制药学上可接受的”是指不干扰药物活性成分生物活性发挥的无毒材料。载体的特性取决于用药的途径。用在此处，“黏膜表面”、“黏膜表层”、“黏膜”是指这些结构公认的医学定义，它是指一些由上皮层、固有层以及在消化道时还有一层平滑肌组成的结构的黏膜表面。黏膜表面的例子包括(但不仅限于此)支气管的内表面、鼓室腔的黏膜层、结肠的内黏膜、输精管的内表面、食道内膜、小肠的黏膜层、喉的黏膜层、舌的黏膜层、垂体膜、口腔黏膜、咽腔黏膜、气管黏膜、咽鼓管黏膜、子宫内膜、阴道黏膜、胃黏膜、膀胱黏膜、精囊腺黏膜。用在此处，种系是指生物属的划分和生物个体的一种生物分类，其中一个种系的所有生物个体在他们的整体形态、躯体大小和发育等方面有很大的相似性。用在此处，稳定材料是指保存在室温下的植物材料。其中稳定的转基因植物材料是指其中的异种蛋白或转基因蛋白保持有效，当用某些方法如酶联免疫吸附实验、定量蛋白印记实验或凝集实验等检测时，其免疫反应性并没有明显的下降。根据本发明的过程，在生产时观察到了至少40％的免疫反应性，保持至少5个月之久，以及更长的时间，至10个月、12个月或18个月或甚至更久，就可认为该异种蛋白是稳定的。图1aElisa检测T0植物叶和果实标本中的LTB含量图1bElisa检测T1植物叶和果实标本中的LTB含量图1cElisa检测的植物叶和果实标本中LTB含量的队比较图2a受检小鼠中抗LTB抗体的平均终末稀释度。柱子表示当OD450读数为0.1时，接受相同处理的6只动物的平均血清稀释度。实验动物的处理包括给小鼠饲喂非转基因番茄(对照组)、给小鼠饲喂转基因番茄糊剂(实验组)以及给小鼠饲喂给小鼠饲喂转基因番茄糊剂与10mg的Quillaja提取粉末(Garuda)。误差线代表标准误差。图2b该图显示，给小鼠饲喂表达LTB和鼠ZP3表位融合后的融合蛋白的番茄材料后抗LTB抗体效价的升高(系列1)与生育力下降(系列2)的关系。第三组的数据表示饲喂与额外的佐剂混合后的番茄材料的实验组小鼠。图3经口饲喂受检材料对小鼠生育力的影响。每个柱子代表一个接受特定处理的6只动物平均效应，其中“对照”表示给饲喂动物非转基因番茄糊剂的结果，“实验”表示给动物饲喂转基因番茄糊剂的结果，“实验+佐剂”表示给动物饲喂转基因番茄糊剂加10mg佐剂粉末(Garuda)的结果。误差线代表标准误差。图4经口饲喂受检材料对田鼠生育力的影响。每个柱子代表一个接受特定处理的6只动物平均效应，其中“对照”表示给饲喂动物非转基因番茄糊剂的结果，“实验”表示给动物饲喂转基因番茄糊剂的结果，“实验+佐剂”表示给动物饲喂转基因番茄糊剂加10mg佐剂粉末(Garuda)的结果。误差线代表标准误差。图5aLTB融合体的构件。图5b另外的LTB融合体的构件。图5c氨基端融合“盒”。图6该图显示了有关三个表达在转基因番茄(NT-1)悬浮培养细胞中的免疫抗孕融合体的平均和高峰表达水平的资料。以夹心酶联免疫吸附试验为基础来测定抗原决定族，其中原发的反应是LT-B特异性的，而继发反应是融合抗孕蛋白特异性的(依应用的融合体构件的不同，可以是小鼠ZP3表位，或GnRH十肽)。LTB-GnRH2的资料显示，融合蛋白的结构可干扰自然的寡聚化作用，因此正如夹心酶联免疫吸附试验检测融合表位的能力下降一样，完全形成的五聚物的检测也是明显下降的。表1加工后的材料提高的同质性。来自加工过的或未加工过的转基因植物材料的抗原含量，这些植物材料是成批地混合在一起或来自特定的植物类别的没有混合的标本。图7该图显示了用不同地切割方法时干燥时间的影响。表2不同组织的抗原回收率以及用不同方法获得抗原的浓度。用做菜泥和冷冻干燥的方法处理番茄(生物药)，可检测到的抗原浓度平均增加至4.2倍。当先用切方或四分法然后用冷冻干燥的方法处理同一材料，则可检测到的抗原浓度增加至15.2倍。当在冷冻之前用做菜泥的方法来使材料匀浆化时，其它的材料如转基因番茄中的抗原一样地被破坏。当用冷冻干燥的方法来处理转基因胡萝卜材料(而没有做菜泥或切片)时，抗原浓度与生料是相同的，与重量的下降正好成比例，进一步提示该处理可保存抗原。图8在多样性的材料中随时间而进行的水分重吸收。图9抗原稳定性。图10T2果实材料的加工对LTB含量的影响。实心柱表示收集在一起果实中的平均LTB浓度，而误差线代表均数地标准误差。图11受检成年小鼠血清标本中抗-LTB抗体的平均终末稀释度。其中“对照”柱表示给小鼠饲喂野生型番茄粉末时的平均终末血清稀释度，“转基因”柱表示给动物饲喂转基因番茄时的平均终末血清稀释度，“转基因+佐剂”柱表示给动物饲喂转基因番茄加Quillaja提取粉末时的平均终末血清稀释度。终末血清稀释度是由OD450nm时的读数为0.1时的第一个血清稀释度。对照组的标本数为3，转基因组为4，转基因+佐剂组为2。误差线代表均数的标准误差。图12受检幼鼠血清标本中抗-LTB抗体的平均终末稀释度。其中“对照”柱表示给成年小鼠饲喂野生型番茄粉末时其幼仔的平均终末血清稀释度，“转基因”柱表示给动物饲喂转基因番茄时其幼仔的平均终末血清稀释度，“转基因+佐剂”柱表示给动物饲喂转基因番茄加Quillaja提取粉末时其幼仔的平均终末血清稀释度。终末血清稀释度是由OD450nm时的读数为0.1时的第一个血清稀释度。对照组的标本数为18，转基因组为17，转基因加佐剂组为13。*包括OD值小于0.1的血清标本，采用其最小的稀释度(25个中的一个)。误差线代表均数的标准误差。图13截断效价与幼仔效价的关系。所谓的截断终末稀释度是指在相应的幼仔出生前的最后一次抽取的血清标本的抗体终末稀释度，幼仔的终末稀释度表示一窝幼仔的平均抗体终末稀释度。终末血清稀释度是由OD450nm时的读数为0.1时的第一个血清稀释度。截断数为7，幼仔窝数为9，幼仔数为13。图14a冻干的LT-B马铃薯材料的稳定性研究图。图14b冻干的LT-B马铃薯材料的稳定性研究图。图15冻干的HAONT细胞的稳定性研究。图16冻干的HA110-A11马铃薯材料的稳定性研究。图17冻干的SLT102细胞的稳定性研究。具体实施例方式本发明提供了转基因植物生物药的生产方法。本文描述的方法可用于生产室温下稳定、匀质和药效明显的干燥转基因植物材料。一般而言，可产生生物药的完整的或分割过的转基因植物可应用文献终已知的食品处理的方法进行干燥或冻干。该干燥匀浆产物可被用作治疗而无须进一步的提取、纯化或沉淀该药物蛋白。因此形成的转基因植物材料含有易于操作的特定量的粉末，并且在环境稳定下保存12个月都可以保持稳定。此外，本文描述的批处理技术明显地增加了不同植物或植物组织之间可测定抗原的一致性，并通过浓缩抗原而提高药效。转基因植物种系可用于本发明中的转基因植物种系包括双子叶植物和单子叶植物种类。具体的植物包括(但不仅限于此)胡萝卜，菠菜，胡椒粉，马铃薯，蕃茄，苹果，小麦，裸麦，大豆，稻谷，玉蜀黍，玉黍蜀，浆果如草莓，复盆子，紫花苜蓿和香蕉的草莓类植物等。因为人类用作食物或动物的食物组分的可食用植物是双子叶植物。虽然单子叶植物植物对动物是有益的食品，但常用的还是双子叶植物。依照本发明，来源于这些植物的细胞和种子作为疫苗也是有用的。可用文献种已知的任何方法来生产转基因植物。在一个实施例中，一系列的转基因植物种系包括烟草、马铃薯和胡萝卜在温室内部条件的生物安全性水平下生长，不应用任何的杀虫剂或除草剂，并让其生长到成熟阶段。在本发明种有用的转基因植物表达外源性蛋白。适当的外源性蛋白包括(但不仅限于此)诺瓦克病毒壳蛋白(NVCP)，禽流感病毒血细胞凝集抗原(AIV-HA)，新城疫病毒神经酰胺酶[(NDV-HN)，透明带糖蛋白3(ZP3)，以乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，植物生成的抗体(如植物抗体)以及其它的治疗性蛋白(如内皮他丁和血管他丁)。收获收获转基因植物可用手工或机器，或用文献种已知的任何方法。收获的方法可能随不同的植物种系而不同。在一个实施例中，转基因马铃薯或胡萝卜克整批地收获并保存在4℃至加工处理。再举例来说，对于将要成熟或已经成熟的转基因番茄果实，可在6周地时间内，每二周一次地收获，并且在收获后立即加工处理。在另一个实施例中，在将番茄果实、马铃薯块茎或胡萝卜根放在0.1％氯溶液(1％次氯酸钠)中清洗以除去泥沙和生物负载之前，用手工将它们的叶子或茎去掉。为了保持实验记录，每一批的材料被记数和称重，并填写收获和加工处理记录表格。匀浆转基因植物材料的匀浆化既可在干燥前也可在干燥之后进行。在一个实施例中，在干燥之前进行匀浆化，主要包括对新鲜收获的植物材料进行粗糙的成浆和混匀，然后对该混合材料进行冷冻，接着是冷冻干燥。首先进行的切片、混匀或研磨处理，将原始植物组织(水果，块茎，叶，种子等)简化为一种浆状混合物。该混合物被认为既含有完整的植物细胞，也有被研磨细胞的碎片，。该处理的好处是将较大的植物器官如果实或块茎等简化为一种便于处理的混合物，因而同源蛋白的含量不同的各个植物组织被组合成一批更加统一的材料。该处理能够提供一种统一成批的材料，而没有完全破坏其中所有植物细胞的完整性，因而能够在随后的处理阶段同源蛋白的保存提供稳定的环境。在另一个实施例中，在匀浆化之前，需要对植物材料进行最小限度的处理。对切片、四分后的或完整的材料进行冷冻干燥后在实施匀浆化处理。因此而生成的材料被碾碎成精细的粉末，整个都放置到单个的批处理容器内，并用摇动或干燥混合等机械的方法充分地混匀以获得一匀浆混合物。分割可用文献重已知的方法将整个植物或完整的植物部分的尺寸缩小。分割的方法包括(但不限于此)二等分、四分、切碎、切片、切方、做菜泥、制浆、研磨、压碎、压制或裂化等。如果选择做菜泥，将新鲜收获的果实、块茎或根放在Stephan工业公司生产的垂直混合器/切片机中约一分钟。最多每次只能处理约20磅的植物材料。当将马铃薯做菜泥时，可加入一定量的水(可多至500毫升)辅助该处理过程。做菜泥时植物原料的温度优选不要超过2℃。在一个实施例中，然后该匀浆被倾倒在一个标示清楚的冷冻-40℃托盘内。为防止任何基因改变后的果浆或种子的丢失，需要用纸巾檫拭混合器/切片机。也可用任何文献中已知的方法对材料进行四分、脱皮或切片。脱水在一个实施例中，四分、脱皮或切片后的转基因植物材料被转移到冷冻托盘并放置于一工业用冷冻器内在-30℃下冷冻干燥2-6天，其最高的贮存温度25℃。因此而形成的材料被放置于一个标示清楚的容器内并与填写好的收获和加工处理记录表格一起放回原地。在另一个实施例中，转基因材料在1-加仑的不锈钢Waring混合器中切片，标本被转移到500毫升或1升的烧瓶中，再用一个实验用冷冻干燥器对其进行冷冻干燥。在这种情况下，植物材料需要在30℃下干燥1-6天。抗原浓度的检测可用酶联免疫吸附实验(ELSA)来分析植物材料以检测其中的待检抗原的浓度，或用适当的凝集实验检测植物组织中含有的抗原。被用来检测原始材料和加工过的材料中特定抗原的方法应该始终是一致的。稳定性和赋形剂的应用为了评价加工过的材料在环境温度下的稳定性，在冷冻干燥后立即抽取10-50克的标本，在拿到实验架上保存之前，将其放置于密闭袋内，并将袋子放在另一个容器内。保持环境温度在23±2℃。剩余的加工后的材料被保存在4℃或-20℃。定期地从每一种保存条件下的材料中抽取标本，用适当的方法比较其抗原浓度，以检测保存在环境中的材料地相对稳定性。抗孕本发明是基于这样的发现，即转基因植物可表达诱发抗孕的蛋白，给动物饲喂转基因植物材料可充分地诱发一种针对该抗孕蛋白地黏膜免疫反应，这样就达到了有效抗孕。本发明提供了免疫抗孕地方法，即给动物饲喂表达一种抗孕蛋白地转基因植物，其中给动物饲喂转基因植物可在被饲喂地动物中诱导一种黏膜免疫反应。本发明还提供了一种方法以生产表达一种在本发明中有用的抗孕蛋白、并可饲喂动物的转基因植物，并进一步提供了一种转基因植物，给动物饲喂后可在诱发动物抗孕。抗孕蛋白本发明提供了转基因的植物材料，其细胞表达一种可在被饲喂该植物的动物中诱发抗孕的蛋白或多肽。在本发明中有用的抗孕蛋白包括(但不限于此)透明带糖蛋白、促黄体激素释放激素、促黄体激素、乳酸脱氢酶和抗精子抗原。透明带糖蛋白透明带是包绕卵母细胞的一层坚固、可曲折的细胞外糖蛋白基质。它的特征性的条纹外观是由穿透它的无数的纤细的管道造成的。来自卵泡细胞细胞质突起延伸至透明带并且偶尔将卵母细胞的细胞膜套进内部。卵泡细胞细胞质突起也将营养材料转移到卵母细胞的表面。另外，卵母细胞的微绒毛也延伸进透明带并增加在卵母细胞表面的吸收能力。[参见，W.J.Hamilton，ed.，Hamilton，BoydandMossman′sHumanEmbryology，pp.27-32and54-64(1972)；J.B.Warshaw，ed.，TheBiologicalBasisOfReproductionAndDevelopmentalMedicine(1973)]。透明带糖蛋白，在本发明中是有用的抗孕蛋白，包括各种形式的可诱导生成针对透明带的抗体的基质糖蛋白，包括透明带糖蛋白1，2，3和4。这些糖蛋白包含有可在卵母细胞发育的晚期阶段、成窦和排卵前阶段的透明带表位，也包括在排卵后才表达的抗原决定族。在一个优选的实施例中，本发明中的抗孕蛋白是ZP3糖蛋白，或者其中的一个表位。本发明中的一个抗孕蛋白表位至少是6，8，10，12，14，20，直至30个氨基酸长度。用在此处，在本发明中有用的抗孕蛋白的一个表位是指该抗孕蛋白的能激发黏膜免疫反应的一部分。可用文献中已知的方法来检测饲喂过抗孕蛋白表位的动物中分泌形IgA的数量，并以此来测定该抗孕蛋白激发黏膜免疫反应的能力。例如，可用应用抗-IgA抗体的酶联免疫吸附试验来检测饲喂过抗孕蛋白表位的动物中的分泌型IgA的数量，并与没有饲喂该表位的动物中的分泌型IgA的水平作比较。如用文献中已知的统计检验发现了这两种不同处理组的动物间存在统计学上有意义的差异，则提示该表位能诱发黏膜免疫反应。本发明中有用的统计检验的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005，＜0.001，＜0.0005，优选＜0.0001。虽然不同种系动物的透明带的形态学特征相同，但不同动物种系的透明带具有不同的免疫区域或表位(Timmonsetal.，InPerspectivesinImmunoreproductionConceptionandContraception(Mathuretal.，eds.)HemispherePUBL.，pp.242-260(1988)).从不同动物种系种分离到的一些透明带蛋白，在本发明种可作为有用的抗孕蛋白。从猪种分离到的透明带蛋白包括PZI，它是由Dunbar等分离到的一个分子量为40-110kD的蛋白，Biol.Reprod.241111(1981)；PZII，一个70-110kD的蛋白，PZIII，一个95-118kD的蛋白，以及PZIV，一个18-25kD的蛋白，均由Dunbar等分离到。(Biol.Reprod.32619(1985))；90K，一个89-119kD的蛋白，65K，一个61-83的蛋白，55K，一个47-66kD的蛋白，以及25K，一个18-26kD的蛋白，均由Hedrick，J.L.和Wardrip，N.J.分离到。(BIOCHEM.15763(1986))；ZP1，一个82-118kD的蛋白，ZP2，一个58-96kD的蛋白，ZP3(PPZA)，一个40-74kD的蛋白，以及ZP4，一个21kD的蛋白，均由Subramanian等分离到。(Biol.Reprod.24933(1981))；87K(ZP1/ZP2)，aReprod.29511(1983))；去糖基化的PZI，一个35kD的蛋白；PZII，一个55kD的蛋白；以及PZIII，一个80kD的蛋白，均由Skinner和Dunbar分离到，在“ImmunologicalApproachestoContraceptionandthePromotionofFertility，G.P.Talwar(ed.)NewYorkPlenumpp.251-268(1986)”一书中有描述；以及分子量为45kD的去糖基化的ZP3，由Sacco等分离到的77-97kD的蛋白58K，一个40-70kD的蛋白，也是由Yurewicz等分离到(Biol.J.Reprod.Fertil.76575(1986)).从兔中分离到的透明带蛋白包括RZI，RZII，和RZIII，其分子量分别为68-125kD，80-100.5kD，和100-132kD，均由Dunbar等分离到。(Biol.Reprod.241111(1986))ZP1，ZP2，andZP3的分子量分别为100-118kD，83-110kD，和80-92kD，均由Sacco等分离到(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981))；去糖基化的RZI和RZII的分子量分别为65kD，和80kD均由Skinner和Dunbar分离到。在“ImmunologicalApproachestoContraceptionandPromotionofFertility.G.P.Talwar(ed.).NewYorkPlenum，pp.251-268(1986)”一书中有描述；以及去糖基化的RZIII，一个90kD的蛋白，由Timmons和Dunbar分离到。(Biol.Reprod.361275(1987))。已经分离到的小鼠透明带蛋白包括ZP1，ZP2和ZP3；其分子量分别为200kD，120kD，和83kD，均由Bleil和WASSARMAN分离到(Dev.Biol.76185(1980))；以及分子量分别为166-122kD和90-92kD的ZP1和ZP2，由Sacco等分离到(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981)).Bleil和Sacco等报告了小鼠ZP1和ZP2分子量的差异，这可能是因为Bleil用的是2D-聚丙烯酰胺凝胶非递减电泳而Sacco用2D-聚丙烯酰胺凝胶递减电泳。猫的透明带蛋白CZI和CZII是由Maresh和DunbarJ分离到(Exp.Zool.244299(1987))，其分子量分别是50-110kDand90-110kDMaresh和Dunbar(J.Exp.Zool.244299(1987))，分离到狗的透明带蛋白DZI，DZII和DZIII其分子量分别为50-110kD，70-95kD，和90-100kD。Sacco等(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981))描述了松鼠猴的透明带蛋白ZP1，ZP2，ZP3，和ZP4，其分子量分别为63-78kD，63-70kD，47-51kD，和43-47kD。在同一个出版物中Sacco等描述了人透明带蛋白ZP1，ZP2，和ZP3，其分子量分别为80-120kD，73kD，和59-65kD。除了上述的透明带肽外，已有一些动物物种的透明带糖蛋白编码核酸序列被阐明，因为它们编码抗孕蛋白，所以在本发明中是有用的。例如，Ringuette等(Dev.Biol.，(1988)127287-295)以及Liang等(Mol.Cell.Biol.，(1990)101507-1515)已经分别报道了编码透明带蛋白ZP3和ZP2的小鼠DNA序列。这些克隆是通过用抗-ZP3和抗-ZP2来筛查小鼠的cDNA文库的方法而获得。在小鼠的ZP3和ZP2之间没有发现序列同源型。Ringuette等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1986)834341-4345)报道了小鼠的部分ZP3cDNA克隆。该克隆能与小鼠、大鼠、狗、牛以及人的基因组DNA杂交，但不能与猪或兔的基因组DNA杂交，除非采用低严谨度的条件来进行杂交。Ringuette描述了全长的ZP3cDNA序列(Dev.Biol.(1988)127287-295)表现出一个种系特异性的mRNA，即相对短的5和3′端非翻译区，约1317个核苷酸的开放读码框以及另外的大约2000-3000个核苷酸的poly-A尾。Ringuette也发现大鼠、兔、狗核牛卵巢种存在能与小鼠的ZP3cDNA杂交的mRNA的转录，并且ZP3的转录物有相似的分子量。Liang等(Mol.Cell.Biol.，(1990)101507-1515)的实验也显示ZP2的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列与ZP3的明显不同，虽然它也有相同的5′和3′端非编码区的短基序。ZP2mRNA被报道有2,139个核苷酸组成的单个开放读码框，编码713个氨基酸组成的分子量为80,217D的多肽。Chamberlin和Dean，(Dev.Biol.(1989)131207-214)以及Kinloch，R.A.等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，(1988)856409-6413)已经报道过ZP3基因的克隆。小鼠ZP3基因被报道有8个外显子和7个内含子，转录单位的长度为8.6kbp。Kinloch等(Dev.Biol.(1990)142414-421，)报道了用一个小鼠的ZP3DNA作为探针从一个仓鼠基因组文库中克隆仓鼠基因组ZP3DNA。仓鼠的ZP3基因有一个长度为7900个核苷酸的转录单位，被发现有7个内含子核8个外显子。仓鼠的ZP3蛋白与小鼠的ZP3蛋白的同源性大约为81％。仓鼠的ZP3转录单位有1266个核苷酸，比小鼠的ZP3mRNA.少6个核苷酸。Chamberlain和Dean(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876014-6018)报道了用一个小鼠的ZP3cDNA作为探针从一个人基因组DNA文库中克隆人ZP3。人ZP3基因含8个外显子，其转录单位的长度为18.3kbp。外显子的长度与小鼠ZP3的8个外显子的长度几乎相同，并且其编码区的核苷酸序列的同源性为74％。人ZP3的转录与小鼠ZP3mRNA非常相似。二者均短的5′和3′端的非翻译区，并且二者都只有一个1272个核苷酸组成的开放读码框，编码424个氨基酸组成的蛋白。授权给Dunbar的U.S.专利第4,996,297号，报道了用抗-ZP1核抗-ZP2抗体作为筛选探针分离编码兔ZP1和ZP2蛋白的三个兔透明带克隆。在Dunbar的专利中的图4中命名为P2和P3的序列表示长度分别为812和705个核苷酸兔的ZPcDNA。Schwoebel等(J.Biol.Chem.(1991)2667214-7219)用种系杂交亲和性纯化的抗血清分离到了一个编码55-kD兔透明带蛋白的全长序列cDNA(被命名为rc55)并描述其特征。该cDNA编码的蛋白与Liang描述的小鼠的ZP2蛋白有某些相似性。但是，当将rc55与小鼠的ZP2蛋白比较时却没有发现有同源性。其它在本发明种有用的ZP糖蛋白的核苷酸序列包括(但不限于此)促黄体激素释放激素(LHRH，基因库登记号No.X01059)，人ZP3A糖蛋白(基因库登记号No.XM004616)，人ZPB糖蛋白(基因库登记号No.XM001779)，牛ZPA核B糖蛋白(基因库登记号Nos.AB042653；AB042652)，鸡ZP1核3糖蛋白(基因库登记号Nos.AJ289697；AB031033)，小鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因库登记号Nos.Nos.AJ289697；AB031033)，小鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因库登记号Nos.NM011776；[NM011775]；NM009580)，田鼠ZP3糖蛋白(基因库登记号No.AF304487)，dunnartZPA(基因库登记号No.AF263025)，蓝尾袋鼯ZPA和B(基因库登记号Nos.AF263014；AF263013)，蓝尾袋鼯ZP2和3(基因库登记号Nos.AF079525；AF079524)猪ZP1，2，和3糖蛋白(基因库登记号Nos.S74651；E07737；D45064)，大鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因库登记号Nos.D78482；[AB000929]；[AB000928]，)猿ZP1和2糖蛋白(基因库登记号Nos.Y10822；Y10767)，猫ZP2和3(基因库登记号Nos.E07930；E06506)，狗ZP2和3(基因库登记号Nos.D45064；D45070)，以及袋鼠ZP3糖蛋白，澳大利亚专利No.AU78554/98).术语“透明带糖蛋白”，用在此处，包括完整的ZP蛋白、酶解或化学变形形式的ZP蛋白、或二者的混合体。此外，透明带糖蛋白还包括分离的ZP蛋白的抗原决定簇，本来它们是没有免疫原性的，但当它们被用化学方法连接到免疫原性携带分子(如LT-B)时，就可用作免疫原，这种情况下列就会描述到。一个透明带的抽提物包括一个完整的抽提物，三个组成透明带的单个糖蛋白部分中的一个或更多。其它的抗孕蛋白除了上述的透明带糖蛋白以外的其它抗孕蛋白或它们的片段，在本发明中可用作抗孕蛋白的其它蛋白。例如，在一个实施例中，可供选择的抗孕蛋白包括(但决不是仅限于此)GnRH(GnRH)、促黄体激素(LH)，乳酸脱氢酶(LDH)和抗精子抗原。除了这些抗孕蛋白外，在本发明中有用的编码抗孕蛋白的核苷酸序列也能用于产生表达该被编码的抗孕蛋白的转基因植物。例如，在本发明中有用的编码GnRH的核苷酸序列包括(但不限于此)人促黄体激素(基因库登记号No.XM005041)，大鼠促黄体激素(基因库登记号No.M31670)，刷尾负鼠GnRH基因库登记号No.AF193516，以及地鼠GnRH基因库登记号No.AF107315).在本发明中有用的编码促黄体激素的核苷酸序列包括(但不限于此)大鼠促黄体激素(基因库登记号No.D00576)，猪促黄体激素(基因库登记号No.D00579)，犀牛促黄体激素(基因库登记号No.AF024521)，貘促黄体激素(基因库登记号No.AF047606)，马促黄体激素(基因库登记号Nos.Y16326；Y16265)，牛促黄体激素(基因库登记号No.ML1506)，以及狗促黄体激素(基因库登记号No.Y00518)。在一个实施例中，本发明中的抗孕蛋白包括抗精子抗原。已经证明用完整的精子提取物对雌性和雄性动物进行免疫可导致不育(Tungetal.，(1979)J.Reprod.Immunol.20931)。因此，本发明中的抗孕蛋白可含有精子相关蛋白或编码该蛋白的核苷酸序列。这些精子相关蛋白包括(但不限于此)PH30(美国专利No.5,935,578)，PH34[美国专利No.5,723,305]，SP17(美国专利No.5,814,456)，SP22(美国专利No.6,197,940)，SP56(小鼠SP56基因库登记号No.U17108)，LDHC4(人LDHC4基因库登记号No.J02938；美国专利No.5,891,992；Goldburg″LDH-Xasasperm-specificantigen″，inT.WegmannandT.J.Gill(eds.)，ReproductiveImmunology，OxfordUniversityPress，1981，fertilin(小鼠fertilin基因库登记号No.AF167406；人fertilin基因库登记号No.AJ133005；树地鼠fertilin基因库登记号No.Y15965)；狒狒fertilin基因库登记号No.Y15520)；大猩猩fertilin基因库登记号No.Y15492)；小绢猴fertilin基因库登记号No.Y15512)；牛fertilin基因库登记号No.AF086808；and大鼠fertilin基因库登记号No.Y08616)。黏膜靶蛋白在本发明的一个实施例中，给动物饲喂转基因植物，该植物表达上述一种或更多中抗孕蛋白的一部分或其表位。文献中已经清楚地知道，免疫原性物质的黏膜靶向性高度地依赖于颗粒大小或其自然亲和力是否能达到有效地保证被M细胞识别的程度。此外，已经发现，通过给动物饲喂低剂量的某些种类的蛋白可有效地刺激黏膜免疫系统。特别是当这些蛋白具有能和黏膜层细胞表面不同的糖脂和糖蛋白特异地结合地特性时，更能达到刺激黏膜免疫的效应。因此，本发明提供了一种含有辅助免疫原性蛋白的融合蛋白，其中的辅助蛋白与复杂的免疫抗孕蛋白相融合，或者如果需要更小的可溶性抗孕蛋白，则让辅助蛋白和诸如ZP3表位或GnRH等融合，以增强抗孕性表位的免疫原性。依照本发明，在本发明中有用于刺激黏膜免疫反应的辅助蛋白包括抗原性蛋白如碘胺脒毒素B(StxB)(基因库登记号No.AJ132761)，葡萄球菌肠毒素B(SEB)(基因库登记号No.M11118)，LT-B(LT-B)(基因库登记号No.AB011677，大肠杆菌热不稳定性毒素A亚单位(LT-A)(基因库登记号No.AB011677，)诺瓦克病毒壳蛋白(NVCP)(基因库登记号No.AF093797)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(基因库登记号No.AF090842)。当需要组合抗原以便将免疫原性递送到体内时，则上述的抗原蛋白需要组合成抗原颗粒和/或组合物。下文将描述怎样构建一个融合蛋白，既含有本发明中有用的抗孕蛋白又含有能增强黏膜免疫原性的辅助蛋白。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)已经证实乙型肝炎表面抗原可在植物体内表达成病毒样颗粒(VLPS)(Masonetal.，1992)。该病毒样颗粒与已经被批准用于胃肠外免疫接种的重组酵母菌来源的疫苗相似，乙型肝炎表面抗原颗粒的形成需要该肽以其四个跨膜域插入到内质网(ER)膜上，然后该颗粒出芽到内质网腔内。在小鼠动物模型中的研究表明，植物来源的乙型肝炎表面抗原保持有B和T细胞抗原决定族(Thanavalaetal.，]1995).。植物细胞可产生一种具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原的病毒样颗粒的发现提示，植物是表达动物、病毒或细菌等装配成复杂结构蛋白的可能系统。因此，已经鉴定出了生成具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原颗粒素所必须的遗传学因素。这些因素，如调控和编码区域，可被组合到一个编码有本文描述的抗孕蛋白的载体中，以提供一种方法在植物中扩增表达该抗原蛋白。诺瓦克病毒壳蛋白(NVCP)诺瓦克病毒壳蛋白在植物中的表达及病毒样颗粒的组装，以及在小鼠中经口产生的免疫原性已经有报道(Masonetal.，1996).。诺瓦克病毒壳蛋白占总蛋白的0.3％，在烟草的叶子和马铃薯的块茎细胞内以大约60％的有效性组装成病毒样颗粒。当用负染电镜技术观察时，该空壳体与在一个昆虫细胞系统内产生的完全不能区分。而且，当采用强饲法给药4次，每次剂量低至10μg，或采用直接饲喂马铃薯块茎切片的方法给药4次，每次剂量低至50μg，二者均能使小鼠产生经口的免疫原性。该植物疫苗既可刺激血清IgG的产生，也可刺激肠黏膜IgA的产生。因此，已经鉴定出生产足够数量的诺瓦克病毒壳蛋白的病毒样颗粒以产生有效免疫原性的方法。可依照本文描述的基因扩增方法在植物中产生更高水平的抗原。大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)LT是一种强烈的黏膜免疫原，并且也是一种刺激针对与其一起用药的抗原的免疫反应(Clementsetal.，1988)。在植物中表达LT的B亚单位(LT-B)组装成能结合神经节苷脂GM1]的活性寡聚体(Haqetal.，1995)。已经发现，在LT-B的羧基末端添加一个微粒体固位序列(SEKDEL)可增加它在植物组织中的聚集，同时保留结合神经节苷脂的能力和其免疫原性。在经口饲喂小鼠LT-B的实验中，用强饲法饲喂烟草叶提取物或将马铃薯块茎不经过处理(而不是切成片快)直接饲喂都能刺激血清和肠黏膜抗LT-B抗体的产生(Haqetal.，1995)。来自这些动物的抗LT-B血清抗体表现出抑制LT活性，提示它具有作为保护性疫苗的潜在价值。用于抗孕蛋白表达的载体应用本发明的中心是一个核酸构建体的构建和运用，该核酸构建体含编码一种抗孕蛋白的核酸系列，有时也有编码一种黏膜靶蛋白的核酸序列，其中该核酸构建体能被导入到选定的植物细胞以生成一种表达该抗孕蛋白的转基因植物。在一个首先的实施例中，该核酸构建体优选是一种植物表达载体，一种可制备并能在植物细胞中复制的质粒。正如文献已知的，该构建体的核酸可含有DNA、RNA、合成的核酸、或其中几种的联合体。在数个实施例中，核酸构建体既含有抗孕蛋白也含有一种黏膜靶蛋白，此时编码该构建体的任一部分的序列根据需要均可插入其它的序列(如调控序列)。可利用文献中已经熟知的质粒主链来生成本发明中有用的核酸构建体，依照本发明，该中构建体可被用于介导抗孕蛋白在植物细胞中的表达。文献中有已知的可用作起始材料的适当质粒。下列作者已经描述过可用于转化植物组织的合适质粒，deFramond等.(Biotechnology1983，263)，An等.(EMBO1985，277)，Rothstein等.(Gene1987，53)，具体的质粒包括但不限于pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)，pIBT210(Haqetal.，(1995)Science268714)，pGEM(Promega，Medison，WI)pGPTV.kan(Beckeretal.，(1992)PlantMol.Biol.201195-1197.)，Agrobacterium-Tiplasmid(Whiteetal.，PlantBiotechnologyKungandArntzeneds.ButterworthPub.，Boston，MA，1989)除了这些载体外，文献中已经报道了许多其它的载体可适合用于本发明。在本发明中有用的载体构建体优选包含了编码抗孕蛋白的DNA序列。通过传统的方法获得编码抗孕蛋白的DNA序列，并将它插入到适合转化植物细胞的载体中。例如，可从基因组克隆的基因库中分离到DNA序列。或者通过反转录的方法制备DNA序列。然后可用下列许多种已知的技术将载体导入植物细胞中，因此生成转化细胞、组织和植物。也可依据抗孕蛋白的氨基酸序列或该蛋白已知氨基酸序列的一部分，用化学的方法合成其DNA序列。可应用数个文献种重要的方法来测定一种抗孕蛋白的氨基酸序列(参见，例如，Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology[3RD]Ed.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。编码抗孕蛋白或其一部分的DNA序列被用适当的方式插入到适当的载体种，抗孕蛋白才能正确地表达。换句话说，该DNA序列必须以正确地方法和读码框排列，这样DNA序列在植物种地表达才能有正确地氨基酸顺序。与传统的方法一致的是，一般需构建一个嵌合DNA序列，它包含有一个在植物组织种有功能的启动子以及编码一种抗孕蛋白的DNA序列。该DNA序列可能还含有在植物组织种有功能的3′端非编码序列。可通过在体外将编码抗孕蛋白或其中一部分的DNA序列插入到一个已知植物转化载体的限制性位点处而生成嵌合DNA序列。或者，先构建嵌合基因，然后将其插入到载体以生成一个植物转化载体。在本发明种有用的载体常常被插入到一个原核宿主细胞，例如大肠杆菌，在那里载体的数目通过复制而被扩增。应用文献中已知的方法，可将这些载体再从原核宿主细胞中分离出来，然后被用来转化有关的植物宿主细胞。本发明中的启动子序列包括但不限于依照本发明在植物宿主细胞中有功能的启动子。依照本发明构建的DNA构建体优选有一个可操作地连接在目的核苷酸序列5′端地植物功能性启动子。首先的启动子选自CVMV，γSein，Gelvin启动子CAMV35S，番茄E8，patatin，泛素，甘露糖合成酶(mas)，稻谷ACTIN1，大豆球蛋白(Gyl)，大豆植物存储蛋白(VSP)，以及粒结合淀粉合成酶(gbss)。本发明的基因构建体中也可包含一个转录增强区域，比如烟草腐蚀病毒(TEV)增强子，这在其它地方已经有所描述(CARRINGTON，)etal.(1990)。有时，本发明中的基因构建体可含有至少一个植物性储存蛋白(VSP)信号肽序列，例如一个可操作地连接到编码目的蛋白地核苷酸序列5′的aS或aL序列(Masonetal.1988)。编码抗孕蛋白的DNA以及可选黏膜靶蛋白DNA构建体的序列优选是处于单个启动子的控制之下，由此表达的融合蛋白含有所有的三个成分。这就保证了该抗孕蛋白和黏膜靶蛋白以等比例的方式合成，因此导致抗孕蛋白和黏膜靶蛋白的表达水平相似。或者，该黏膜靶蛋白被第二个启动子所驱动，该启动子可以双向的方式插入，或启动子是插入到一个其3′端核酸序列编码抗孕蛋白、而其5′核酸序列编码黏膜靶蛋白的基因构建体中。在本发明中有用的载体除了能携带上述的DNA构建体外，也可包含另外的选择性标记基因。依照本发明有用的标记基因可包含有编码选择性标记物的基因，比如抗生素抗性基因如细菌的四环素抗性基因。依照本发明，四环素抗性基因的组合使得在质粒制备的过程中应用四环素作为选择剂成为可能。应用四环素抗性基因的另外一个优点是四环素在大肠杆菌中不降解，因此在在发酵的过程中不需要加入更多的四环素。此外，四环素抗性基因比编码氨卡青霉素抗性基因更适合应用的原因是在临床上四环素更少被用作抗生素给病人使用，因此应用该抗性基因可能会较少地干扰临床抗生素的应用。另外的依照本发明有用的标记基因包括生物杀灭剂特别是抗生素的抗性基因，如卡那霉素、G418(红霉素类似物)，博来霉素，潮霉素，氯霉素或诸如此类。另外的依照本发明有用的标记基因也包括除草剂的抗性基因如有机磷酸盐、二丙氨酸磷酸盐。另外的依照本发明有用的标记基因还包括β-葡糖苷酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)，或诸如此类。本发明应用的特别标记物应是能将被转化的细胞从那些缺乏需导入核苷酸的细胞中挑选出来。用于本发明的载体也可有一个根癌农杆菌复制起点，比如希望将该载体保持在根癌农杆菌以便以后用该系统来转化细胞。在这种情况下，编码目的蛋白(即抗孕蛋白)的核苷酸序列被左和右转化DNA(转化DNA，Ti质粒上能转移到植物基因组中的DNA片段)边缘区域所包围以便促进它向宿主植物细胞的转移。根据文献(Ausubel，supra)中已知的方法，本发明中的表达载体可转染到细菌株比如大肠杆菌以扩增该瞬时表达盒。纯化后的表达盒可被加入到根癌农杆菌并用电脉冲或热休克处理以导入其中的载体，在那里它以一个穿梭载体的形式保留其完整性。根癌农杆菌中的一个辅助Ti质粒可提供将T-DNA从该穿梭质粒中直接转移到植物细胞中所必需的毒性VIR基因。或者，该载体能和肿瘤诱导性(Ti)质粒进行同源重组并将该瞬时表达盒与肿瘤诱导性(Ti)质粒中的转化DNA进行交换。在一个优选的实施例中，本发明提供了一种稳定转化植物细胞的方法，其中被导入植物细胞的DNA构建体可被稳定地整合到染色体。转基因植物本发明提供了转基因植物和植物材料(如叶、果实、根等)，它们的植物细胞可表达一种或更多的在本发明中有用的抗孕蛋白。在一个优选的实施例中，将上述的DNA构建体导入到目的植物细胞，而该基因构建体在转化细胞中的表达可使植物细胞产生抗孕蛋白。将核苷酸导入到植物细胞的方法将基因转移到植物细胞中的方法包括(但不限于此)根癌农杆菌-Ti质粒系统。根癌农杆菌中的肿瘤诱导(Ti)质粒包含有被叫作转化DNA(T-DNA)的质粒DNA片段，它可整合到植物宿主细胞基因组中。首先，构建一个可在大肠杆菌中复制的质粒载体。该质粒含有编码目的蛋白(如抗孕蛋白)的DNA序列并且该DNA序列被转化DNA的边缘序列所包围，这样界定了可被转移到植物细胞并整合到植物基因组的DNA片段的界限。通常一个编码选择性标记物(如编码抗生素如卡那霉素的抗性基因)的基因也被插入到左侧边缘序列(LB)和右侧边缘序列(RB)之间。该基因在转化细胞植物细胞中的表达可提供了阳性选择方法用来对那些包含有整合T-DNA区域的植物细胞或植物进行鉴定。为了随后能将T-DNA转移到植物中，所用的农杆菌株必须包含有一套可诱导性毒性(vir)基因，它对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。上述基因转移系统中的根癌农杆菌是冠状瘿瘤的病原体，冠状瘿瘤是许多双子叶植物和裸子植物的罹患的疾病DeCleene，M.etal.，Bot.Rev.42，389(1976)，它可导致在感染部位的植物组织内形成肿瘤或瘿瘤。该农杆菌杆菌系统的开发使得许多植物组织的转化成为可能[参见，例如Schell，J.等Biotechnology1，175(1983)；Chilton，M-D，ScientificAmerican248，50(1983)。能用这种方式转化的代表性组织包括烟草(Barton，K.etal.，Cell32，1033(1983))；番茄[Fillatti，J.etal，Biotechnology5，726(1987)；sunflowerEverett，N.etal.，Biotechnology5，1201(1987)；棉花[Umbeck，P.etal.，Biotechnology5，263(1987)；油菜籽[Pua，E.etal.，Biotechnology5，815(1987)；马铃薯[FacciottiD.etal.，Biotechnology3，241(1985)；白杨[Pythoud，F.etal.，Biotechnology5，1323(1987)；大豆[Hinchee，M.etal.，Biotechnology6，915(1988)。其它的植物也可用这些方法的常规拓展或改进而得到转化。可选择许多的农杆菌株或质粒构建策略用来对植物的基因转化的优化。例如，根癌农杆菌可能并不是唯一能用的农杆菌株。其它的根癌农杆菌株如发根农杆菌也许更适合于某些用途。发根农杆菌可诱发许多双子叶植物种系的根须的形成，它携带有一个叫做Ri(根诱生)质粒的染色体外元件，它以于根癌农杆菌的Ti(肿瘤诱导)质粒相似的方式起作用。已经开发出与根癌农杆菌转化法相似的发根农杆菌转化法并已成功地用于转化，如苜蓿[SUKHAPINDA，K.etal.，PlantMol.Biol.8，209(1987)。植物组织接种方法随植物种系和农杆菌转化系统的不同而不同。转化马铃薯的方便的方法是叶盘方法，但是农杆菌介导转化的实施可生成一种植物外植体，它能为植物整体的分化和再生作用的启动提供良好来源。在某些情况下可能需要加入辅助组织。其它的方法，比如应用根癌农杆菌的再生原生质体的体外转化也可能被用来获得转化的植物细胞。数个所谓的“直接”基因转移方法已经被用来转化植物和植物组织而不需要用农杆菌来介导，比如从原生质体发生的植物再生作用(Evans，D.A.etal.，HandbookofPlantCellCulture1，124(1983)。当可从原生质体再生成一种植物种系时，可用直接基因转移方法而转化不依赖于根癌农杆菌的应用。在原生质体的直接转化中，可应用化学剂或电场来加强原生质体对外源性基因物质的摄入。该外源性物质于是可被整合到核基因组中。早期的工作是在双子叶植物烟草属中的烟草中进行的，实验表明外源DNA被整合到基因组中并被传递到子代植物中[Paszkowski，J.等EMBOJ，32717(1984)；Potrykus，etal.Mol.Gen.Genet.199169(1985)。也曾用这种方法对单子叶原生质体进行转化例如，小麦属[LorzH.等Mol.Gen.Genet.199178(1985)；黑麦草属(意大利黑麦草)Potrykus，etal.等，Mol.Gen.Genet199，183(1985)。玉米[Rhodes，C.，等Biotechnology5，56(1988)；黑色墨西哥甜玉米[Fromm，M.等Nature319，719(1986).。其它从原生质体再生而来的植物包括稻谷[Abdulah，R.等Biotechnology4，1987(1987)；油菜籽[Kansha，等PlantCellReports5，101(1986)；马铃薯[Tavazza，R.等PlantCellReports5，243(1986)；茄子，Sihachaki，D.等PlantCell，Tissue，OrganCulture11，179(1987)；以及黄瓜[Jia，S-R.，等J.PlantPhysiol.124，393(1986)。用电脉冲处理原生质体可影响将DNA导入到植物原生质体的作用，此时需要将适当的DNA用于这个被称作电穿孔的处理中。用这种方法时，需分离原生质体并将其悬浮在甘露醇溶液中。加入超螺旋或环形质粒。混匀溶液并将其置于室温下400V/cm的电脉冲中少于10到100微秒。此时发生了一种可逆性的生理性细胞膜的裂隙，因此DNA可被吸纳到原生质体内。已有证据显示脂质体融合法也是一种转化植物细胞的方法。应用这种方法时，脂质体的细胞膜与脂质体携带的目的基因集合在一起。当发生膜的融合时，该外源基因因此被转移到原生质体内[Dehayes，A.等EMBOJ.4，2731(1985)。聚乙二醇(PEG)介导的转化已经在N烟草(双子叶植物)核黑麦草(单子叶植物)中被应用过。它是建立在镁离子、聚乙二醇，以及可能还有钙离子之间协同作用的基础之上的用于直接基因转移的化学方法[Negrutiu，R.etal.，PlantMol.Biol.8，363(1987)。或者，还可以用微注射的方法将外源性DNA导入到细胞或原生质体中。用一种做工精细地玻璃针可将质粒DNA溶液直接注射到细胞内。另外开发地用于直接基因转移地方法包括携带DNA的“微弹”、“炮轰”细胞[Klein，T.M.等Nature327，70(1987)。应用这种“生物导向”的方法中，包被有外源性DNA的钨或金颗粒加速冲向目标细胞。在洋葱中至少得到了外源基因的瞬时表达。该方法被用来将DNA导入到悬浮培养的黑色墨西哥甜玉米细胞核玉米的未成熟胚胎以及大豆的原生质体中[Klein，T.M.etal.，Biotechnology6，559(1988)。“用微弹炮轰”方法已经得到稳定转化的玉蜀黍，烟草，大麦，燕麦，小麦，稻，胡萝卜，香蕉和大豆培养物。稳定转化的细胞也可用这种方法而得到再生和复原(McCabe，D.E.等Biotechnology6，923(1988))。按照下述方法转化阿布属植物的花以生产转化种子。农杆菌通过真空渗透进发育中的花，由此生成的种子以抗性标记物筛选外源性基因的表达。雄蕊/花粉，子房/卵等被转化，如果此时已发生了受精作用，则甚至发育中的接合体也能被转化。这种方法曾被用来将含有一个在At2S-2种子启动子转录控制下的rep基因的基因构建体转化进阿布菌属植物中。转化后，用传统的方法挑选或筛选转化的细胞或植物组织。可用已知的方法使包含有上述嵌合DNA序列的植物组织的转化细胞再生，这些方法包括那些上述参考文献中描述的方法。那些最容易用这些方法再生的植物种系(因而在本发明中属首选)包括(但不限于此)玉蜀黍，向日葵，油菜籽，苜蓿，烟草，棉花，紫花苜蓿，稻谷，马铃薯，茄子，黄瓜和大豆。筛选再生的植物用于下述方法的转化。筛选再生植物的子代并将持续表达整合DNA序列的植物挑选出来以生成改善的植物合种子系列。可用许多的技术包括经典繁殖技术、原生质体融合、核转移技术核染色体转移技术来将DNA序列转移到其它基因序列中。依照本发明有用的植物、细胞和种子可用于本发明实践的植物包括双子叶植物核单子叶植物。这些植物包括(但不限于此)烟草，胡萝卜，菠菜，胡椒粉，马铃薯，蕃茄，苹果，小麦，裸麦，大豆，稻，玉蜀黍，玉黍蜀，浆果如草莓，复盆子，紫花苜蓿和香蕉。因为作为人类食物或动物饲料成分的许多可食用植物是双子叶植物，所以本发明常常应用的是双子叶植物。虽然单子叶植物的转化也特别适用于生产某些种类用作动物饲料的谷物。在人类的免疫抗孕中特别有优势的做法是在汁液中生成抗孕蛋白，如蕃茄，大豆和胡萝卜的汁，或牛奶，这样容易给药。依照本发明从这些植物疫苗中获得的细胞或种子也是有用的。用上述的载体转化的转基因植物是本发明的另一个方面。特别实用于用这些载体转化的植物包括香蕉，蕃茄，马铃薯，胡萝卜，紫花苜蓿，苜蓿，玉蜀黍和烟草。马铃薯品种FL1607(″FritoLay1607″)以及Desiree，番茄品种TanksleyTA234TM2R是特别适合选用的品种，这些品种均被用上述的方法以二元载体转化过。在这些转化过的品种中，Desiree唯一被商品化的品种。其它的品种可从下列地址中获得Frito-Lay(Rhinelander，威斯康星)和SteveTanksley(科内尔大学，植物繁殖系)。番茄之所以被用作外源基因表达的模型系统是因为它容易被基因转化，而且是因为有果实特异性的、成熟依赖性启动子来控制外源基因的表达(Giovannoni等1989)。E8启动子曾被用来介导突变型番茄果实中高水平聚半乳糖醛酸酶蛋白的表达(Giovannoni等1989)以及野生型番茄果实中莫尼糖蛋白的表达(Penarrubia等1992)。该研究领域中的研究人员对植物细胞的悬浮培养早已熟悉并利用。植物细胞培养之所以被用作表达外源型蛋白的模型系统是因为它的细胞转化、生长核蛋白生成速度比用整体植物系统的方法快。植物细胞悬浮培养物可在液体中生长，也可转移到固体培养基上产生植物胼胝体。用于本发明中所描述目的的细胞悬浮培养物的普通例子包括(但不限于此)胡萝卜、烟草(如NT-1或BY-1细胞系)，玉蜀黍。转化植物材料的检测本发明提供的用于检测编码抗孕蛋白的核苷酸序列和抗孕蛋白本身的方法包括(但不限于此)DNA和RNA印迹分析、基于PCR的检测方法、以及依照本发明检测目的蛋白的免疫学方法。依照本发明这些方法可用来确定编码抗孕蛋白特别是黏膜靶蛋白核酸序列的存在，也可用来确定抗孕蛋白以及黏膜靶蛋白本身的表达。目的核酸序列的检测1.DNA印记分析DNA印记分析可用来从PCR扩增产物中或从总基因组DNA受检标本中通过一个非基于PCR的方法检测目的核酸序列的存在。DNA印记分析的方法在该行业中已经是熟悉的(Ausubeletal.，supra，Sambrooketal.，1989，MolecularCloning.ALaboratoryManual.，2ndEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。该技术包括将DNA片段从电泳胶中转移到一种膜支持物上并让DNA片段固定在那里。因此生成的膜携带有电泳胶中DNA序列带型的半永久型复制品。根据下列的方法来进行DNA印记分析。依照本发明中的方法转化植物的基因组DNA[(5-20PG)，用适当的限制性内切酶消化，在TAE缓冲液中用0.6-1.0％的琼脂糖凝胶分离消化后的核酸产物，然后用文献中(Ausubel等，supra，Sambrook等，supra)熟悉的方法将DNA转移到商品化的尼龙或硝酸纤维素膜上(e.g.Hybond-N膜，Amersham，阿林顿高度，IL)。转移并预杂交后，将膜放置于杂交液体中用一个标记的探针进行杂交(如在一定的严谨度条件下，5XSSC，5XDENHARDT溶液，1％SDS)，65℃。或者，高严谨度杂交克在68℃或在一个含低盐浓度(如0.1XSSC)的杂交缓冲液中进行。根据文献中已知的参数可在必要时应用不同的杂交条件。杂交后，室温下在2XSSC/0.1％SDS以及65℃在0.2XSSC/0.1％SDS的溶液中漂洗杂交膜，并将杂交膜暴光。依照不同数量的背景信号可应用不同严谨度的漂洗缓冲液体(Ausubel等，supra)。对核酸探针-目的核酸的杂交物的检测包括首先将核酸探针与DNA目标杂交，其中的探针也上述的DNA重构体的核酸序列的一部分是互补的。探针可被标记上放射活性物质或以共价键连接一种酶，而该共价键连接不会干扰杂交的特异性。由此生成的植物DNA和探针的杂交物能被检测到。标记探针的方法包括随机寡核苷酸引物合成法、缺口翻译法、激酶反应法活多聚酶链反应法(Ausubel等，supra)。或者，可通过非同位素的方法检测杂交物，非同位素标记探针可通过加入生物素或地高辛，荧光基团、化学发光基团(如dioxetane，特别室触发的dioxetanes)，酶或抗体。通常，非同位素标记探针通过荧光或酶的方法来检测。放射标记的探针-目标核酸组合物的检测可通过将组合物与未结合的探针分离以及通过用放射自显影或闪烁计数的方法检测组合物的水平进行。如果该探针与酶共价连接，则该酶-探针-共轭-目标核酸组合物将被从未结合探针-酶结合物中分离出来，加入适当的底物用于酶的检测。通过观察颜色和活荧光输出的变化来检测酶活性，这可提高敏感性。作为杂交探针的核酸探针-酶结合物(其中的酶是碱性磷酸酶)的制备和应用的例子在下列文献中有描述(Jablonski等，1986，Nuc.AcidsRes.，146115)。二步标记扩增法在文献中有记载。这些方法均是建立在这样的原理基础之上一种小的配基(比如洋地黄毒甙配基，生物素，或诸如此类)被连接到一个能特异性地与目的基因(即编码一种抗孕蛋白活或其中一部分的基因)结合地核酸探针上。依照探针的二步标记扩增法，连接到核酸探针上的小配基可用一种抗体-酶的结合物特异性地识别。例如，洋地黄毒甙配基被连接到核酸探针并且用一个抗体-碱性磷酸酶共轭物来检测杂交物地存在，其中地碱性磷酸酶可与化学发光底物反应。制备核酸探针-小配基共轭物地方法参见(Martin等，1990，BioTechniques，9762)。或者，该小配基也可被一种能特异性地配位给第一个配基的第二个配基-酶共轭物所识别。有关这种小配基相互反应方式的一个熟悉例子是生物素-抗生物素蛋白间的相互反应。标记核酸探针的方法以及它们在生物素-抗生物素检测系统的应用被描述在下列文献中Rigby等，1977，J.Mol.Biol.，113237和Nguyen等，1992，BioTechniques，13116)。杂交物的基本检测方法的变化在文献中已经有所记载，其中包括了将需要检测的杂交物与外源性材料加快分离的修改以及应用来自标记部分的信号的修改。一系列有关的这些类型的方法学修改被综述在下列文献Matthews&Kricka，1988，Anal.BIOCHEM.，1691；Landegren等，1988，Science，242229；Mittlin，1989，ClinicalChem.351819；美国专利No.4,868,105，以及EPO出版No.225,807.2.RNA印记分析RNA印记的方法在文献中有很好的记载。该方法包括将RNA从电泳凝胶中转移到一种膜支持物上，以便检测RNA制备品中的特定序列。根据下列方法进行RNA印记杂交。在1X3-[N-吗啉代丙磺酸缓冲液的琼脂糖/甲醛凝胶上将从用上述的DNA重构体转化的植物组织中获得的RNA标本(通过加入1X3-[N-吗啉代丙磺酸缓冲液、甲醛以及甲酰胺而制备]。在用溴乙锭染色并在紫外光下观察以确定RNA完整性后，RNA通过0.05MNaOH/1.5MNaCl溶液处理水解，然后在溶液0.5MTris-Cl(pH7.4)/1.5MNaCl孵育。用文献(Ausubel等，supra，Sambrook等，supra)中熟知的方法将RNA转移到商品化的尼龙膜或硝酸纤维素膜上(e.g.Hybond-N膜，Amersham，阿林顿高度公司，IL)。转移并封膜后，杂交膜用标记探针在杂交液(比如50％甲酰胺/2.5％Denhardt′s/100-200mg变性鲑鱼精子DNA/0.1％SDS/5XSSPE)42℃中杂交。根据有关文献，杂交条件在必要时可有变化(Ausubel等，supra和Sambrook等，supra.)。杂交后，杂交膜依次在下列条件下漂洗，室温下2XSSC/0.1％SDS，42℃1XSSC/0.1％SDS，65℃0.2XSSC/0.1％SDS，然后将膜暴光。随背景信号数量的不同，漂洗缓冲液的严谨度可不同。3.聚合酶链反应(PCR)通过用聚合酶链反应从基因组DNA或其它自然来源的DNA扩增本发明中的目的核苷酸序列(比如编码抗孕蛋白的核酸序列)。熟练本专业的人对聚合酶链反应上熟悉的。聚合酶链反应提供了一种快速扩增特定DNA序列的方法，即通过用一种由耐热DNA依赖性多聚酶催化的多个循环的DNA复制而对有关的目标序列进行扩增。聚合酶链反应需要下列材料需要扩增的核酸模板、两条包绕所需扩增序列的单链寡核苷酸引物、一种多聚酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和盐。在本专业中PCR是非常熟悉的方法，在下列文献中有描述Mullis和Faloona，1987，MethodsEnzymol.，155335，。在这里有相应的参考文献。进行聚合酶链反应需要模板DNA(至少1fg；更常见的是，1-1000ng)以及至少25的寡聚核苷酸引物。常规的反应混合物包括2μl的DNA，25pmol的寡聚核苷酸引物，2.5μl的10X聚合酶链反应缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster，CA)，0.4μl的1.25μMdNTP，0.15μl(或2.5单位)的TaqDNA多聚酶(Perkin-Elmer，Foster，CA)以及去离子水，使反应总体积为25μl。用一个程序化的热循环器进行聚合酶链反应。聚合酶链反应循环的每一步的时间长度和温度，以及循环的次数需根据反应的严禁度要求调整。退火温度和时间是由预期的引物退火到模板上的效率以及能耐受的错配程度。中等熟练本专业的人就有能力对引物退火条件进行优化。所用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子的初始变性的条件一般是92℃到99℃4分钟，然后是20-40个循环中的15秒到1分钟(94-99℃)的变性过程，退火(退火稳定以上述的方法确定，时间为1-2分钟)以及延伸(72℃，时间为1分钟)。最后一步延伸常常在72℃进行4分钟，并且可接着一个不确定的步骤(0-24小时，4℃)。依照本发明，可用数个技术对PCR产物进行定量检测而不用电泳。其中的一种技术，有商品化的试剂盒如TAQMANTM(Perkin-Elmer，Foster，CA)，用的是转录特异性反义探针。该探针能特异性地识别PCR产物(如一种目的基因来源的核苷酸片段)，用淬灭剂和能配位给寡聚核苷酸5′端的荧光报道探针制备该探针。不同的荧光标记物被连接到不同的报道探针上，可在一个反应体系中同时检测两种PCR产物。当TaqDNA聚合酶被激活时，它可以其5′-至-3′核酸裂解活性将连接到模板上的探针的荧光报道分子裂解。在无淬灭剂存在的情况下，该报道分子开始发荧光。报道分子中颜色的变化与每一种特定产物的数目成比例并能用荧光计检测到。PCR反应可在96孔板上进行，因此可同时处理和检测多个标本。[TAQMANTM系统有另外的优点不需要凝胶电泳，而且与一条标准曲线一起应用时，可定量检测。目的蛋白序列的检测1.抗体的制备本发明中的抗孕蛋白的特异性抗体对于蛋白的纯化和检测是有用的。对于抗体，我们包括了应用那些抗体的不同结合区域的构建体或其它的抗体修饰。因此，在本发明中有用的抗体可包含整个抗体，抗体片段、多功能抗体聚合体或一般而言的一种抗体含有一种或更多特异性结合部位的一种物质。抗体片段可以是如Fv、Fab或F(ab′)2片段或其衍生物，如单链Fv片段。抗体或抗体片段可以是非重组的或重组的或人源化的。抗体可有一种免疫球蛋白同型，如IgG，IgM等等。此外，可以在适当的地方应用免疫球蛋白或其中的一部分的聚合物、聚合体、衍生物和共轭物。虽然在本发明中目的基因的可用于诱导抗体产生的蛋白产物(或其中的片段或寡聚肽)不一定需要生物活性，但它必须具有抗原性。用于诱导特异性抗体的寡聚肽需有至少由5个氨基酸组成的氨基酸序列，并且优选是10个氨基酸。优选它们自然蛋白的一个区域相同，并可含有一个自然存在的小分子的整个氨基酸序列。与本发明中的抗孕蛋白的种系特异性表位相对应的氨基酸短延伸片段可与来自另一种蛋白(即一种黏膜靶蛋白)如LT-B的氨基酸相融合，由此产生的是针对该嵌合分子的抗体。可应用本专业种熟知的方法来生产针对本发明种的目的蛋白的抗体。在生产抗体的过程种，通过注射本发明的目的基因的蛋白产物免疫不同的宿主山羊，兔子，大鼠，小鼠等。随宿主种系的不同，可应用不同的佐剂来提高免疫反应。那样的佐剂包括但不限于氟雷氏佐剂、矿物胶如氢氧化铝以及表面激活物如溶血卵磷脂、聚醚多醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、锁眼(虫戚)形血蓝蛋白和二硝基苯酚。卡介苗以及小棒状杆菌也是潜在有用的人类佐剂。a.多克隆抗体抗原可与一种传统的载体共轭结合以提高其免疫源性，针对该肽-载体共轭结合物的抗血清会增加。实施有关肽与载体的结合及其免疫在下列文献种有描述(DYMECKI等，1992，J.Biol.Chem.，2674815)。可用酶联免疫吸附试验(下述)或者用斑点杂交(Boersma和VanLeeuwen，1994，J.Neurosci.Methods，51317)的方法对该抗血清进行针对蛋白抗原的效价滴定。同时，该抗血清也可在按照文献制备的组织切片中应用。一种有用的抗血清在酶联免疫吸附试验种可与适当的肽发生强烈的反应，例如，按照文献Greenetal.，1982，Cell，28477中介绍的方法。b.单克隆抗体制备单克隆抗体的方法已被很好地掌握，单克隆抗体可用一种侯选抗原来制备，该侯选抗原地表达水平将被检测或者它将被灭活活亲和纯化，优选是与一种载体结合，文献Amheiteretal.，1981，NATURE，294；278.中有描述。单克隆抗体通常是从淋巴瘤组织培养物中或被注射了淋巴瘤组织地动物地腹水中获得。可通过筛选产生单克隆抗体地杂交瘤(或多克隆血清)以获得特异性结合目标蛋白地抗体。2.抗体检测方法特别适合选用的免疫学检测依赖于单克隆或多克隆抗体的应用，具体包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印记、免疫组化和免疫共沉淀(参见Humason，G.L.，1979，AnimalTissueTechniques，4thed.W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，CA；Voller，1978，DiagnosticHorizons，2:1，MicrobiologicalAssociatesQuarterlyPublication，Walkersville，MD；Volleretal.，1978，J.Clin.Pathol.，31507；U.S.ReissuePat.No.31,006；UKPatent2,019,408；Butler，1981，MethodsEnzymol.，73482；Maggio，E.(ed.)，1980，EnzymeImmunoassay，CRCPress，BocaRaton，FL)orradioimmunoassays(RIA)(Weintraub，B.，Principlesofradioimmunoassays，SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques，TheEndocrineSociety，March1986，pp.1-5，46-49and68-78)。依照本发明分析植物中目的蛋白的出现与否，可应用免疫组化技术。本专业的熟练人员会清楚的知道本发明中所用的抗体分子需被标记，以目标蛋白更容易被检测到。本专业的熟练人员会很熟悉标记抗体分子的技术(参见HarlowandLane，1989，Antibodies，ColdSpringHarborLaboratory)。转基因植物材料的剂量和给药本发明提供了一种方法，通过以表达一种抗孕蛋白的转基因植物材料饲喂动物在动物抗孕，其中转基因植物材料的给药诱发了一种针对该抗孕蛋白的黏膜免疫反应。没有限制于某一种特定的理论，本发明依赖于转基因植物材料在动物中的给药，因此，由该转基因植物细胞表达的抗孕蛋白与一种或多种被饲喂动物的黏膜表面接触。当抗孕蛋白(抗原)被覆盖在肠相关淋巴细胞组织和支气管相关的淋巴组织的M细胞所吸纳时，伴随着针对该抗孕蛋白的分泌型IgA升高的非特异性黏膜免疫反应在体内所有的分泌组织中被诱发(Cebra等，supra；Bienenstock等，supra；Weinz-Carrington等，supra；McCaμghan等，supra)。因此口腔给药是刺激非特异性黏膜免疫反应的一个优选的给药途径，此外，它可在口腔和胃肠道内局部刺激分泌型免疫反应。在一个优先的实施例中，用本发明中的方法制备的抗孕蛋白通过口腔饲喂食品的方法给药，该食品是由表达抗孕蛋白的转基因植物活植物细胞培养物制备的。在一个实施例中，本发明中转基因植物的可食用部分以饮食成分的方式饲喂动物，在这个过程中，抗孕蛋白同时也被饲喂。在一个实施例中，转基因材料以生料的形式饲喂动物，虽然其中的植物材料可能通过切割、剁碎、切碎、做菜泥的方式处理过，或者减小转基因植物材料成更小的片块以便促进动物的吸收，比如将转基因草料处理成青贮饲料以便促进家畜的吸收。可以生料的形式饲喂的转基因植物材料包括(但不限于此)水果，树叶，茎，根，块茎和种子。在进一步的实施例中，其中的转基因植物材料是草或谷物，可让需要饲喂抗孕蛋白的动物在其成长的环境中自己进食植物材料(例如，在牛吃草的田野里种植转基因植物，这样通过牛自己吃草的方式被饲喂了抗孕蛋白)。在另外的实施例中，在给动物饲喂前，可用另外的方式处理转基因植物(例如，剁碎或切割以外的方法)。转基因植物材料也可通过本专业熟练人员熟悉的方法处理，在那种情况下，本发明中的转基因植物材料被精制，以便应用于口腔、鼻腔或吸入给药。植物材料也可通过用制药学上可接受并与抗原相容的赋形剂的乳化作用来进行处理。适当的赋形剂包括(但不限于此)佐剂、缓冲液、糖、抗氧化剂、稳定剂或抗原粉末；例如，抗坏血酸钠盐、Quillaja提取物、水、盐水、右旋糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇或诸如此类，以及其中的组合物。此外，如果需要的话，该疫苗也可含有一定数量的辅助物质如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、或可增强该疫苗效应的佐剂。而且，也可将转基因植物材料与非转基因植物材料甚至非植物材料混合以促进动物对它的吸收。例如，转基因玉米可与其它的蔬菜混合，或者转基因豆类植物也可与其它的成分如香料活其它的调味品混合做成诸如大豆馅饼、大豆冰淇淋、或豆奶。另外的例子，将转基因烟草培养物过滤并通过下列方法(但不限于此)混合、喷雾、或涂覆的方式加入到常规的饲料中。此外，转基因植物材料也可经干燥后，以粉末的形式单独饲喂，或悬浮在可接受的液体如汁液或水中饲喂。在进一步的实施例中，可对植物材料进行处理以便将植物材料和/或细胞合并到制药学上可以接受的乳膏、软膏、油膏或栓剂。因此，用制药学可接受材料携带的转基因植物材料通过将植物材料与黏膜表面包括(但不限于此)口腔、鼻腔、直肠或阴道接触的方式而被饲喂给动物。另外的可与本发明中的转基因植物材料接触的黏膜表面包括(但不限于此)支气管的内表面、鼓室腔的黏膜层、结肠的内黏膜层、输精管的内层、食管的内层、小肠的黏膜层、喉的黏膜层、舌的黏膜层、垂体膜、口腔的黏膜层、咽的黏膜层、气管的黏膜层、咽鼓管的黏膜、输卵管的黏膜层、输尿管的黏膜层尿道的黏膜层、子宫内膜阴道的黏膜层、胃的黏膜层、膀胱的内层以及精囊的黏膜层。剂量一定剂量的本发明中的植物材料可以数个上述不同的形式(例如生料，粉末等)饲喂动物。在一个优选的实施例中，在本发明中有用的转基因植物材料需表达至少8μg的抗孕蛋白或抗孕蛋白与黏膜靶蛋白的融合蛋白/克干燥植物材料，较好是10μg，优选是至少表达20μg的抗孕蛋白/克干燥植物材料。在一个实施例中，圈养在控制性环境下的动物，比如实验室、狗舍、或私人房屋以及圈养在野外的动物(但其食物摄入是受控制的，入家畜)，每周饲喂转基因植物材料至少12周(即在第0，7，14，21，28，35，42，49，56，63，70，77天饲喂)。每次饲喂时，动物接受的转基因植物材料在4到100000克之间，随动物的个体大小以及受处理动物的平均食物摄入量不同而变化(如牛的平均食物消耗量是90磅/天)。在另外的一个实施例中，上述的俘获的动物群体日常地饲喂转基因植物材料(如第0，1，2，3，4，5，6天)，以达到基本的免疫效果，然后以规则的增强免疫的计划表(比如每个月)来指导转基因植物材料的饲喂，以维持足够的抗孕免疫状态。在另外的一个实施例中，转基因植物材料的注射被用来增加抗孕性制剂的胃肠外给药。例如，一种抗孕性制剂(通过相应的系统入植物、酵母菌、或哺乳动物细胞生成)可通过兽医在动物的性成熟的早期注射给药，并按照一个规则的时间表饲喂上述的转基因植物材料来源的规定的抗孕性饲料而加强给药(如每月)。在人类应用的另外一个实施例中，转基因植物材料可被做成胶囊或片剂并加入到一种自服药物的用药方案中，其中的抗孕性和非抗孕性片剂或胶囊被包装使得每天给药或不给药交替发生。在另一个实施例中，野生动物的转基因植物材料的饲喂是通过将食物放在动物的自然生活环境中以食物饵料的形式进行的。熟练从事野生动物种群控制的专业人士熟知饵料投放以及确定每次用药的种群效应的优选方法，他们可确定每一种目标种系的优选的特异性饵料饲喂方案。或者，表达本发明种的抗孕蛋白的转基因植物可在将被饲喂该抗孕蛋白的动物生活的野外区域生长。可能需要用上述的方法检测植物种表达的抗孕蛋白的数量。在一个优选的实施例种，生长在野外的转基因植物可表达至少8μg的抗孕蛋白或抗孕蛋白与黏膜靶蛋白的融合蛋白/每克干燥植物材料，较好是至少10μg，优选是至少20μg的抗孕蛋白/克干燥植物材料。在这些条件下，野生动物被随意地饲喂转基因植物材料。佐剂在本专业地人员很好地了解到，将佐剂添加到一种免疫原中可增强免疫反应(ColiganLGetal.eds.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995)。数十年来弗氏完全佐剂是免疫佐剂中的中流砥柱。虽然常常是有效地，但该佐剂可诱发不良副反应，因此限制了它的应用和其它替代品地问世。其它可选用的佐剂包括(但不限于此)Ribi佐剂系统(RAS)，那是一个含无毒化的内毒素(MPL)和分枝杆菌细胞壁成分(TDW，CWS)、2％角鲨烷的油水乳化物(RibiImmunochemResearch，Inc.Hamilton，Montana)。TiterMax，一种稳定、可代谢的油水佐剂(CYTRX公司，AtlantaNorcross，乔治亚州)；兴泰克佐剂配方(SAF)3，是用吐温80和多聚氧乙烯/多聚氧丙烯共聚物稳定的油水乳化剂L121(Chiron公司，Emeryville，加利福尼亚)。弗氏不完全佐剂(FIA)，是弗氏完全佐剂的一种更少发生炎症反应的替代品(Novavax公司，哥伦比亚，马里兰洲)；明矾-氢氧化铝〔氢氧化物，是一种广泛应用的佐剂，特别是在商品化的产品中如疫苗(商品化的铝胶，精确化学和科学公司，Westbury，纽约)；SuperCarrier(兴泰克研究，PaloAlto，加州)；Elvax40W(DuPont化学品公司.Wilmington，DE)；Montanide，amanide油酸盐组合物(ISASeppicFairfield，NJ)；硝化纤维吸收蛋白(NilssonBO，LarssonA.Inertcarriersforimmunization.Res.Immunol.143553-557，1992)；Gerbu佐剂，(C-CBiotech，Poway，加利福尼亚)；免疫刺激组合物(ISCOMS)(ColiganLG等.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995).许多年来，皂甙佐剂被用于胃肠外免疫(产品包括″QuilA″或″QS-21″)。皂甙是糖甙组合物，以次级代谢物的形式生成。它们广泛分布在高等植物，也表达在棘皮门的海洋无脊椎动物(ApSimon等，Stud.Org.Chem.17273-286(1984)).。因其有抗微生物的活性，植物皂甙是抵抗微生物特别是真菌的有效化学防御物(Price等，CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr.2627-135(1987))。皂甙的化学结构赋予其广泛的药学和生物学活性，包括一些强有效的免疫学活性。此外，该组合物家族的成员具有发泡的特性(一种鉴别特征)，表面活性剂特性(是其具有溶血活性的原因)、结合胆固醇、真菌毒性、软体动物毒性、抗孕性、生长迟滞作用、祛痰作用、抗炎、止痛、抗滤过性病原体、心脏血管、酶抑制以及抗肿瘤活性Hostettmann，K.，etal.，MethodsPlantbiochem.7435-471(1991)；Lacaille-Dubois，M.A.&Wagner，H.，Phytomedicine2363-386(1996)；Price，K.。R.，等，CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr.2627-135(1987)。此外，皂甙溶液也曾被用作去污剂，可增加多肽在黏膜的递送。例如文献Pillion，D.J.etal.，Invest.Opthal.Vis.Sci.323021-27(1991)揭示含有1％来自Gypsophilla麦的未纯化皂甙溶液的胰岛素眼药水的给药可导致大鼠发生快速和可再生的血中D-葡萄糖水平的减少。而不含有皂甙的胰岛素滴眼液是无效的。日文摘要No.JP62126135(1987)记载了应用含有甾体或三萜结构的皂甙的生长激素释放因子的经鼻给药，也可参见文献，Chiou，G.C.Y.etal.，J.Pharm.Sci.78815-818(1989)；以及ChiouG.C.Y.等，J.Ocul.Pharm.581-91(1989)，它们揭示了含有皂甙(获自Sigma化学品公司)的胰岛素滴眼液给药后的胰岛素的全身分布。皂甙所具有的去污剂的特性也可增加生物膜的通透性，因此增强黏膜免疫反应。来自Quillaja肥皂草属Molina树(Quillajasaponins)的皂甙佐剂具有良好化学和免疫学特性的产品(Dalsgaard，K.Arch.GesamteVirusforsch.44243(1974)；Dalsgaard，K.，ActaVet.Scand.19(Suppl.69)1(1978)；Higuchi，R.等，Phytochemistry26229(1987)；同前.262357(1987)；同前.271168(1988)；Kensil，C.等，J.Immunol.146431(1991)；Kensil等，U.S.Pat.No.5,057,540(1991)；Kensil等，Vaccines9235(1992)；Bomford，R.等，Vaccines10572(1992)；和Kensil，C.等，美国专利5,273,965(1993))。皂甙也存在于其它的植物如大豆(AndrzejewskaE.，1984，RoczPanstwZaklHig，35135-8)。Quillaja皂甙被发现是大约20种结构密切相关的、差别非常小的三萜糖甙化合物的混合物，(Higuchi，R.等，Phytochemistry26229(1987)；同前.，262357(1987)；同前，271169(1988)；Kensil等，美国专利No.5,057,540(1991)；Kensil等，Vaccines9235(1992))，使得要分离它们非常的困难。QUILLIAJA皂甙提取物已经商品化(如Garuda国际公司，LemonCove，加洲93244)美国专利Nos5,273,965and5,650,398记录了一种粗制的皂甙提取物而美国专利No.5,057,540记录了一种大体上纯化的皂甙提取物。不管是粗制的皂甙还是纯化的皂甙提取物的加工过程都包括了用色谱法从组合物种纯化皂甙。依照本发明有用的皂甙佐剂包括粗制的和纯化的皂甙提取物(Garuda国际公司.LemonCove，加洲93244)。有用的皂甙佐剂也包括含有皂甙的植物的一部分(如叶，根，水果或其它的部份)或经过加工的植物。在一个优选的实施例中，皂甙佐剂是与转基因植物材料一起经口饲喂的。免疫检测本发明提供了给动物饲喂一种抗孕蛋白后诱发动物产生针对该抗孕蛋白的黏膜免疫反应。在一个优选的实施例种，给动物饲喂含有本发明中的抗孕蛋白的转基因植物后，检测动物以确定是否诱发了针对该抗孕蛋白的黏膜免疫反应。动物针对该抗孕蛋白的免疫反应的检测是在饲喂动物转基因植物材料后的某一时间点进行的。以下描述的是透明带蛋白的评估，但是，这些方法也可用来评估针对下述抗孕蛋白的动物免疫状态。在一个实施例中，本专业的熟练人员可通过测定动物针对透明带蛋白的免疫状态来确定该动物是否被免疫。这种评估可通过测定如全血、血清、尿、唾液、泪液等标本中的透明带结合抗体的效价来进行。优选是应用酶联免疫吸附试验(″ELISA″)来达到该目的，它能检测透明带免疫原或其等效物的抗体(Drell，等，Biol.Reprod.30445(1984)；酶联免疫吸附试验和其它的固相免疫检测法(Kemeny，D.M.等，Eds.)，JohnWiley&Sons，N.Y.(1988)，此处综合参考文献)。从众所周知的免疫测定法(也叫做″两点″或″夹心″检测)的原理来理解，免疫测定法包括“前向”、“同时”以及“反向”测定(Fackrell，J.Clin.Immunoassay8213-219(1985)；Yolken，R.H.，Rev.Infect.Dis.435(1982)；Collins，W.P.，InAlternativeImmunoassay.JohnWiley&Sons，N.Y.(1985)；Ngo，T.T.等，InEnzymeMediatedImmunoassay，PlenumPress，N.Y.(1985))。例如，在“前向”检测法中，透明带抗原被结合到固相支持物上(比如微量滴定盘，试管，微量滴定法，等)，然后在一定的条件下与需要检测抗透明带蛋白抗体的标本首先相接触，以形成一种二元固相透明带蛋白-抗体组合物。孵育和漂洗后，该支持物被放置在与一定量的标记透明带抗原(它起着″报道分子的作用″)接触。第二次孵育后，标记的透明带蛋白抗原通过与未标记的抗体而与被固定的透明带蛋白形成组合物，第二次漂洗该固相支持物以除去未反应的标记透明带蛋白抗原。这种类型的前向夹心检测是一种检测抗透明带蛋白抗体是否存在简单的“是”/“否”检测法，通过将滞留的标记透明带蛋白抗原的数量与含有已知数量的抗透明带抗体的标准品相比较而得到定量的结果。“两点”或“夹心”检测法在下列文献中有描述Wide，RadioimmuneAssayMethod，(Kirkhametal.，Ed.)，E.&S.Livingstone，Edinburgh，pp.199-206(1970)。在一优选的实施例中，前向酶联免疫吸附试验可被用来检测黏膜免疫反应。该检测按上述的方法实施，有一些修改，即与需要检测黏膜免疫球蛋白的标本孵育后，固相支持物与标记的抗-IgA抗体相接触，标记的抗-IgA抗体起着检测IgA是否出现在从动物身上获得的标本的指示剂作用。在一种“同步”检测法中，在单次的孵育步骤中，结合的透明膜蛋白以及标记的透明膜蛋白二者同时加入到需要检测的标本中。孵育完成后，漂洗固相支持物以除去残留的液体标本以及没有形成组合物的标记抗体。然后，与固相支持物相连的标记抗体的检测与传统的“前向”夹心检测法中的检测方法是一样的。在“反向”检测法中，标记透明带蛋白的溶液与标本一起孵育，然后，该反应体系与预先已结合了未标记的透明带蛋白的固相支持物接触。第二次孵育后，该固相支持物以传统的方式漂洗，以清除残留的受检标本以及未反应的标记透明带蛋白溶液。抗体效价的确定方法与“同步”和“前向”检测法是一样的。在一个优选的实施例中，本发明中的酶联免疫吸附试验使用的是单克隆抗体。优选是，那样的抗体按照上述的方法，通过免疫异种动物(例如，小鼠、兔、大鼠等)而生成后，收集动物的脾脏白细胞，并以上述的方式将它们与适当的骨髓瘤细胞相融合。虽然免疫测定法是根据选定的固相支持物来描述的，可应用的固相支持物是多种多样的。适当的固相支持物是由诸如玻璃、纸、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶以及自然的和改良的纤维素，聚丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐或磁铁矿等不同的材料组成的。固相支持物的性质可在一定程度上是可溶性的、或者如本发明中是不可溶的。固相支持物材料需要有适当的结构构型，以便透明带蛋白分子可结合到抗体上。因此，支持物的构型可以是球形的，比如在圆珠形，或圆柱的，正如在试管的内表面，或柱状物的外表面。或者，其表面也可以象床单或测试条一样的平。本专业的熟练人员会注意许多其它的适合结合单克隆抗体的载体，或者能通过常规实验的应用探索新的用法。在进一步的实施例中，也可通过免疫组化的方法来检测被饲喂了本发明中的转基因植物材料动物的免疫状态。简单的说，在用上述的饲喂方法给动物饲喂了转基因植物后，雌性动物被处死，切取其卵巢。在卵子从卵巢释放后，如果在输卵管里发生了受精作用，优选能在卵巢的卵子上发现有针对抗孕蛋白的抗体的表达。从动物中取出后，卵巢被做成冰冻切片。切片用本专业熟悉的固定剂固定，这些固定剂包括(但不限于此)福尔马林、丙酮、聚甲醛以及戊二醛。然后漂洗切片并与抗体孵育，这些抗体可与动物对抗孕蛋白的免疫反应中升高的抗体相结合。切片再与一种第二抗体一起孵育，该抗体含有一种报道分子(如荧光染料)，然后在显微镜下检查。如能鉴定出动物中针对被饲喂的转基因植物表达的抗孕蛋白的抗体的存在，则表明动物发生了针对该抗孕蛋白的免疫反应。例如，如果将本发明中的转基因植物材料饲喂给小鼠，可通过下列步骤来检测针对该植物表达的抗孕蛋白的黏膜免疫反应，获得小鼠卵巢的组织切片，用针对小鼠免疫球蛋白的k链的抗体处理该组织切片，抗-鼠k链抗体的定位可通过用与报道分子如荧光染料相结合的第二抗体处理组织切片而观察到。然后在显观察下观察组织切片，以对标记抗体进行视觉定位，抗体标记的图象可用一个本专业熟练人员所熟知的形态测量学计算机软件来进行定量，这样的软件例子“NIHImage”美国国立卫生研究所，Bethesda，MD。该定量资料需要与来自没有用本发明中的抗孕蛋白处理小鼠的类似的抗体标记资料作统计学比较。如两组动物间存在有统计学意义的差异，则表明小鼠可发生针对该抗孕蛋白的免疫反应，其中统计检验中的P值至少是＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005，0.001，0.0005，优选是＜0.0001。抗孕效应的测定在最合适的实施例中，本发明中饲喂动物的抗孕蛋白的抗孕效应是通过记数按照本发明中的方法饲喂了转基因植物材料的雌性动物在每个生育周期中所产幼仔的数量来评估。例如，给小数饲喂5至6周的转基因植物材料后，单个的雌性小鼠与一只雄性小鼠放在一个笼子里。然后雄性小鼠在10到20天内被移走，每天观察雌性小鼠产幼仔的情况。通过观察饲喂后所产幼仔数量的减少来评估该抗孕蛋白的抗孕效应。例如，对于平均每窝的产仔数量为3或更多的动物种系(比如小鼠)来说，如每窝的幼仔数的减少是10％到100％，30％到90％，或60％到80％，才可认为该抗孕蛋白是有效的。对于平均每窝的产仔数量为1或2的动物种系(比如白尾鹿)来说，每窝的幼仔数的至少减少是50％优选是100％，才可认为该抗孕蛋白是有效的。或者，如上所述，本发明中的抗孕蛋白的有效性也可通过检测全血、血清、黏膜分泌物、大便等标本中的针对该抗孕蛋白的抗体水平来进行评估。也可按上述的方法用免疫组化技术观察针对抗孕蛋白的抗体结合到卵子上的情况来评估该抗孕蛋白的有效性。但是，依照本发明，针对该抗孕蛋白的抗体的测定或观察必须与观察每窝的幼仔数量是否减少相结合，以精确的评估本发明中抗孕蛋白的有效性。例如，如果实验动物的生育率没有减少，即使在动物的血清中检测到了针对该抗孕蛋白的抗体的存在，也可认为该抗孕蛋白是无效的。实施例1植物优化的鼠ZP3表位与植物优化的合成LT-B基因的融合一个来自TH210(Mason等，(1998)Vaccines161336)的EcoRV和KpnI酶切位点之间的片段含有一个合成的LT-B序列，被插入到载体pBluescript(Stratagene，LaJola，CA，USA)的相应的位点上，由此生成重构体pBlueLTB。用一个特异性BbsI位点将一个编码6个氨基酸的连接子(翻译性)与pBlueLTB重构体中的LT-B编码区域的3′端融合，由此生成质粒PLTB-L。用两条商业合成核苷酸寡聚体5′AACTCTGATCCACATGTTCCT(SEQIDNO1)以及5′AGTTAGGAACATGTGGATCAG(SEQIDNO2)来构建连接子，这些核苷酸寡聚体已经在变性的聚丙酰胺凝胶电泳纯化分离。在每个单独的反应中，这些核苷酸寡聚体用T4连接酶，然后以可分子数相等的数量混合在一起；退火的处理时加热到90℃5分钟，然后逐渐冷却到23℃1个小时。制备质粒PLTB-L，用核酸内切酶Bbs核KpnI依次酶切，再用小牛肠磷酸酶(CIP)去磷酸化，以便插入小鼠ZP3表位。分析小鼠的ZP3表位的编码序列(336-342)以确定与植物基因相比较时的密码子选择(Wada等，1990NucleicAcidResearch182367)。设计一个植物优化的表位，保持天然表位本身的氨基酸序列，同时在其5′和3′端也有另外的核苷酸序列，寡核苷酸组装后，生成一个BbsI和KpnI相容性片段。合成寡核苷酸A5′AACTTCCAAATTCATGGACCAAGAAACTAAGTCTTCGGTAC(SEQIDNO3)andB5′CGAAGACTTAGTTTCTTGGTCCATGAATTTGGA(SEQIDNO4)，并用变性的聚丙酰胺凝胶电泳的方法纯化。按照前述的PLTB-L构建的方法组装该表位核酸序列，再将其置于冰上，然后将其连接到具有NcoI和KpnI的酶切位点的PLTB-L，生成pLTBL7。用双脱氧链终止法对质粒PLTB-L和pLTB7进行测序。曾有作者获得了用NcoI和KpnI酶切后的pLTB7片段，并将其插入到用NcoI和KpnI内切酶酶切后的pIBT210中而生成pAW7(Haq等，1995Science268714)。用HindIII和EcoRI内切酶酶切pAW7后纯化而得到该表达序列，再与用HinDIII和EcoRI酶切pGPTV后生成的PAWBIN7连接(Becker等，PlantMolecularBiology201195)。实施例2转化西红柿将通过大肠杆菌DH5∝提取的质粒pAWBin7以电穿孔的方式转染膨胀土壤杆菌属EHA105。再由土壤杆菌属介导，转化西红柿子叶(西红柿是Tanksley变种，编号TA234TM2R)。转化步骤除种子消毒过程外，其余参照Frary和Earle文献提供方法(Frary和Earle，1996PlantCellReports16235)。将种子浸泡与70％乙醇2分钟，再用无菌水漂洗，然后用10％的消家净加1％的吐温-20浸泡2小时。再将种子用无菌蒸馏水漂洗3次，接种到半强度的MurashigeandSkoog介质上(即半强度MS盐，参考文献Murashige和Skoog，1962PhysiologiaPlantarum15473)(介质成分50毫克/份内消旋肌醇、2毫克/份盐酸维生素B1、0.5毫克/份的盐酸维生素B6、0.5毫克/份的烟酸、10毫克/份的蔗糖和8毫克/份的pH5.8的difcobacto琼脂)在上述介质中加入300毫克/份的卡那霉素以培植小总苞。通过神经节苷脂依赖性酶联免疫吸附试验筛选其叶子和果实均表达热稳定肠毒素B亚单位的单个植株。用自花授粉的方式培植热稳定肠毒素表达量最多的植株，得到的种子用含有卡那霉素300毫克/份的介质中培养。再将存活的幼苗转到土壤中在温室下培植并自花授粉。将每棵转基因植物所结果实冰冻干燥、混匀后，在干燥环境下储存。实施例3蛋白抽提与酶联免疫吸附试验从温室种植的植物取得新鲜茎叶和果实(或干燥果实)样本，加入2摩尔/升冰冻抽提缓冲液置Bio101快速准备器内作匀浆处理(干燥果实样本的抽提缓冲液浓度为50摩尔/升)。抽提缓冲液成分为50毫摩尔磷酸钠(pH6.6)、100毫摩尔氯化钠、1毫摩尔依地酸钠、0.1％TritionX-100溶液、10皮克/毫升的白胃素、1毫摩尔苯甲磺酰氟。不溶性物质以压片机处理后装入EP管内，用5415C型微量离心机4℃离心5分钟，转速14000转/分。提取上清液置冰上作成分分析后置-80℃低温保存。以考马斯亮蓝结合法(BioRad提供)对提取的总蛋白浓缩液进行测定，应用小牛血清(BSA提供)作标准对照。将每个蛋白提取液以1/100的浓度稀释，取其中两份作神经节苷脂依赖性酶联免疫吸附试验法测定取值(参考文献Haq等，supra)(图1a，b，c)。实施例4融合蛋白纯化与检测采集热稳定肠毒素B亚单位含量超过8μg/克的转基因植物1号干燥标本，以20毫升/克的浓度加入冰冻抽提缓冲液，按上述方法进行抽提。取上清液，与磷酸盐缓冲液葡聚糖凝胶混合，置摇床孵育4℃过夜。上述处理后标本可分装为1毫升/管，置4℃保存。孵育处理后将溶液置烧结玻璃漏斗中，加入60毫升磷酸盐缓冲液过滤提纯。加入5毫升磷酸盐缓冲液调制成葡聚糖悬浮液，真空干燥后用BioRadX层析仪作柱层析。层析过程中每1毫升样本加入50毫升磷酸盐缓冲液洗柱。按0.2摩尔的浓度加入D-半乳糖，用磷酸盐缓冲液洗脱融合蛋白，置4℃保存。经上述处理后，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析并以考马斯亮蓝染色。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见此融合蛋白条带，并以实施例3所述酶联免疫吸附试验法检测确定结果。实施例5基因核酸分离取植物嫩叶部分200-250毫克，装入1.5毫升微量离心管中，液氮下研磨成粉末。加入500微升抽提液(成分420g/l尿素、312.5毫摩尔氯化钠、5.0毫摩尔pH8.0三羟基甲烷盐酸、20毫摩尔依地酸钠、1％sarcocine)和500微升苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，孵育30分钟。14000转/分4℃离心15分钟。吸取上清液，加入等体积4摩尔异丙醇溶液沉淀RNA，-20℃孵育至少8小时。15000转/分4℃离心15分钟，转移上层水相至分离管。以经核糖核酸酶灭活处理的无菌水溶解RNA片状沉淀物。在上清液中加入10％容积7.5摩尔醋酸铵和1体积的异丙醇沉淀基因DNA，-20℃孵育至少8小时。70％乙醇洗涤RNA，真空干燥5分钟后，用含核糖核酸酶50皮克/毫升的无菌水50微升溶解。实施例6Southern杂交分析本实施例用于确定融合脱氧核糖核酸(DNA)的染色体整合。每反应加入15μg的DNA，每微克DNA加3.4单位HindIII，以37℃消化过夜后，以1％TAE琼脂糖凝胶电泳过夜。将琼脂糖凝胶以0.25M盐酸作去嘌呤处理后，按试剂盒说明书以碱性转移法行转膜处理(BioRad公司提供探针)。DNA被紫外交联固定在ZETA膜上。探针制备用PAW7作模板，按试剂盒说明书进行聚合酶链反应制成标记探针。引物序列如下上游5′-GCATTCTACTTCTATTGCAGC)(SEQIDNO5)；下游5′-GTGCATATCAGCATAC)(SEQIDNO6)。扩增产物含洋地黄标记脱氧嘧啶核苷三磷酸，长度588碱基；反应参数94℃预热4分钟；94℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共32个循环；4℃停留5分钟；最后72℃延伸5分钟。(使用仪器HybaidPCRExpressThermo-Cycler。(聚合酶链反应、洋地黄标记脱氧嘧啶核苷三磷酸反应试剂盒由BoehringerMannheim提供)。杂交备原位杂交瓶和杂交膜(每片配备10毫升洋地黄标记脱氧嘧啶核苷三磷酸Easy杂交探针)(由BoehringerMannheim提供)，置杂交箱中预热45℃。杂交膜作预杂交至少90分钟后，进行杂交过夜。杂交探针浓度为5毫升/膜。杂交后按试剂盒说明书进行膜洗涤。经上述处理后，将杂交膜行放射自显影，阳性结果显示植物染色体的融合脱氧核糖核酸的整合情况。(DIG洗涤和阻断缓冲试剂盒、DIG发光检测试剂盒由BoehringerMannheim提供)。实施例7Northern杂交Northern杂交用于证实融合蛋白在转录核糖核酸水平的表达。Northern杂交按《分子可隆》(Sambrook等著)方法进行。用甲醛/甲酰胺对基因RNA进行变性处理，1％的3-N-吗啉代丙磺酸-乙酸-依地酸钠琼脂糖凝胶电泳2小时，再利用毛细管作用将RNA转移到ZETA探针膜上(BioRad提供)，UV交联固定。杂交温度42℃，其余步骤与方法同Southern杂交。以上实施例证实了融合蛋白在转录核糖核酸水平的表达。实施例8小鼠饲喂与标本采集用实施例小鼠对转基因植物的抗孕效果进行体外测试。将小鼠按一只雄性配三只雌性的比例配种喂养，记录每只雌鼠的产子数。采集热稳定肠毒素B亚单位含量超过8微克/克的西红柿果实，冰冻干燥，混匀并研磨成粉末，按重量容积比1∶2比例加入苹果汽水进行饲喂，隔周一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三组，其中4-5只饲喂4克野生型西红柿加苹果汽水；4-5只饲喂4克转基因西红柿加苹果汽水；4-6只饲喂4克转基因西红柿加苹果汽水和Quillaja浸膏10毫克(Garuda提供)。饲喂当天，将雌性小鼠由中午开始隔离、停止饲喂任何食物，只饲喂水，并单独隔离，下午4点饲喂上述实施例用药，留置饲喂品在笼里过夜。次晨8时将隔离雌性小鼠放回与配种雄性小鼠同笼喂养。第0天和70天，从雌性小鼠尾部取血，分离血清，于-80℃保存，留作日后抗体分析。第96天从心脏穿刺取血，同法处理。第70天和87天取粪便标本，-80℃冻存过夜，取沉淀物冻干处理，加入磷酸盐缓冲液0.8毫升(pH7.2)制成悬浮液，14000转/分离心5分钟，取上清-20℃保存，留日后检测用。实施例9ELISAs试验法检测实验小鼠LTB亚单位和ZP3抗原决定族的抗体与生殖力按参考文献方法((Dickenson与Clements，InfectImmun.1995，631617))检测实验小鼠血清中抗热稳定肠毒素B亚单位和透明带糖蛋白3抗原抗原决定族免疫球蛋白IgG和粪便沉淀物中抗热稳定肠毒素B亚单位和透明带糖蛋白3抗原抗原决定族免疫球蛋白IgA浓度。结果见图2a，2b。样本用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液连续稀释。检测热稳定肠毒素B亚单位抗体将微量滴定板涂上神经节甙酯III型(美国密苏里洲圣路易斯Sigma公司提供)。0.25％BSA封闭处理后，加入纯化热稳定肠毒素B亚单位重组子孵育1小时；检测透明带糖蛋白3抗原抗原决定族抗体用共轭BSA抗原决定族重组子涂抹微量滴定板，以0.25％BSA封闭处理。应用兔抗小鼠血清或抗田鼠免疫球蛋白IgG和碱性磷酸酶共轭鹿抗兔血清(Sigma提供).作血清热稳定肠毒素B亚单位和透明带糖蛋白3抗原抗原决定族抗体检测；而粪便热稳定肠毒素B亚单位和透明带糖蛋白3抗原决定族抗体检测应用山羊抗小鼠血清或抗田鼠免疫球蛋白，以及碱性磷酸酶共轭兔抗山羊血清。通过比较实验组和空白对照组的雌性小鼠产次和产子数评价经口饲喂药物的效果。每组6只小鼠。实验组饲喂转基因西红柿糊剂。同时评价田鼠经口饲喂的效果作为非目标性对照(图4)。实施例10具抗孕效应转基因烟草细胞悬浮培养将编码小鼠透明带糖蛋白3抗原决定族、袋鼯透明带糖蛋白3的抗原抗原决定族和通用型GnRH的基因融合到热稳定肠毒素B亚单位上(构建方法描述如下，图5a，b，c)。分别将小鼠和袋鼯的抗原决定族与热稳定肠毒素B亚单位融合，以使其翻译至热稳定肠毒素B亚单位的羟基末端。使用三个融合体将GnRH与热稳定肠毒素B亚单位融合，以使GnRH的抗原决定族可翻译至热稳定肠毒素B亚单位的氨基末端、羟基末端或热稳定肠毒素B亚单位五聚体其中任一单体的外部。将融合上述蛋白的基因编码区导入植物基因的表达盒内(编号PIBT210.1，然后插入二元载体pGPTV，再通过土壤杆菌属介导，将含有小鼠透明带糖蛋白3-热稳定肠毒素B亚单位、袋鼯透明带糖蛋白3-热稳定肠毒素B亚单位、GnRH的羟基末端以及GnRH内部四个融合体的基因转化至烟草细胞系NT1中。用热稳定肠毒素B亚单位和GnRH特异性酶联免疫吸附试验法分析小鼠和GnRH融合体的基因转化情况(图6)。检测结果证实羟基末端融合体的存在；而融合体内部热稳定肠毒素B亚单位的表达水平较低。我们认为是由于热稳定肠毒素B亚单位的五聚体结构防碍了热稳定肠毒素B亚单位的表达，并再作检测。在基因转化植物细胞系中能检测到GnRH抗原决定族的低水平表达。实施例11转基因胡萝卜作物培植本实验使用胡萝卜品种Nanco(DaucuscarotaL.cv.Nanco提供)Gilbert等于1996年对三个胡萝卜品种进行研究(文献参考详后)证实Nanco最适合基因转化，而且容易培植。本实验所用种子由英国进口，亨普斯特德种子供应商Hemel生产，BoyceThompson植物研究供。所有种子用漂白水进行消毒20分钟，发芽后再用70％乙醇消毒20分钟。若有发现某种子样本在培植过程中被细菌或真菌污染，终止培植并销毁该样本。将胡萝卜无菌培植后7-15天割下胚轴，移植到液体培养基中，在温室、避光、慢速震摇条件下，与土壤杆菌属EHA105共同培植36-48小时(培养基中有含量适当的表达载体，详述后)。然后，将移植作物转移到固体培养基上，培养基中加入植物生长素2，4-D以刺激胚芽胼胝体再生；以及羧噻吩青霉素-棒酸复合剂以杀灭残存的土壤杆菌。室温避光培植。五周后，移植物已长出胼胝体，将其转移至新鲜配制的含卡那霉素的固体培养基，以筛选优势植株细胞进行基因转化。所有植株均以室温、避光培植。再过五周，将健康胼胝体转移到不含2，4-D的新鲜固体培养基上，给予充足光线以促进幼苗再生。另外，将其中部分胼胝体转移到含2，4-D的新鲜固体培养基上，仍以避光培植，以刺激胼胝体进一步生长，以培植出下一批幼苗。所有在卡那霉素培养基上生长不良或被细菌、真菌污染的植株均要终止培植并销毁。经过大约10-14周的培植与优势筛选后，给予充足光线，将长出根芽的胡萝卜转移到控制条件的温室中培植。8周后可收获转基因胡萝卜根部。实施例12转基因胡萝卜细胞悬浮培养取2-5克上述卡那霉素培养筛选的健康胡萝卜胼胝体转移到50毫升的液体培养基上。此标准液体培养基成分400毫升水、400微升Murashige&Skoog维生素、1.7克Murashige&Skoog盐、1.2克蔗糖，经高压灭菌处理后，按浓度2.2毫克/升加入2，4-D，并按浓度300毫克/升加入羧噻吩青霉素-棒酸复合剂以防止微生物污染。将上述培养基置旋转型摇床上，常温下，100-120转/分摇转。经上述处理，胼胝体逐渐分解为单一细胞或细胞系。每隔7-10天，每5毫升细胞悬浮培养液加入45毫升新鲜液体培养基，以维持细胞的健康生长。实施例13将胡萝卜细胞制成干粉胡萝卜细胞培养7-10天后，将细胞悬浮液用滤纸过滤，-80℃冻结24小时。收集样本冻存数周后，将样本置冷冻管中，最低参数真空干燥48小时后。称重、用手挤压样本，用密封塑料袋分装-20℃储存，每袋约350克。所制成的细胞干粉应该高度脱水，不沾手；而且细胞干粉的重量至少比新鲜采集的成品减少10％。用酶联免疫吸附试验和聚合酶链反应对干粉的结构作特异性检测。可测量抗原含量为50-100微克/克净重干粉；可测量抗原浓度约为10-15倍。实施例14特异性构建体PTH110构建体PTH110编码E.coli热稳定肠毒素B亚单位。研究证实本构建体在马铃薯表达并能在给小鼠饲喂给药后产生效应(Mason等，supra)；而且用于人类临床试验(Tacket等，1998NatureMed.4607)。本构建体在马铃薯表达，是巨噬细胞激活因子的靶基因(进口准字1999007035)。纽西兰林肯Landcare研究所已用于饲喂袋鼯研究。以下实验研究本抗孕植物对免疫和生殖方面的影响，用热稳定肠毒素B亚单位(热稳定肠毒素B亚单位)表达阳性的胡萝卜作为阴性对照。作为阴性对照的植物细胞中的热稳定肠毒素B亚单位分子结构为五聚体，和生殖道、呼吸道和消化道黏膜的上皮细胞有亲和力，因此可以与分子量更小的蛋白例如抗孕药的抗原决定族特异性结合。以下的构建体编码含有热稳定肠毒素B亚单位和具有免疫抗孕效应的多肽的融合蛋白。对植物的根部和叶子进行酶联免疫吸附试验法分析也显示热稳定肠毒素B亚单位为五聚体，分子结构中含有具有免疫抗孕效应的多肽。pGPTV-MuZP3与构建体PTH110比较，构建体PTH110在原热稳定肠毒素B亚单位的基因下游近端有插入序列，表达于蛋白多肽的羟基末端。其氨基酸序列中有多肽结合位点(氨基酸序列Asn-Ser-Asp-Pro-His-Val-Pro)(SEQIDNO7)，B细胞的微小抗原决定族，以及小鼠透明带糖蛋白3的氨基酸残基335-342(序列Asn-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg)(SEQIDNO8)。pGPTV-GnRH1与二元载体pGPTV-小鼠透明带糖蛋白3构建体比较，本构建体具有猪的GnRH的十肽结构的基因编码序列，表达在小鼠透明带糖蛋白3的抗原决定族上。本十肽结构的氨基酸序列如下Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQIDNO9)，在哺乳动物中普遍表达。pGPTV-GnRH3与构建体PTH110比较，本构建体具有GnRH的十肽结构，通过连接位点与热稳定肠毒素B亚单位基因的氨基末端融合。在热稳定肠毒素B亚单位基因中含有信号多肽，在翻译后切割以使其分子五聚体结构的成熟。此切割位点在酪氨酸和甘氨酸残基之间(残基编号21&22)。切割完成后，GnRH抗原决定族已经插入到甘氨酸残基后。在GnRH的抗原决定族与热稳定肠毒素B亚单位的氨基末端有短序列(氨基酸序列Tyr-Ala-His-Gly)(SEQIDNO10)，以维持丙氨酸-丙氨酸序列结构，由此促进蛋白结构的成熟过程。pGPTV-pAW6与pGPLIV-GnRH1构建体比较，本构建体具有澳洲袋鼠的透明带糖蛋白3来源的B细胞抗原抗原决定族，位于GnRH的十肽结构内。此抗原抗原决定族由27个氨基酸组成，(野生型序列第334-361)，其序列保守。pGPTV-pAW4与构建体PTH110比较，其热稳定肠毒素B亚单位的基因被澳洲袋鼠的透明带糖蛋白3的编码基因全段所替代。pGPTV-pAW4-A2与二元载体pGPTV-pAW4构建体比较，其结构中仅具有澳洲袋鼠透明带糖蛋白3的部分序列短片段，推测是部分多肽被切割造成的。在澳洲袋鼠透明带糖蛋白3基因的羟基末端有插入片段，其中有短肽序列(Gly-Pro-Gly-Pro)(SEQIDNO11)和E.coli热稳定肠毒素A亚单位的基因编码区。E.coli根据分泌产生的肠毒素不同而分A和B两个亚单位。在野生型和植物细胞里的，两者结合在一起组成稳定的海参毒素。其中B亚单位作用于上皮细胞，而A亚单位通过腺苷二磷酸核糖化作用引起腹泻。A亚单位有A1和A2两个区。A1区在下游处延伸形成A2区，通过α-螺旋与B亚单位形成的五聚体连接，组成分子结构骨架，最后A1区锚定在五聚体上。将二元载体pGPTV-pAW4-A2构建体与构建体PTH110或上述一系列衍生构建体共同转化植物细胞后，A2区提供锚定位点，使澳洲袋鼠透明带糖蛋白与3热稳定肠毒素B亚单位连接起来。实施例15小鼠饲喂转基因胡萝卜抗孕试验以前述实施例14方法构建基因并转化胡萝卜，实施例11方法培植，实施例12、13方法加工处理。将小鼠按雌雄比例3∶1进行配种，同笼饲养，记录雌鼠产子数目。胡萝卜干粉的热稳定肠毒素B亚单位的表达量应高于50μg/克。将干粉混匀，按重量容积比1∶2的比例加入苹果汽水调成糊状。隔周饲喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三组，其中4-5只饲喂4克野生型胡萝卜加苹果汽水；4-5只饲喂4克转基因胡萝卜加苹果汽水；4-6只饲喂4克转基因胡萝卜加苹果汽水和Quillaja提取粉末10毫克(Garuda提供)。饲喂当天，将雌性小鼠由中午开始隔离、停止饲喂任何食物，只饲喂水，并单独隔离，下午4点饲喂上述实验用药，留置饲喂品在笼里过夜。次晨8时将隔离雌性小鼠放回与配种雄性小鼠同笼喂养。第0天和70天，从雌性小鼠尾部取血，分离血清，于-80℃保存，留作日后抗体分析。第96天从心脏穿刺取血，同法处理。第70天和87天取粪便标本，-80℃冻存过夜，取沉淀物冻干处理，加入磷酸盐缓冲液0.8毫升(pH7.2)制成悬浮液，14000转/分离心5分钟，取上清-20℃保存，留日后检测用。实施例16新鲜植物饲喂小鼠同时给受试小鼠饲喂新鲜植物，实验中使用新鲜西红柿和胡萝卜的果实和叶子。挑选热稳定肠毒素B亚单位的表达量大于50皮克/克的西红柿和胡萝卜干粉，采用其相对应的来源新鲜植物，叶子和果实均可。将植物切碎混匀，加苹果汽水调成糊状。隔周饲喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三组，其中4-5只饲喂4克野生型胡萝卜或西红柿加苹果汽水；4-5只饲喂4克转基因胡萝卜或西红柿加苹果汽水；4-6只饲喂4克转基因胡萝卜或西红柿加苹果汽水和Quillaja浸膏10毫克(Garuda提供)。饲喂当天，将雌性小鼠由中午开始隔离、停止饲喂任何食物，只饲喂水，并单独隔离，下午4点饲喂上述实验用药，留置饲喂品在笼里过夜。次晨8时将隔离雌性小鼠放回与配种雄性小鼠同笼喂养。第0天和70天，从雌性小鼠尾部取血，分离血清，于-80℃保存，留作日后抗体分析。第96天从心脏穿刺取血，同法处理。第70天和87天取粪便标本，-80℃冻存过夜，取沉淀物冻干处理，加入磷酸盐缓冲液0.8毫升(pH7.2)制成悬浮液，14000转/分离心5分钟，取上清-20℃保存，留日后检测用。实施例17植物干粉匀浆的抗原衰减程度变化植物来源疫苗的应用要使用适当剂量，这要通过临床试验数据得出用药最小剂量和最大剂量之间的范围。用于制造疫苗的原材料要有适当的抗原浓度有效范围，药厂的批量生产和质量控制才有意义。最近三项人体试验(Tacket等，1998；Tacket等2000；Thanavala等，personalcommunication)中，受试者食用未经加工的、表达有效的抗原蛋白的小块转基因马铃薯。上述试验中，由随机抽样检测转基因植物的抗原表达量得出试验用药剂量，结果相差悬殊，高达3倍。挑选类似的马铃薯，用前述方法脱水制成干粉，随机抽样作体外免疫反应检测，结果显示，不同样本之间的抗原衰减程度相差高达10倍。在表达相同抗原(乙型肝炎表面抗原)的转基因西红柿以及其他几种转基因植物的试验中也得出相同结果(见表1，说明书附图部分)。在本试验中，用以下两种方法之一取得均化作用效果。第一种方法在冰冻干燥前，捣碎和混匀新鲜植物材料的过程中，以及在将混匀材料冰冻和冰冻干燥以后使用。首先把植物切片、混合或研磨，将果实、块茎、叶子、种子等作初步加工，做成果浆。果浆内含有完整植物细胞和细胞岁片。此方法的优点是将较大的植物样本如果实和块茎类的体积缩小，混在一起形成较均质的混合物，以使不同样本的同种蛋白的含量之间的差异缩小，达到大致的相同。另外，由于本方法没有完全破坏植物细胞的完整性，提供稳定环境有利于在以后的处理过程中细胞内同种蛋白的保存。第二种均化方法对植物初步加工处理的步骤简单。按上述步骤将植物切成四份或碎片，或不予切开，冰冻干燥。然后手工挤压成粉末，储存在一大容器内，用震荡器或干燥混匀器使之混匀。在植物的加工全过程中要求简化步骤，以尽量减少对植物的抗原浓度的影响。在标准，以干燥前处理工序(匀浆、去皮、切成四份或小片)对干燥所需要时间的影响作为指标，评价这些工序对植物的抗原浓度的影响。如图7显示，除马铃薯没作去皮或任何切碎处理(切成四份、果丁、片状或匀浆)以外，全部冰冻干燥步骤均是必须的。实施例18使用非匀浆技术，对马铃薯进行脱水处理，使其净重减少至毛重的1/11，而将转基因蛋白的丢失减低到最低程度前面所述口服试验中使用了相对比较大的剂量以保证受试食品中含有足够的抗原浓度。例如，上述的三个人体临床试验中，受试者每次服食100至150克未经加工的马铃薯，以至有些受试者要30分钟才能消化掉。对于大部分接受疫苗接种的人来说，服食100克左右或更多的未加工食品似乎难以接受。因此，这里表述的实验方法的主要优点就是能够浓缩蛋白质。如表2所示(说明书附图部分)，材料被最大限度的压缩94％(马铃薯经处理后净重减少至毛重的11％，而西红柿是6％)。与前述的临床试验比较，使用本方法处理后，受试者只需要口服6克的植物干粉，而植物的抗原量不会在加工过程中丢失。而且，植物干粉可以用常用方法赋型，如制成糊剂或饮料，以便口服。这里的资料描述了多种抗原和植物品种的加工方法。这些加工方法去除了植物90％的水分，使样本的净重比毛重减轻了11倍，但是，对植物品种的评估显示，浓缩后的样本的抗原浓度仅增加了4-8倍，说明了在加工过程抗原的丢失明显(至少是在检测过程中发生抗原丢失)。加工过程通常包括原材料的匀浆，冰冻、冰冻干燥、浓缩后制成精细干粉，然后使用赋形剂(抗氧化剂、稳定剂、佐剂等)。如表2所总结，在多个植物品种的实验证实，上述非匀浆方法可以浓缩原材料而最大限度的减少植物抗原的丢失。使用本方法可以明显减少口服植物量而达到有效的剂量浓度，并增加口服植物的抗原浓度。另外，对于更多的植物成分，如叶子或茎部，使用匀浆方法会破坏细胞结构和转基因蛋白，使用本方法，简便易行，可稳定疫苗或其他治疗用药物。实施例19组织匀浆剂型环境稳定性与赋形剂对抗原修复和稳定的影响先前关于植物来源提取物的药物学方面的研究评价了目的蛋白在天然植物中的稳定性。苜蓿来源的标准抗体提取物在液体抽提液中可以保持稳定性两个小时，在干燥苜蓿中可保持稳定性12周(Khoudi等，1999)。对于植物来源的治疗用药来说，尤其是口服疫苗，要保持大部分的药效，以稳定食物形式保存可使抗原稳定性保存期延长到至少6个月到2-3年。对几种表达相关标准抗原的剂型的环境稳定性的评价结果显示，目的蛋白的稳定性可保持达12个月。如图9显示，大多数的材料在稳定周边环境和较低温度条件下，没有明显降解。说明高效非热性脱水是保护抗原的手段，此方法可使抗原与植物同时脱水或存留在完整植物细胞和部分细胞碎片内，从而不被降解。需作进一步的检测以确定是否植物本身的酶或结构蛋白可破坏剂型的保护结构，使抗原失效，成为无目的基因的匀浆。在这些标准剂型中，使用的赋形剂有好几种，对其免疫原性、对植物材料的保护效果、抗原修复和抗原稳定性进行评价。有研究显示(Leopold，1998)，单一结构玻璃化糖可以通过保护防止蛋白自然变性而对植物酶起稳定作用。在将转基因西红柿制成果酱的过程中，加入食用蔗糖，评价其对植物细胞内抗原的稳定性的影响。除蔗糖以外，将西红柿和马铃薯匀浆后，加入试验用佐剂液，作为临床评价；并且在部分样本中加入维生素C(Aldrich提供)，以评价抗氧化剂对减少马铃薯匀浆抗原丢失的效果。而这些赋形剂对抗原修复和稳定性的效应严格来说是不一致的。加入蔗糖并不明显增加植物材料脱水处理的时间。维生素C的用量必须不少于1∶150的浓度(质量比)，才能对马铃薯匀浆产生可见性的抗氧化效应(匀浆变为棕褐色)。但是此用量并没有大到修复抗原的效果。通常所有冰冻干燥的材料在周边温度下可保持抗原稳定性6个月，某些甚至可保持到12个月。因此，在上述实验中，冰冻干燥是脱水过程中的基本步骤，而经过初步匀浆加工的材料可以在储存之前应用空气干燥或喷雾干燥。优选是无论什么干燥方法，最后可以使材料脱水90％以上(重量比)，储存在密封袋和密封容器里。密封后，匀浆干粉可储存于室温下。使用此方法未发现明显的可测量性目的蛋白的减少。实施例20饲喂转基因免疫性抗孕用西红柿动物产子胎数小于对照组本实验证实，给小鼠经口饲喂植物来源的由热稳定肠毒素B亚单位-小鼠透明带糖蛋白3抗原决定族的融合蛋白加皂甙佐剂制成的药物以后，其生殖力降低45.3％。将Millar等所述实验方法合成的热稳定肠毒素B亚单位与小鼠透明带糖蛋白3抗原决定族的融合基因转化西红柿，然后用于本实验。实验使用三个饲喂方案野生型西红(对照组)，转基因西红柿(转基因组)，转基因西红柿加Quillaja浸膏(转基因+佐剂组)。将西红柿冰冻干燥、研磨成粉末后以1∶2的比例(重量比)加入经巴氏消毒的苹果汽水(由CORNELL提供)。将西红柿所含的热稳定肠毒素B亚单位的浓度值作为融合蛋白的近似值。实验组所用的转基因西红柿每净重1克所含有的热稳定肠毒素B亚单位的表达量应大于8克。西红柿配成饲喂品后，热稳定肠毒素B亚单位或融合蛋白的含量是37.8克；转基因加佐剂加入的Quillaja浸膏粉末(由Garuda提供)的量为10毫克/4克。每次用培养皿装4克饲喂品饲喂雌鼠；每次饲喂的转基因西红柿中含有热稳定肠毒素B亚单位或融合蛋白100.8克。同时给予小鼠和田鼠饲喂，隔周一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。在小鼠组，在头5个饲喂天，将雌性小鼠从原来的笼中隔离出来，给予单独饲喂，停留4到6小时后放回原来的笼里。饲喂当天，将雌性小鼠由中午开始隔离、停止饲喂任何食物，只饲喂水，并单独隔离，下午4点饲喂上述实验用药，留置饲喂品在笼里过夜。次晨8时将隔离雌性小鼠放回与配种雄性小鼠同笼喂养。记录剩余饲喂品的重量，以观察小鼠进食和进饮情况。在田鼠组，在给予雌性田鼠饲喂前将雄性田鼠和小田鼠从笼里取出，暂时停留啊另外一个笼里，以免它们进食饲喂品。停留时间不大于一小时，以免其由于分离而产生紧张。如果雌性田鼠没吃完饲喂品，取走剩余饲喂品，四小时后采用相同方式饲喂剩余饲喂品。记录剩余饲喂品的重量。对受试小鼠和田鼠在实验过程中的产次和产子数进行记录。在小鼠组，各组之间的产次无明显差异(∝＝0.05)。然而转基因加佐剂组的产子数比对照组下降45.3％前者是平均每次产2.9只，而后者是每次产5.3只。本结果的统计可信区间是90％。在田鼠组，各组之间的产次无明显差异(∝＝0.05)；而各组之间的产子数也没有差异。本结果的统计可信区间是95％(∝＝0.05，∝＝0.1)实施例21植物加工处理对抗原含量的影响在进行冰冻干燥处理前后对转基因植物2号的重量和热稳定肠毒素B亚单位的含量进行测量，以检测冰冻干燥处理对植物的重量和抗原含量的影响。对样本的重量方面的测量显示，处理后植物的重量较处理前(无相关数据)下降6％。酶联免疫吸附试验法检测显示，热稳定肠毒素B亚单位的含量在冰冻干燥处理前后的无明显差别，抗原浓度约为16倍，提示冰冻干燥过程没有发生明显的抗原丢失。实施例22使用植物来源疫苗经口饲喂小鼠以被动免疫子代小鼠动物将小鼠置笼里喂养，除饲喂测试食品外，给予饲喂水和标准实验用食物。每个实验使用5-6只成年雌性小鼠。将小鼠按雌雄比3∶1和2∶1的比例同笼饲养。幼鼠断奶后将其与母鼠隔离并与其他幼鼠同笼饲养。实验方法将表达热稳定肠毒素B亚单位的转基因西红柿细胞系放温室，以适宜的条件培育，用于本实验。将西红柿果实制成粉末，批量制成植物疫苗，4℃保存。将西红柿粉末与苹果汽水以1∶2的比例(重量比)配制，作为口饲疫苗组；另外，在上述基础上按每4克加入10毫克的Quillaia浸膏作为佐剂组。疫苗的饲喂方案隔周饲喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。饲喂当天，将雌性小鼠由中午开始隔离、停止饲喂任何食物，只饲喂水，并单独隔离，下午4点进行饲喂，留置饲喂品在笼里过夜。次晨8时将隔离雌性小鼠放回与配种雄性小鼠同笼喂养。如前述，将小鼠分为三组对照组(四只小鼠)、疫苗组(五只小鼠)、疫苗加佐剂组(五只小鼠)。血清取样第0天和70天，从雌性小鼠尾部取血，分离血清，于-80℃保存，留作日后分析。第96天从心脏穿刺取血，同法处理。试验进行42天后，每组均有小鼠出生(每组有2只或大于2只雌性小鼠生产，每组至少13只)。将新生小鼠用良好条件喂养，以保持健康，留作日后作热稳定肠毒素B亚单位的抗体效价分析，取血时间是幼鼠出生第21天，心脏穿刺取血。酶联免疫吸附试验法测定热稳定肠毒素B亚单位抗体对血清样本的抗热稳定肠毒素B亚单位免疫球蛋白G进行测定，方法如[8]。简单来说，将样本用含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)稀释。将微量滴定板涂上神经节甙酯III型(美国密苏里洲圣路易斯Sigma公司提供)。然后，用0.25％BSA封闭，再加入纯化的热稳定肠毒素B亚单位重组子孵育1小时。洗涤后，加入兔抗鼠免疫球蛋白G和碱性磷酸酶共轭山羊抗兔血清(Sigma公司提供).，最后加入稀释血清进行检测。本实验通过比较母鼠和其生产的幼鼠的血清的抗体阳性反应的最低稀释度来探讨母鼠和幼鼠之间的关系。所检测的母鼠的血清抗体阳性反应的最低稀释度的取血时间是第70和96天，正好与其相应幼鼠的取血时间相近。因此，所有幼鼠的取血时间应限定在出生第21天。受试小鼠中有7只母鼠、9胎幼鼠、41只幼鼠。处理和产仔进行热稳定肠毒素B亚单位抗体效价检测的小鼠情况在对照组中，3只母鼠、生产4胎、共18只幼鼠；在转基因西红柿组，4只母鼠、生产5胎、共17只幼鼠；在转基因西红柿加佐剂组，2只母鼠、生产3胎、共13只幼鼠。酶联免疫吸附试验法检测热稳定肠毒素B亚单位抗体给予转基因西红柿组和转基因西红柿加佐剂组母鼠的经口饲喂疫苗总次数为14次，平均每次饲喂的疫苗的热稳定肠毒素B亚单位含量为75.6μg。而每只母鼠在生产前接受饲喂的次数是不同的，但至少都有8次。第70天取血做的血清检测显示，饲喂转基因西红柿组和转基因西红柿加佐剂组中所有母鼠的抗热稳定肠毒素B亚单位免疫球蛋白的效价明显高于对照组(图11，检验水准＝0.05)；而转基因西红柿组和转基因西红柿加佐剂组之间的比较差异无显著性。对照组的18只幼鼠中，没有样本的血清抗体阳性反应的最低稀释度大于25(图12)；而转基因西红柿组的17只幼鼠的血清抗体阳性反应的最低稀释度为558.3；转基因西红柿加佐剂组的13只幼鼠的血清抗体阳性反应的最低稀释度为448.1。转基因西红柿组和转基因西红柿加佐剂组之间的比较差异无显著性(检验水准＝0.05)；转基因西红柿组和转基因西红柿加佐剂组的血清抗体阳性反应的最低稀释度明显高于对照组(检验水准＝0.05)。相关分析结果显示，母鼠和相应幼鼠的血清抗热稳定肠毒素B亚单位免疫球蛋白的效价成正相关(r2值为0.9289)。实施例23稳定性研究此处表述了一些植物原料的储存情况。包括NT-1细胞培养，此细胞表达AIV-HA和改造过的大肠杆菌肠毒素(SLT102)；转基因西红柿表达AIV-HA、NVCP、乙型肝炎表面抗原和E.大肠杆菌热稳定肠毒素B亚单位；以及转基因西红柿表达NVCP和乙型肝炎表面抗原。上述材料在不同的温度下储存超过6个月，在此过程中，定期随机抽样通过进行标志抗原检测，评估其抗原含量。图14至17描述了在上述储存植物材料中随机抽样检测显示的存留可测量抗原含量。其他实施例其他的实施例是本领域的公知技术。必须声明上述内容仅作为增加本发明的透明度，而且仅作为示范。本发明的精要和内涵不只是以上实验内容，而且包括权利要求书。所有的专利、专利申请和出版物的引用都完整引作参考。参考文献ArakawaT，YuJ，ChongDK，HoughJ，EngenPC，LangridgeWH″Aplant-basedcholeratoxinBsubunit-insulinFUSIONPROTEINPROTECTSAGAINSTTHEDEVELOPMENTOFAUTOIMMUNEDIABETES″；NatBiotechnol16934-8(1998).ARIKAWA，J.，K.Yoshimatsu，andK.H.″Epidemiologyandepizootiologyofhantavirusinfectionin[JAPAN.″；Jpn.J.Infect.Dis.，54，no.395-102(2001).BagdasarianMM，NagaiM，FreyJ，BagdasarianM″ImmunogenicityofActinobacillusApxIAtoxinEPTIOPESFUSEDTOTHEE.COLIHEAT-LABILEENTEROTOXINBSUBUNIT″.Vaccine17441-447.(1999).Bandivdekar，A.H.，V.J.VERNEKAR，S.B.Moodbidrietal.″Characterizationof80kDahumanspermantigenRESPONSIBLEFORIMMUNOINFERTILITY.″AM.JREPROD.IMMUNOL″；45，no.128-34(2001).BeckerD，KemperE，SchellJ，MastersonR″NewplantbinaryvectorswithselectablemarkersLOCATEDPROXIMALTOTHELEFTTDNABORDER.PLANTMOLECULARBIOLOGY″；201195-1197(1992).Berger，J.，andS.L.Cain″Reproductivesynchronyinbrucellosis-exposedbisoninthesouthernGREATERYELLOWSTONEECOSYSTEMANDINNONINFECTEDPOPULATIONS.″；CONSERVATIONBIOLOGY，13，no.2357-366(1999).Bosshardt，S.C.，etal.″BrugiapahangicirculatingantibodiestoadultwormantigensinUNINFECTEDPROGENYOFHOMOLOGOUSLYINFECTEDFEMALEJIRDS″；ExpParasitol，72(4)p.440-449(1991).CardenasL，ClementsJD″Developmentofmucosalprotectionagainsttheheat-stableenterotoxin(ST)OFESCHERICHIACOLIBYORALIMMUNIZATIONWITHageneticfusiondeliveredbyabacterialvector″；InfectImm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其中所述的编码具抗孕效应多肽的核酸也编码黏膜亲和蛋白。35.如权利要求23的方法，其中所述的黏膜亲和蛋白是指大肠杆菌属肠毒素B亚单位。36.一种转基因植物，它含有的转基因植物材料表达编码具抗孕效应多肽的核酸，该转基因植物可通过诱导动物对所述的抗孕蛋白产生黏膜免疫反应，使用该转基因植物材料的受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。37.一种转基因植物，它含有的转基因植物材料表达编码具抗孕效应多肽的核酸；其中所述的编码具抗孕效应多肽的核酸不是表达在病毒颗粒上，该转基因植物可通过诱导动物对所述的抗孕蛋白产生黏膜免疫反应。38.一种转基因植物，它含有的转基因植物材料表达编码具抗孕效应多肽的核酸，使用该转基因植物材料的受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。39.一种可食用的转基因植物，它含有的转基因植物材料表达编码具抗孕效应多肽的核酸，该转基因植物可通过诱导动物对所述的抗孕蛋白产生黏膜免疫反应，其中所述核酸是整合到植物染色体中的。40.如权利要求25、26、27或28的转基因植物，其中所述的核酸编码的具抗孕效应的多肽选自透明带糖蛋白3、GnRH、LHRH、LH、LDH和抗精子抗原。41.如权利要求29的转基因植物，其中所述的透明带糖蛋白是从ZP1、ZP2、ZP3和ZP4中选取的。42.如权利要求29的转基因植物，其中所述的透明带糖蛋白或其片段是种属特异性的。43.如权利要求29的转基因植物，其中所述的透明带糖蛋白是ZP3或其片段。44.如权利要求25、26、27或28的转基因植物，其中所述的核酸进一步也编码黏膜亲和蛋白。45.如权利要求33的转基因植物，其中所述的黏膜亲和蛋白是大肠杆菌属肠毒素B亚单位。46.如权利要求25、26、27或28的转基因植物，其中所述的植物是单子叶植物。47.如权利要求25、26、27或28的转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物。48.如权利要求25、26、27或28的转基因植物，其中所述的植物是从下列植物中筛选的西红柿、水稻、小麦、玉米、胡萝卜、马铃薯、苹果、大豆、紫花苜蓿、苜蓿属、蔬菜和水果。49.一种含有核酸载体的植物细胞，其中所述的核酸载体编码具抗孕效应的多肽，其中所述的核酸载体整合到细胞染色体中并在所述的植物细胞染色体中表达，使用该转基因植物细胞的受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。50.如权利要求38的植物细胞，其中所述的核酸载体编码的具抗孕效应的多肽选自透明带糖蛋白3、GnRH、LHRH、LH、LDH和抗精子抗原。51.如权利要求39的植物细胞，其中所述的透明带糖蛋白是从ZP1、ZP2、ZP3和ZP4中选取的。52.如权利要求38的植物细胞，其中所述的抗孕蛋白是种属特异性的。53.如权利要求40的植物细胞，其中所述的抗孕蛋白是ZP3。54.如权利要求38的植物细胞，其中所述的核酸载体同时编码黏膜亲和蛋白。55.如权利要求43的植物细胞，其中所述的黏膜亲和蛋白是大肠杆菌属肠毒素B亚单位。56.如权利要求38的植物细胞，其中所述的植物细胞来自单子叶植物。57.如权利要求38的植物细胞，其中所述的植物细胞来自双子叶植物。58.如权利要求38的植物细胞，其中所述的及的植物细胞是从下列植物细胞中筛选的西红柿细胞、水稻细胞、小麦细胞、玉米细胞、胡萝卜细胞、马铃薯细胞、苹果细胞、大豆细胞、紫花苜蓿细胞、苜蓿属细胞、蔬菜细胞和水果细胞。59.一种用于转化植物细胞的质粒载体，它包括编码具有抗孕效应的多肽的核酸序列；植物功能性启动子，它可与上述编码具抗孕效应的多肽的核酸连接起来，从而可以直接在所述的植物细胞里合成所述的具抗孕效应的多肽；含有所述质粒载体的植物细胞可通过诱导所述动物对所述的抗孕蛋白产生黏膜免疫反应，使用该转基因植物细胞的受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。60.如权利要求48的质粒载体，其中所述的核酸编码的多肽其中所述的核酸载体编码的具抗孕效应的多肽选自透明带糖蛋白3、GnRH、LHRH、LH、LDH和抗精子抗原。61.如权利要求49的质粒载体，其中所述的透明带糖蛋白是从ZP1、ZP2、ZP3和ZP4中选取的。62.如权利要求48的质粒载体，其中所述的植物细胞来自食用植物。63.如权利要求48的质粒载体，它进一步含有编码黏膜亲和蛋白的核酸序列。64.如权利要求52的质粒载体，其中所述的黏膜亲和蛋白是大肠杆菌属肠毒素B亚单位。65.一种食物组合物，它含有权利要求25、26、27或28所述的、可被受试动物吸收的转基因植物中的至少一部分，所述的吸收诱导所述的动物产生黏膜免疫反应，受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。66.如权利要求54的食物组合物，其中至少一部分权利要求25、26、27或28的转基因植物是由植物叶子、根、芽、茎、果实、块茎、花和种子中选取的。67.一种药物组合物，它含有权利要求25、26、27或28的转基因植物的至少一部分；药学上可接受的载体；使用上述药物组合物的受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。68.如权利要求56的药物组合物，其中所述的至少一部分权利要求25、26、27或28所述的转基因植物是由植物叶子、根、芽、茎、果实、块茎、花和种子中选取的。69.一种组合物，它含有经处理的转基因植物材料和皂甙佐剂的混合物，它可经口饲喂实验动物，受试动物每个繁殖周期的平均产仔数至少下降50％。全文摘要本发明提供了保存在植物中表达的药用蛋白的方法。这里的植物组织初料加工成没有显著损失蛋白或其药效的稳定的匀浆。该匀浆可以直接用于药用目的，而不必经过进一步的提取、纯化、或沉淀药用蛋白。本发明进一步提供了一种对动物和人进行有效的免疫抗孕的方法。披露的方法可以生产表达抗孕蛋白的转基因植物或植物细胞，它们可以整体或者部分的，或者在加工以后，饲喂动物使其产生抗孕效果。文档编号A61P15/18GK1639331SQ02807917公开日2005年7月13日申请日期2002年4月12日优先权日2001年4月13日发明者韦恩·科克,哈夫·马逊,阿曼达·维尔穆斯林,查理·阿特泽申请人:波依斯汤普森植物研究所