专利名称：具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物材料复合制备领域，特别涉及一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法。
背景技术：
软骨缺损很难自我修复，给患者造成很大的痛苦。软骨缺损的修复是困扰临床治疗的棘手问题，在世界范围内这类患者人数众多，且随着社会老龄化加剧，软骨缺损发病率呈现日益增长的趋势。临床上对 软骨缺损修复主要采用自体、异体软骨移植和关节假体置换。自体软骨移植由于软骨组织的来源有限，极大地限制了此法在临床上的应用。同种异体软骨移植虽然软骨组织来源充足，但此法存在一定的免疫排斥问题；另外，移植软骨与相邻软骨间能否达到牢固结合仍然是未完全解决的难题。传统的人工关节置换使用年限短，且随着使用年限的增长，容易产生材料失效、老化等问题；近年来，随着组织工程技术的发展，组织工程化软骨被认为是最有应用前景的软骨修复方法。组织工程软骨修复是以软骨组织修复支架为载体，结合软骨种子细胞、生长因子，通过体内或体外培养构建软骨组织。在这一过程中软骨组织修复支架具有重要作用，它为细胞、组织的重建提供了必要的三维空间和力学支持，起到模拟细胞外基质的作用；具有良好的组织相容性，适合的孔径和孔隙率，利于软骨细胞的增殖和黏附，以及营养物质的渗入和细胞代谢产物的排出；具有良好的生物活性，能够使修复重建的软骨组织与底层自体骨牢固结合。因此需要软骨组织修复支架具有良好的生物活性，适合的力学性能，理想的三维微观结构，且具有与正常软骨组织相符的宏观形貌。聚乙烯醇(PVA)水凝胶是亲水性聚乙烯醇大分子经交联后形成的网络状结构的水溶胀体。PVA水凝胶具有稳定的化学性质、良好的物理机械性能、易于成型、与人体组织良好的生物相容性，尤其是PVA水凝胶与人体组织性能相似的物理性质、对水分子等优异的透过性、适宜的扩展性、良好的柔韧性等，这些特性使PVA水凝胶可以用作伤口敷料、药物释放载体、人造组织、组织工程等生物医学领域。近年来研究证实PVA水凝胶具有和人体关节软骨类似的生物力学性质和良好的生物相容性，植入人体后能重建平滑的软骨面，减轻磨损，部分替代关节软骨，延缓或阻止创伤性骨关节炎的发生，是一种理想的关节软骨替代材料。但与人关节软骨相比PVA水凝胶没有生物活性，影响软骨的固定和修复功能，且PVA水凝胶的力学强度较弱，作为组织工程支架使用时很难控制其外观形貌和微观结构。因此为改善PVA水凝胶的性能，本发明将PVA水凝胶与具有优异的赋型能力和力学性能的细菌纤维素水凝胶复合，并通过反应加入具有良好生物活性的羟基磷灰石。细菌纤维素(BC)作为一种优良的生物材料，在湿润状态下形成的细菌纤维素水凝胶具有其独特的物理、化学性能:其具有天然的三维纳米网络结构；良好的力学性能；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能:优异的赋型能力，可以在细菌纤维素培养时精确控制其外观形貌和微观结构。同时，细菌纤维素还具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性。研究表明，细菌纤维素水凝胶优异的力学性能(拉伸模量和弹性模量)可以达到与正常软骨相似的水平；同时软骨细胞在细菌纤维素上表现出高水平的生长，并且可以维持软骨分化、支持软骨细胞的迁移增殖。羟基磷灰石是一种磷酸钙生物陶瓷，具有良好的生物相容性、界面生物活性和骨传导性、骨结合能力。在组织工程软骨修复中能够使重建的软骨组织与底层自体骨牢固结合。本专利采用计算机断层扫描技术、三维快速成型技术、菌株/石蜡混合发酵技术并且将羟基磷灰石的制备与冷冻-解冻法结合，制备出一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。该组织工程软骨修复支架具有PVA水凝胶网络状结构与BC水凝胶网络结构形成的互穿网络结构，同时羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在互穿网络结构内部；得到的支架具有与正常软骨组织相符的宏观形貌和力学性能，良好的生物活性，以及理想的三维多孔结构。本发明工艺简单、成本低、无污染，制备的复合水凝胶组织工程软骨修复支架可作为组织工程支架材料应用于关节软骨修复、半月板修复等软骨组织修复中。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法。涉及一种生物材料复合制备领域。本发明工艺简单、成本低、无污染，且制备的复合水凝胶组织工程软骨修复支架具有适合的外观形貌和多孔结构、良好的力学性能和生物活性，可作为组织工程支架材料应用于关节软骨修复、半月板修复等软骨组织修复中。本专利涉及的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法。包括:
(O 采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型，利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，通过布尔运算得到其负型。利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡 负型。(2) 细菌纤维素发酵:选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上，加入发酵培养基培养6 14d。(3) 发酵产物经石蜡脱除、纯化处理和脱水浸溃处理得到含CaCl2水溶液重量百分比为30 50%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。将聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A。采用浸溃法，使混合溶液A进入细菌纤维素水凝胶软骨修复支架内部，得到的产物经冷冻-解冻数次，Y-射线辐照处理得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。作为优选的技术方案:
其中，如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的设计支架材料内部的三维多孔结构为每5mmX5mm的加工平面上呈nXn阵列式的微孔，微孔直径为200 500Mffl，微孔间距不小于200Mffl。计算机模拟技术设计的三维多孔结构，通过石蜡负型、发酵培养将最终影响组织工程软骨修复支架内部的三维多孔结构。在组织工程培养过程中，适合的孔径和孔隙率，利于软骨细胞的增殖和黏附，以及营养物质的渗入和细胞代谢产物的排出。因此在支架材料多孔结构设计时可以通过调节三维多孔的数量、位置以及微孔的孔径，控制三维多孔支架的孔径和孔隙率。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的菌株/石蜡混合发酵方法为:将菌株浓度为50 95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，10 20min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20 30°C，时间为6 14d。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的石蜡脱除、纯化处理方法为:在50 70°C的温度下，发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5 IOmin,然后在70 100°C的温度下，在重量百分比为4 8%的NaOH水溶液中洗涤4 6h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。以除去石蜡、细菌纤维素上的菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的脱水浸溃处理方法为，细菌纤维素经高速离心、真空脱水或压榨脱水后浸泡在CaCl2水溶液中，经反复脱水、浸泡得到含CaCl2水溶液重量百分比为30 50%的细菌纤维素水凝胶。所述的CaCl2水溶液浓度为50 lOOmmol/L。反复脱水、浸泡处理可以在不破坏细菌纤维素水凝胶三维网络结构的基础上使 CaCl2水溶液进入细菌纤维素内部，并去除多余的水分子。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的混合溶液A为聚乙烯醇在60 100°C下溶解于Na2HPO4水溶液中得到的混合溶液，其中聚乙烯醇分子量为2 20万，醇解度为87 99%，混合溶液A中含聚乙烯醇的重量百分比为10 25% ；Na2HP04水溶液的PO4离子浓度为CaCl2水溶液中Ca离子浓度的
0.5-0.7倍，优选0.6倍。CaCl2水溶液与Na2HPO4水溶液相互反应可以得到羟基磷灰石颗粒，在这一过程中Ca离子与PO4离子的摩尔比例是得到羟基磷灰石[Caltl(PO4)6(OH)2]的关键。聚乙烯醇-Na2HPO4水溶液进入含有CaCl2水溶液的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架内部，由于细菌纤维素和聚乙烯醇分子链上均具有大量的羟基基团能够促进Ca离子的沉积，以细菌纤维素的纤维素纳米纤维为模板，CaCl2与Na2HPO4溶液相互反应形成羟基磷灰石颗粒。同时由于聚乙烯醇分子链上羟基基团与Ca离子的相互作用促进了 PVA分子链间的相互作用，形成了类似“物理交联点”的结构，有利于PVA水凝胶的形成；并且阻碍了羟基磷灰石颗粒粒径的增大，有利于提高复合水凝胶软骨修复支架的力学强度。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的冷冻-解冻方法为在-40 -10°C下，冷冻6 24h，然后在室温下解冻I 4h。反复次数为I 4次。冷冻使细菌纤维素中PVA的分子链的运动状态被“冻结”下来，PVA分子链在羟基磷灰石颗粒周围发生分子链间相互作用及链缠结，形成有序结构。解冻后，这些结合紧密的有序微区不再分开，成为“缠结点”。重新冻结时又有新的有序微区形成，这些微区称为“物理交联点”。用冷冻-解冻法可以促进PVA分子运动，重新排列，通过分子链的折叠获得具有结晶/半结晶结构的PVA水凝胶。并且PVA水凝胶网络状结构与BC水凝胶网络结构形成的互穿网络结构，同时羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在互穿网络结构内部，从而使复合水凝胶的物理性能和机械性能得到很大提高。如上所述的一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的Y-射线辐照处理，其辐照剂量为15 60kGy。在Y-射线辐照处理作用下，聚乙烯醇分子链间通过产生的自由基而交联在一起，交联度随辐射剂量的增大而增大，水凝胶的交联密度增大，网络结构中微孔的尺寸将会减小，从而使水凝胶的溶胀比、含水量等降低，故通过控制辐射剂量可以实现对交联密度的调控。因此采用的Y-射线辐照能均匀地作用在PVA上，使PVA的交联点分布均匀，并且交联度易于控制，能够进一步提高PVA水凝胶的交联密度，以使产物达到人体软骨组织的力学性能要求；并且在辐照处理过程中还可同步实现对软骨修复支架的消毒灭菌。与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本专利采用计算机断层扫描技术、三维快速成型技术、菌株/石蜡混合发酵技术并且将羟基磷灰石的制备与冷冻-解冻法结合，制备一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。该组织工程软骨修复支架具有PVA水凝胶网络状结构与BC水凝胶网络结构形成的互穿网络结构，同时羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在互穿网络结构内部；得到的软骨修复支架具有与正常软骨组织相符的宏观形貌和力学性能，良好的生物活性，以及理想的三维多孔结构。本发明工艺简单、成本低、无污染，制备的复合水凝胶组织工程软骨修复支架可作为组织工程支架材料应用于关节软骨修复、半月板修复等软骨组织修复中。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1:
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈9X9阵列式的微孔，微孔直径为500μπι，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为50%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，IOmin后加入发酵培养基，发酵培养温度为30°C，时间为6d。发酵产物在50°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡lOmin。然后在重量百分比为4%的NaOH水溶液中，在100°C的温度下加热4h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为50mmol/L的CaCl2A溶液。采用高速离心法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为50%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。

在60°C下，将分子量为20万，醇解度为87%的聚乙烯醇溶于30mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为10%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在-10°C下，冷冻6h，在室温下解冻lh，反复次数为4次。然后采用Y-射线辐照处理，辐照剂量为15kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。
实施例2:
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈6X6阵列式的微孔，微孔直径为200μπι，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，20min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20°C，时间为14d。发酵产物在70°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为5%的NaOH水溶液中，在90°C的温度下加热5h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为50mmol/L的CaCl2A溶液。采用高速离心、法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为50%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。在60°C下，将分子量为15万，醇解度为88%的聚乙烯醇溶于30mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为25%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在_20°C下，冷冻8h，在室温下解冻2h，反复次数为4次。然后采用Y-射线辐照处理，辐照剂量为25kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。实施例3:
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈7X7阵列式的微孔，微孔直径为250Mm，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。
`
选取能分泌细菌纤维素的假单胞菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为65%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，IOmin后加入发酵培养基，发酵培养温度为20°C，时间为12d。发酵产物在60°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡IOmin0然后在重量百分比为6%的NaOH水溶液中，在80°C的温度下加热6h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mmol/L的CaClpK溶液。采用真空脱水法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为40%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。在70°C下，将分子量为12万，醇解度为89%的聚乙烯醇溶于60mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为15%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在_30°C下，冷冻10h，在室温下解冻3h，反复次数为3次。然后采用Y-射线辐照处理，辐照剂量为35kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。实施例4:
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈8X8阵列式的微孔，微孔直径为300μπι，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的无色杆菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为75%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，20min后加入发酵培养基，发酵培养温度为30°C，时间为10d。发酵产物在70°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为7%的NaOH水溶液中，在70°C的温度下加热6h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mmol/L的CaClpK溶液。采用真空脱水法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为40%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。在80°C下，将分子量为10万，醇解度为90%的聚乙烯醇溶于60mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为10%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在_40°C下，冷冻12h，在室温下解冻4h，反复次数为3次。然后采用Y-射线辐照处理，辐照剂量为45kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。实施例5:
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈8X8阵列式的微孔，微孔直径为400μπι，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的产碱菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为85%的种子醪液以点阵方式 均匀滴加在石蜡负型上，15min后加入发酵培养基，发酵培养温度为25°C，时间为8d。发酵产物在60°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡lOmin。然后在重量百分比为8%的NaOH水溶液中，在80°C的温度下加热5h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为75mmol/L的CaCl2A溶液。采用压榨脱水法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为30%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。在100°C下，将分子量为2万，醇解度为99%的聚乙烯醇溶于45mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为25%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在_40°C下，冷冻16h，在室温下解冻4h，反复次数为2次。然后采用Y-射线辐照处理，辐照剂量为55kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。实施例6
采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型。利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，每5mmX 5mm的加工平面上呈7X7阵列式的微孔，微孔直径为500μπι，微孔间距不小于200Mffl。设计完成的软骨修复支架通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型。
选取能分泌细菌纤维素的固氮菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，20min后加入发酵培养基，发酵培养温度为30°C，时间为14d。发酵产物在50°C下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡IOmin0然后在重量百分比为6%的NaOH水溶液中，在100°C的温度下加热4h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。将CaCl2溶解于蒸馏水中配制成浓度为75mmol/L的CaCl2水溶液。采用压榨脱水法对细菌纤维素进行部分脱水，并将其浸泡在CaCl2水溶液中。反复脱水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比为30%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。
在100°C下，将分子量为8万，醇解度为95%的聚乙烯醇溶于45mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比为15%的混合溶液A，然后将细菌纤维素水凝胶浸泡在混合溶液A中。浸溃处理后的复合物在_40°C下，冷冻24h，在室温下解冻4h。然后采用Y -射线辐照处理，辐照剂量为60kGy，得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。
权利要求
1.一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，包括: (a)采用计算机断层扫描技术对预期修复的软骨组织经行扫描，获得软骨组织三维结构的数字模型，利用数字模型设计支架材料内部的三维多孔结构，通过布尔运算得到其负型，利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末为成型材料，制得软骨修复支架的石蜡负型； (b)细菌纤维素发酵:选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上，加入发酵培养基培养6 14d ; (c)发酵产物经石蜡脱除、纯化处理和脱水浸溃处理得到含CaCl2水溶液重量百分比为30 50%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架，将聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A，采用浸溃法，使混合溶液A进入细菌纤维素水凝胶软骨修复支架内部，得到的产物经冷冻-解冻数次，Y-射线辐照处理得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架。
2.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的设计支架材料内部的三维多孔结构为每5mmX5mm的加工平面上呈nXn阵列式的微孔,微孔直径为200 500Mm,微孔间距不小于200Mm。
3.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
4.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的菌株/石蜡混合发酵方法为:将菌株浓度为50 95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，10 20min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20 30°C，时间为6 14d。
5.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的石蜡脱除、纯化处理方法为:在50 70°C的温度下，发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5 lOmin，然后在70 100°C的温度下，在重量百分比为4 8%的NaOH水溶液中洗涤4 6h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。
6.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的脱水浸溃处理方法为，细菌纤维素经高速离心、真空脱水或压榨脱水后浸泡在CaCl2水溶液中，经反复脱水、浸泡得到含CaCl2水溶液重量百分比为30 50%的细菌纤维素水凝胶，所述的CaCl2水溶液浓度为50 lOOmmol/L。
7.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的混合溶液A为聚乙烯醇在60 100°C下溶解于Na2HPO4水溶液中得到的混合溶液，其中聚乙烯醇分子量为2 20万，醇解度为87 99%，混合溶液A中含聚乙烯醇的重量百分比为10 25% ；Na2HP04水溶液的PO4离子浓度为CaCl2水溶液中Ca离子浓度的0.5-0.7倍，优选0.6倍。
8.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的 冷冻-解冻方法为在-40 -10°C下，冷冻6 24h，然后在室温下解冻I 4h,反复次数为I 4次。
9.如权利要求1，一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法，其特征是:所述的 Y-射线辐照处理，其辐照剂量为15 60kGy。
全文摘要
本发明公开了一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架的制备方法。包括制备软骨修复支架的石蜡负型。以石蜡负型为模板，选取能分泌细菌纤维素的菌株发酵培养。发酵产物经石蜡脱除、纯化和脱水浸渍处理得到含CaCl2水溶液重量百分比为30～50%的细菌纤维素水凝胶软骨修复支架。将聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A。采用浸渍法使混合溶液A进入细菌纤维素水凝胶软骨修复支架内部，得到的产物经冷冻-解冻数次，γ-射线辐照处理得到一种具有生物活性的复合水凝胶组织工程软骨修复支架材料。本发明制备的复合水凝胶具有适合的外观形貌和多孔结构、良好的力学性能和生物活性，可作为组织工程支架材料应用于软骨组织修复中。
文档编号A61L27/12GK103143058SQ20131011059
公开日2013年6月12日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者钟春燕, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:钟春燕