专利名称：克服b细胞免疫耐受的免疫微球及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫领域，特别涉及一种克服B细胞免疫耐受的免疫微球及其应用。
背景技术：
抗原(Ag)是指能与T、B淋巴细胞的TCR或BCR结合，促使其增殖、分化，产 生抗体或致敏淋巴细胞，进而发挥免疫效应的物质。抗原的分类方法很多，根据诱生抗 体时需否Th细胞参与，可分为胸腺依赖性抗原(TD-Ag)和胸腺非依赖性抗原(TI-Ag)。 绝大多数蛋白质抗原，如病原微生物、血细胞、血清蛋白等均属TD-Ag。胸腺依赖性抗 原诱导的抗体产生过程需要T细胞的参与。抗体产生的指令来自两种信号抗原与B细 胞表面抗原受体结合和辅助性T淋巴细胞(Th)的辅助刺激信号。抗原蛋白表位与B细胞膜受体结合并发生内化，是第一信号。B细胞吞噬免疫 微球后在B细胞内体(endosome)或溶酶体(Iysome)中释放抗原并被蛋白酶水解，其中合 适的片断与细胞MHCII结合提呈给Th细胞。实现Th细胞活化并释放细胞因子作为第二 信号促使B细胞转化成分泌抗体的浆细胞。接种疫苗是人类抵御和控制传染性疾病的有效手段之一。传统意义上的疫苗主 要是预防性疫苗，其应用对象是健康群体的易感动物及人群，其疫苗成分一般均为微生 物保护性抗原，可在健康肌体中激活特异性免疫应答，产生特异性抗体和细胞毒T淋巴 细胞(CTL)，从而获得对该病原体的免疫预防能力，但对已发病的个体不能产生有效的 免疫应答。治疗性疫苗(Therapeutic Vaccine)是近年建立和发展起来的免疫治疗新概念，是
指能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答的疫苗。治疗性疫苗能在已 患病个体诱导特异性免疫应答，消除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗，是抗病毒、 抗肿瘤的新治疗手段。肿瘤是治疗疫苗重点研究领域。用于制备疫苗的抗原有生长因子(EGF、TGF、 VEGF)及相应受体(EGFR、Her2、VEGFR)肿瘤相关抗原CEA、MUCl等用于实体肿 瘤治疗。CD20用于B细胞淋巴病的疫苗。Idiotype是另一类用于B细胞和T细胞淋巴 细胞白血病。默克制药公司目前正对一种用于非小细胞肺癌(最常见的肺癌种类)治疗的疫苗 进行第三期临床试验，试验计划于2010年结束。该疫苗被设计用于诱发癌细胞表面的 MUCl分子产生一种免疫反应。1300名参与此项试验的患者遍布全球，其中包括巴西、 中国、印度和墨西哥这些发展中国家。这一大范围的受试者征集反映肺癌是一个全球性 的问题。全球首个癌症治疗性EGF疫苗在古巴获准上市用于肺癌治疗。瑞士医药集团塞托斯生物技术公司和英国Protherics公司两家都在对高血压疫苗 进行二期临床试验。是以血管紧张素为疫苗，产生封闭抗体。法国Neovacs公司Zagury等将人肿瘤坏死因子连接一种免疫促进剂——钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。用此复合物免疫接种转基因小鼠，可完全保护小鼠免于重复注射肿 瘤坏死因子的伤害，用于类风湿疾病治疗。拟用以代替昂贵的单克隆抗体和受体治疗用 途。针对IgE的疫苗用于过敏性疾病、可能突现技术突破。TGF用于肝硬化及动脉高压 研究。治疗性疫苗极有可能复制甚至超越单克隆抗体过去10年的辉煌。以上的疫苗均以人体内自身蛋白为抗原，产生抗体为目标，通过中和反应封闭 特定分子的功能，或通过抗体的ADCC效应和补体杀伤效应实现治疗目的由上可知，目前的治疗性疫苗所采用的抗原通常选用人体或者动物的自身蛋 白，或称内源性蛋白。内源性蛋白不能诱导动物或人产生高滴度抗体。称之谓B细胞免疫耐受。实际上但是针对自身蛋白反应的B细胞还是会少量产生。在二级淋巴细胞组织 中因体细胞突变机制使B细胞V区基因突变。不能产生能针对自身蛋白抗体的机理在于 辅助T细胞免疫耐受。目前认为维持体内自身免疫耐受状态的主要机制是在中枢免疫器官发生的T细 胞克隆清除，在外周中诱导自身潜能细胞进入免疫无能(anergy)状态，及部分淋巴细胞 对自身蛋白的免疫忽视(ignorance)。内源性蛋白的表位可与B细胞结合，但不能诱导B 细胞产生抗体现有的技术是与外源性强抗原蛋白，免疫学上称之谓免疫载体(immunocarrier) 的蛋白化学偶联，引入外源性蛋白用于活化Th细胞。经载体蛋白活化Th细胞，才可诱 导B细胞产生抗体。在免疫应答中，B细胞识别内源性蛋白抗原表位，并提呈载体蛋白 表位给CD4+Th细胞，Th细胞识别载体蛋白表位，这样载体就可把特异T-B细胞连接起 来(T-B桥联)，T细胞才能激活B细胞。除了将内源性蛋白与免疫载体(immonocarrier)蛋白化学交联方法，还用基因工 程技术构建含有免疫载体的融合蛋白作为异源分子。由此带来了新的问题由于针对内源蛋白的B细胞在发育过程中克隆清除，与 外源载体蛋白表位结合的B细胞的丰度比与内源性蛋白表位结合的B细胞的丰度高几个 数量级，从而存在交联蛋白(或融合蛋白)分子内蛋白表位免疫竞争的问题。当疫苗进 入人体或动物体内，外源载体蛋白表位具有竞争优势，B细胞受体有更高机率结合外源 载体蛋白表位并吞噬，产生针对外源载体蛋白的高滴度抗体。而内源性蛋白的相应抗体 受抑制，只能产生低滴度抗体，很难实现临床治疗价值。本发明与文献中报道的免疫微球区别在于已有的免疫微球是将抗原吸附或化 学交联于微球表面或将抗原包裹于微球内部。功能是缓释作用或促进巨噬细胞吞噬。不 能起到克服B细胞免疫耐受，也不适用于内源性蛋白。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种的免疫微球，从而克服现有技术中化学交 联蛋白或融合蛋白分子内表位的免疫竞争问题。一种克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其包括微球介质，所述微球介质外部包 覆有疫苗抗原，所述微球介质内部包裹有用于活化T细胞的免疫载体蛋白。所述疫苗抗原的B细胞表位位于所述免疫微球的表面，所述免疫载体蛋白的T细胞表位位于所述免疫微球的内部，从而实现B细胞表位与T细胞表位的物理隔离。所述的免疫载体蛋白选自嘁血蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、基因工程表 达的破伤风病毒蛋白片断、乙肝病毒壳蛋白、脑膜炎球菌蛋白、HIV外壳蛋白、感冒病 毒蛋白。所述的疫苗抗原选自表皮生长因子、血管生长因子、血管生长因子受体、 IgE,表皮生长因子受体EGFR及突变体、表皮生长因子受体肿瘤坏死因子、转化生长因 子血管紧张素、CD20。所述微球介质选自海藻酸钙、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸、琼脂糖、葡聚糖。所述疫苗抗原通过常规化学方法与所述微球介质偶联。利用双功能交联试剂实现氨基-氨基、羧基-氨基、氨基-锍基的偶联。利用戊二醛试剂实现氨基与氨基的偶联。所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制备上的应用。所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球在免疫佐剂上的应用。通过上述技术方案，本发明提供的免疫微球通过抗原与B细受体结全被B细胞 吞噬，载体蛋白在细胞内释放、降解；并通过B细胞MHCII提呈给Th细胞，激活Th细 胞释放细胞因子，从而促使B细胞活化、增殖；经过亲和力成熟过程产生高滴度抗体。 通过将抗原蛋白及免疫载体蛋白分置于微球表面及内部，避免了抗原蛋白表位与Th细胞 活化表位同B细胞受体的竞争。根据本发明的一个优选实施例，提供一种表皮生长因子(EGF)构建的微球。EGF疫苗，这种具有靶向性质的新药早已引起世界各国医药界的关注。该疫苗 由古巴分子免疫学中心研发，临床研究证实用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)治疗有效。该研究成果10年前转让给美国cancerVax公司进行临床研究。美国已经通过药 品的临床试验，预计将在未来2到3年内投入应用。ASCO(美国临床肿瘤学)大会连续 几年均报道了 EGF疫苗临床研究进展报告。晚期不可切除的非小细胞肺癌患者在接受一 线化疗后，随机分为两组，一组接种EGF疫苗，另一组接受最佳支持治疗，接种时间为 第0、7、14、21、51天，之后每月接种1次。研究结果显示试验组患者总生存期比对 照组患者提高4 5个月，患者身体素质显著改善，抵抗力增强。开发治疗性疫苗研究 将具有重大的理论意义，拥有巨大的经济及社会效益。目前，秘鲁正在进行对药品的审核，预计年底能够上市，在中国，由北京百泰 生物药业有限公司负责该药临床研究及产业化生产，并在2008年底在中国开展大规模临 床研究，进一步验证该药对非小细胞肺癌患者的疗效。肿瘤细胞区别于正常细胞主要特征之一是失控性生长，肿瘤细胞本身可以生成 某些生长因子促进细胞无限制生长，EGF (表皮生长因子)是近年发现的在细胞增殖和分 化中起重要作用的分子。EGF疫苗正是运用特异性主动免疫的方法，以肿瘤组织高表达 的EGF-EGFR(表皮生长因子受体)系统信号通路为作用靶点。患者接种该疫苗后，刺 激免疫系统产生针对EGF的抗体，阻断由EGF-EGFR介导的下游信号传导通路，从而诱 导肿瘤细胞凋亡，为肿瘤分子靶向治疗提供了更新的选择。在本发明的优选实施例中，用海藻酸钙为材料制备微球，微球内包裹有牛血清 白蛋白(BSA)作为活化T细胞的免疫载体蛋白(Immunocarrier)。表面复以壳聚糖提供连按抗原的氨基。以小鼠内源的表皮生长因子(mEGF)为疫苗抗原，通过化学方法偶联于 微球表面。免疫微球经尾静脉注射免疫小鼠，4周后取血常规ELISA方法测定EGF抗体 滴度。结果显示EGF抗体滴度大于8000 ；常规方法皮下免疫，EGF滴度小于200。从而证明未经化学交联的小鼠自身蛋白可以成为完全抗原免疫获得高滴度抗 体。根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的表皮生长因子(EGF)构建的微球为 EGF-微球疫苗治疗肿瘤提供实验基础。根据本发明的一个优选实施例，提供一种血管生长因子(VEGF)构建的微球。肿瘤血管形成在肿瘤生长、侵袭和转移中具有重要意义，如果没有新生血管进 入肿瘤为其带来足够的氧气和营养，并运走代谢产物，肿瘤直径将很少超过2 3_， 因为仅靠周围的血管对肿瘤弥散作用是完全不够的，肿瘤只能处于休眠状态或发生退 化。如果血管一旦长入肿瘤组织，提供给肿瘤组织营养和氧气的方式由弥散转变成血流 灌注，其代谢产物将能够被及时和彻底地清除，则肿瘤呈指数生长，显现出无限制扩张 的趋势。肿瘤的生长和血管生成是相辅相成的。肿瘤细胞产生的促血管生成因子能够刺 激内皮细胞的生长及生存，而血管的生成不仅是提供营养、氧气和运走代谢物，血管内 皮细胞还可向肿瘤提供生长启动的因子。VEGF(血管内皮生长因子)是得到最好定性的 肿瘤血管形成诱发因子，阻断VEGF的功能已经成为癌症治疗中的一个重要工具。在本发明的优选实施例中，以血管内皮细生长因子(mVEGF)为抗原，以聚乳 酸-乙醇酸(PLGA)制备免疫微球，以鸡卵白蛋白为免疫载体蛋白。微球复以壳聚糖提供 偶联氨基。戊二醛方法偶联VEGF。免疫条件与EGF微球相同。6周后取血常规ELISA 方法测定mVEGF抗体滴度。结果显示，mVEGF抗体滴度达到64000。获得较海藻酸 钙微球更好的结果。因此，本发明的微球为肿瘤血管抑制提供了免疫制剂。根据本发明的一个优选实施例，提供一种小鼠IgE C ε 3多肽构建的微球。IgE 介导性疾病是一类由IgE引发的变态反应性疾病的统称，因其易感者在接触环境中变应原 时往往产生过多的IgE抗体，通常伴有一种以上的变态反应性疾病而得名。当变应原初 次进入机体后，选择性诱导特异性B细胞产生IgE抗体应答，而血清中游离的IgE可在 不结合抗原的情况下通过其Fc片段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面受体结合使机体处于 致敏状态。机体再次接触变应原后，多价变应原与致敏细胞表面两个或者两个以上相邻 的IgE抗体结合，使细胞膜表面受体发生交联，触发致敏细胞脱颗粒，合成及释放生物活 性介质，从而引起局部或者全身过敏反应。IgE介导性疾病通常包括特应性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)、变应性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)、支气管哮喘(Asthma，AS)等， 症状重者可导致过敏性休克，危及生命。变态反应性疾病发病率逐年提高趋势，已严重 干扰了患者的工作和生活，由此带来的社会负担也是相当可观的。由于IgE在变态反应 性疾病的发生发展环节中的重要作用，目前已经成为抗变态反应性疾病治疗的一个新的 靶点和研究热点。IgE的分子结构已清楚，在IgE抗体分子与胞大细胞受体结合的分子表 位，位于抗体分子Fc的C ε 3结构域。虽然针对此区域的单克隆抗体已经FDA批准上 市并在临床应用中显示出了良好的效果，但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了其广 泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对该蛋白的主动免疫疫苗有着更 好的应用前景。研究构建能够诱导出针对IgE受体结合位点(C ε 3结构域)特异性中和 抗体的治疗性疫苗，通过抗原抗体封闭IgE Fc片段上与IgE Fc受体结合的部位，进而阻断由IgE介导的变态反应性疾病效应途径，为IgE介导性疾病的治疗提供新的途径。在本发明的优选实施例中，用化学合成方法合成了小鼠IgEFc的C ε 3结构域特 异的多肽。序列为GYGYQCIVDHPDFPKPIVRSITKTPGQR。该多肽相应单克隆抗体
被证实能阻断IgE与肥大细胞受体结合并对过敏性疾病治疗有效。微球材料为PLGA/壳 聚糖，包裹鸡卵白蛋白作为免疫载体。戊二醛方法将多肽偶联微球。按实例1的方法免 疫小鼠和测定抗体。结果显示6周后小鼠IgE C ε 3结构域多肽抗体滴度大于32000。优于目前常 用即与BSA化学交联常规方案。因此，本发明的微球为过敏性疾病提供了免疫治疗的基 石出。根据本发明的一个优选实施例，提供一种表皮生长因子受体III型突变体 (EGFRvIII)构建的微球。表皮生长因子受体III突变体(EGFRvIII)是EGFR最常见的一 种缺失型突变体。相对于野生型E G F R蛋白而言，EGFRvIII在其胞外段缺失了 256个 氨基酸从而失去了和配体结合的功能，但是在不和配体结合的情况下其胞内段也可以发 生组成性磷酸化并激活下游信号通路。研究表明，EGFRvIII仅在肿瘤细胞上表达，如脑 胶质瘤，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等，在正常细胞检测不到EGFRvIII的存在。体外体 内实验证明EGFRvIII的表达可以促进细胞转化，肿瘤细胞增殖和侵袭，并与肿瘤病人的 预后密切相关。因此EGFRvIII是一个肿瘤诊断及治疗的理想靶点。针对EGFRvIII的抗体可被应用于临床治疗，由于正常组织不表达EGFRvIII，所 以EGFRvIII抗体的特异性更强。YlO是特异针对人EGFRvIII的一种鼠源性抗体，可同 时识别人和鼠的肿瘤特异抗原。体外研究发现，YIO可以抑制肿瘤DNA合成和细胞增 殖，可产生补体或抗体介导的细胞毒作用。腹腔注射YlO可使稳定表达EGFRvIII的B16 黑色素瘤小鼠动物模型长期生存(η = 20 ； P < 0.001)。YlO在体内作用机制可能依赖于 Fc受体。单克隆抗体mAb806是用表达EGFRv m的成纤维细胞NR6免疫小鼠来制备 的。mAb806显著抑制表达EGFRvIII的U87MG移植荷瘤鼠的肿瘤生长，呈剂量依赖 方式；它同时也可抑制EGFR过表达的A431细胞移植荷瘤鼠的肿瘤生长，正常组织中 没有EGFRvIII，所含有的肿瘤相关抗正常组织中没有EGFRvIII所含有的肿瘤相关抗原 表位，所以此表位可以作为肿瘤疫苗的一个潜在靶标。针对EGFRvIII抗原表位触发 的反应，包括体液免疫与细胞免疫反应。eimberger等用单一肽段偶联血蓝蛋白免疫小 鼠后，皮下接种肿瘤细胞，结果免疫后小鼠70%未见肿瘤生长，肿瘤生长显著低于对 照组(P < 0.05)。将免疫鼠血清转移到未免疫鼠体内可以阻止31%小鼠的肿瘤生长P < 0.05)，其机制可能与抗体介导的细胞毒作用有关。Ciesielski等将EGFRvIII特异表 位(LEEKK-GNYVVTDH)的多个拷贝，用赖氨酸作为桥梁连接起来形成的多重抗原多肽 (multiple antigenic peptide)免疫Fisher大鼠，并检测其细胞免疫效应。多重抗原多肽免疫 主要产生特异针对表达EGFRvIII靶抗原的F98胶质瘤细胞的抗肿瘤细胞免疫反应。在本发明的优选实施例中，首先合成人源EGFRVIII特异表位多肽。序列为 CGADSYEMEEDGVRKC。 该多肽相应抗体已证实对肿瘤治疗有效。EGFRvIII多 肽-PLGA微球构建按实例2方法实施。在通过氨基连接于PLGA/壳聚糖微球(含有 BSA+OVA作为免疫载体)。按实例1的方法免疫小鼠和测定抗体。
结果显示6周后EGFRvIII特异表位多肽抗体滴度。微球疫苗获得良好效果， 血清抗体滴度大于32000。根据本发明的一个优选实施例，提供一种表皮生长因子受体HER2/neu构建的免 疫微球。HER2/neu是表皮生长因子受体家族的第二位成员。表皮生长因子受体(EGFR) 家族，也称为HER或ErbB2家族，在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化 及存活的重要调节者。此家族包括EGFR (HERI或ErbBi)、HER2/neu (neu或ErbB2)、 HER3(ErbB3)及HER4(tyro2或Erb_B4)，人HER2/neu基因定位于17号染色体短臂，表 达产物为分子量185kDa的单链跨膜糖蛋白，含有1255个氨基酸残基，细胞内段(ICD) 具有酪氨酸激酶活性。HER2/neu通过多种细胞内分子参与信号传导，其主要下游物质包 括丝裂原活化已知有9种配体能直接与EGFR、HER3或HER4结合，在组织中EGFR家 族成员很少单独表达.而是形成不同组台，构成同源或异源二聚体，放大信号转导而发挥 生物学作用由HER2/neu组成的受体复合物比其他受体联合更有效。因为①HER2受体 复合物具有较高的配体结合能力，且内化率低能在浆膜上停留更长时间，延长受体信号 传导的持续时间；②HER2是一种非常活跃的酪氨酸激酶，其自身突变及过度表达也能 产生结构上活化。通常情况下，HER2/neu只在胎儿时期表达，到成年以后，用免疫组 化染色只能在极少组织内发现其低水平表达于细胞表面。在人类癌症，HER2/neu的分子 改变通常是正常基因产物的过度表达。多种人类癌症存在HER2/neu过度表达，如乳腺 癌(25 30)、卵巢癌(25 32)、肺腺癌(30 35)、原发性肾细胞癌(30 40)等由于 HER2/neu蛋白定位于浆膜，即使中等水平HER2过度表达也能产生受体结构上活化。免 疫组化染色发现乳腺癌细胞的HER2蛋白水平比邻近正常乳腺上皮高10 100倍。人类 肿瘤常见HER2/neu扩增及过度表达，表明HER2/neu在肿瘤发生中起重要作用。HER2/ neu的过度表达通过启动多种转移相关机制而增加转移能力.包括细胞迁移率、体外侵袭 力、IV型腔原酶活性、实验性肺转移等。HER2/rieu过度表达也影响某些粘附分子如上 皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)等合成.从而促进转移。HER2/neu过度表达乳腺癌细胞对 雌激素治疗不敏感。HER2/neu过度表达肿瘤细胞对某些化疗药物治疗也不敏感。Tsai 等人在20种非小细胞肺癌细胞系中发现原发化疗耐药与HER2/neu表达显著相关。HER2 过度表达诱导乳腺癌细胞对紫杉醇、紫杉萜耐药。HER2/neu蛋白是癌症主动免疫治疗的 理想靶点。因为HER2/neu蛋白与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中一种生物学相关 蛋白；某些肿瘤病人存在HER2/neu特异性抗体，表明HER2/neu疫苗能诱导免疫反应； 已证明被动免疫疗法如HER2/neu抗体抗肿瘤作用，预测主动免疫可能也是有效的。在本发明的一个优选实施例中，首先合成人源HER2特异表位多肽 CQMWAPQ WGPDC O针对该多肽的特异抗体已被证实对肿瘤治疗有效。免疫微球构建 材料为琼脂糖。微球含有BSA+OVA作为免疫载体，多肽抗原用戊二醛通过氨基连接于 琼脂糖/壳聚糖微球。结果显示6周后Her2特异表位多肽构建的免疫微球免疫小鼠血清抗体滴度大 于32000。 比常规BSA_Her2方法高5倍以上。


图1是免疫微球模拟图，其中1表示免疫载体蛋白，2表示疫苗抗原。
图2是表皮生长因子构建的微球免疫小鼠血清中EGF抗体测定结果图，其中横 坐标表示血清稀释比例，纵坐标表示OD450值，每组柱状图中的A表示实验组，B表示 对照组，C表示空白。图3是表皮生长因子(EGF)构建的微球的West-blot检测结果图，其中3表示 BSA, 4 表示 EGF。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明不仅局限 于实施例。实施例1包裹牛血清白蛋白的硅藻酸钙/壳聚糖微球制备一、包裹牛血清白蛋白(BSA)的硅藻酸钙微球制备海藻酸钠(sodium alginate) 2g溶于90ml双蒸水中，加牛血清白蛋白(BSA)至终 浓lmg/ml。0.5M NaOH调PH至7.3，加水定容至IOOml配置成2% (m/v)溶液。氯化 钙(CaC12)配制成10% (m/v)溶液。2%海藻酸钠溶液4ml气泵喷笔雾化喷入IOOml氯 化钙溶液中，500转/分磁力搅拌成球。磁力搅拌平衡lh，离心收集微球，双蒸水搅拌 平衡lh，离心洗涤3次。显微镜检视大小和微球均一性。根据红细胞大小对照判断微球直径约为5-8微 米，显微镜观察分散性良好。相同方法制备不含BSA的海藻酸钙微球用于对照试验。微球直径大小与上述相 似。显微镜观察分散性良好二、微球中BSA含量测定Iml微球悬浮于5ml、0.1M、pH7.6的磷酸缓冲液中。二小时后海藻酸钙微球解 体溶介。BSA释放于溶液中，测定BSA的紫外光吸收OD2SO。浓度lmg/ml的OD28tl 值为0.56。按此推算，微球中BSA浓度约为0.75mg/ml。三、包复壳聚糖的海藻酸钙微囊制备该步骤的目的是在包裹蛋白的外表面引入可以偶联蛋白的氨基，同时用壳聚糖 包复微球表面克服蛋白从微球中漏出壳聚糖(chitosan)MW 18000 20000取0.5g溶于醋酸溶液，定容至 100ml，终浓度为 0.5% (m/v)。藻酸钙微球与0.5%壳聚糖溶液混合，室温磁力搅拌4小时。离心收集微囊，振 荡器打散缓慢加入生理盐水至悬液，离心收集微囊，洗涤重复5次。包复壳聚糖的微球分散性较海藻酸钙微球略差但满足实验要求。四、聚糖氨基定量1.三硝基苯磺酸钠(TNBS)可与壳聚糖中游离氨基产生橙红色反应，加入终止液 后335nm比色。按消光系数(E335 = 14000)计算氨基浓度2.TNBS (5% m/v)稀释到0.01% (m/v)工作液。反应缓冲液为PH8.50.1M碳酸
缓冲液。3.不含有BSA的微球用于氨基测定，因蛋白氨基同时显色。微球体积定量微 球悬生理盐水，用带刻度的离心管中1000转/分离心。观察离心后的微球体积(以下称之谓压积)，然后根据需要稀释到需要浓度。以下微球的百分浓度均为压积百分浓度4、10%微球样品取样 2ml，加入 0.01 % (m/v) TNBS 0.5ml，于 37°C水浴 2h，再 加入0.5ml 10% SDS和0.25ml IM盐酸终止。5分钟后于335nm比色。测得OD335 = 0.75。5、氨基估算(0.75+ 14000 X 6.023 X IO23) + 微球数 / 升海藻酸钙微球接近红细胞大小，估算约为2000万/μ ，即按2Χ1013/升计算。 每个微球估算大约有150000个氨基。以下微球氨基测算均以此方法。实例2、包裹卵白蛋白(OVA)的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)/壳聚糖微球制备本实施例中所采用的微球制备操作可参考文献(1)载药微球的制备、表征与 体外缓释研究；清华大学研究生论文(2008)王逸蔚，崔福斋。(2)聚乳酸微球的制备； 吉林大学学报(理学版)V ol.43N ο.6Νον 2005 842-846。一、聚乳酸-乙醇酸共聚物购于SIGMA公司(成份比为50 50)，IOOmg溶 于5mL有机溶剂二氯甲烷中。秤取5mgOVA，干粉用细菌研磨器将OVA颗粒研细。悬 浮于含有PLGA的有机溶剂。并缓慢倒入50mL含聚乙烯醇(PVA)的水相中，冰浴 下以300W功率超声乳化30s。随后将复乳倒入150mL双蒸水中常压磁力搅拌5h以挥发 有机溶剂，15000r/min离心IOmin收集，去离子水洗涤3次，冷冻干燥48h去除微球中水 分，于-20°C保存。显微镜下观察微球粒径，根据视觉粒径及显微放大倍数判断，重复制备的微球 平均粒径均为2.0 3.0 μ m。分散性良好二、微球包裹OVA含量测定Iml用于测定的微球悬于3ml 二氯甲烷，轻轻震摇使微球溶解，加入3ml0.1M、 pH7.2的磷酸缓冲液溶介OVA。离心取上层水相测定OD280。lmg/ml为E2800.74。结 果显示，PLGA微球中OVA浓度约为0.9mg/ml三、PLGA微球包复壳聚糖。操作条件如实例1。TNBS比色法测定氨基，估 算大约每亇微球有30000个氨基四、包裹BSA的PLGA微球操作条件与上相同，仅用BSA取代OVA蛋白。五、包裹BSA+OVA的PLGA微球操作条件与上相同，用BSA+OVA蛋白代替单
一蛋白。实例3包裹BSA的琼脂糖微球制备一、制备方法低凝固温度琼脂糖购于SIGMA公司。琼脂糖用蒸馏水加热熔 化，浓度为4%。执置于45C度水浴。BSA溶解于0.05MPH7.2磷酸缓冲液中，浓度为 0.2%。等体积蛋白溶液与琼脂糖混合使最终浓度琼脂糖为2%，蛋白浓度为与0.5%。微球制备用膜乳法制备，其具体操作可参考文献快速膜乳化法制备粒径均一 的PLGA微球和微囊。田瑞，王连艳等。过程工程学报Vol.9No.4。2009年8月。 754-761。膜乳化法制备微球是将溶化的琼脂糖在高压不通过陶瓷膜微孔(孔径0.1-5微 米)分散进入油相形成微球。油相成份为含有2% SPAN80的食用豆油。陶瓷膜孔径为 0.5微米，乳化时油温保持45度。磁力搅拌下获得1-3微米的含有蛋白的琼脂糖微球。 撤去加热后使冷却到室温使琼脂糖微球凝固。离心收集微球。微球用25-75%逐步增加酒精浓度在低温下(0-5度)洗涤除去油相成份并固定蛋白。二、微球镜检结果根据视觉粒径及显微放大倍数判断，制备的微球平均粒径 均为2.0-3.0 μ m。分散性良好。三、蛋白含量测定IOOmg乙醇干燥的微球悬浮于5.0ml磷酸缓冲液(0.05M pH7.2)中。冰箱中放置 48小时使蛋白充分释放于溶液中。OD2SO测定卵白蛋白含量。结果显示每IOOmg干微 球含卵白蛋白2.5mg四、包的复壳聚糖的结果方法与实例3相同，用不含蛋白的微球做包复壳聚糖氨基测定(蛋白干扰氨基测 定)。估算每亇微球(按平均直经2.5微米计)含有壳聚糖氨基大于30000个五、包裹OVAA的琼脂微球操作条件与上相同，仅用OVA取代BSA蛋白。六、包裹BSA+OVA的琼脂微球操作条件与上相同，用BSA+OVA蛋白代替单一 蛋白。实例4微球与抗原蛋白的连接一戊二醛方法连接一、以EGF为例说明微球与抗原的偶联二、取洗涤过的海藻酸钙/壳聚糖微球离心压积0.5ml重悬于2.5ml的碳酸缓冲 液(0.1M、pH8.5)。加入2.5ml 0.5%戊二醛，室温混合2h活化后离心收集洗涤3次。三、微球重新悬于3ml的碳酸缓冲液中。加入500微克小鼠来源mEGF (sigma 公司)。置于混合器上冰箱中混合反应4小时后，加入乙醇胺100微升封闭余下戊二醛基 团。然后用生理盐水洗涤三次。四、微球偶联EGF结果抗小鼠EGF抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素(Avidin) TMB显色底物工作液 购于武汉新启迪生物科技有限公司。EGF-海藻酸钙微球悬浮于试管中，按操作说明书相 继加入Biotin-EGF抗体、HRP_avidin、TMB。用肉眼及显微镜可观察到微球显兰色。
实例5EGF微球疫苗动物试验结果一.动物免疫1.20只昆明种小鼠随机分为3组实验组8只，对照组8只，空白组4只。2.免疫微囊以生理盐水重悬。实验组注射含BSA的微囊，2% (ν/ν)微囊0.1ml 尾经脉注射；10% (V/V)0.2ml背部皮下多点免疫注射。对照组注射不含BSA的微囊， 方法同上。空白组注射生理盐水，方法同上。3.初免后14d再次免疫一次，10日后小鼠处死，眼球采血，分离血清。二 .ELISA 检测抗体l.mEGF和BSA分别以0.05M PH9.6碳酸缓冲液配制20ug/ml包被液，0.1ml每
孔过夜包被酶标板。2.PBST洗涤3次，每孔以0.3ml无蛋白封闭液室温封闭2h。3.洗涤3次分别加入梯度稀释的小鼠血清各0.1ml，37°C孵育2h。4.PBST洗涤5次加入1 2000兔抗鼠-HRP每孔0.1ml，室温孵育lh。洗涤5 次后分别加入O.lmlTMB显色，显色15min各加入50ul IM硫酸三、动物试验结果
EGF抗体测定结果见图2。
EGF抗体平均滴度为8000。
四1West—blot检测
1．mEGF和BSA分别以20ug上样做SDS—PAGE电泳。
2．100mA恒流转膜lh。
3．无蛋白封闭液封闭2h。
4．1500小鼠血清37℃结合2h。
5．PBST洗涤5次加入l2000兔抗鼠一HRP，室温孵育lh。
6．洗涤5次，加入DAB显色
7．结果如图3，实验组小鼠产生抗BSA和mEGF抗体。
在BSA及EGF电泳位置显色。
实施例6血管生长因子(VEGF)构建的微球
一1鼠源血管内皮细胞生长因子(mVEGF)购于sigma公司。
PLGA／壳聚糖微球制备见实例2。
mVEGF与微球的偶联用戊二醛方法连接。
见实施例4。[Ol 23] 二1偶联结果鉴定
用于鉴定异硫氢酸荧光素标记兔抗小鼠VEGF多克隆抗体，购于上海晶天生物科技有限公司。
按说明书操作用荧光标记抗体检测微球表面的mVEGF。
用荧光显微镜观察结果。
在荧光显微镜视野下可见微球发明亮荧光。
实验小鼠(昆明种，来自上海实验动物中心)分四组，每组七只小鼠[Ol 27] l1lo％mVEGF一微球(PLGA微球包含有OVA)静脉注射免疫
2110％mVEGF一微球(PLGA空白微球)静脉注射免疫
31lo u g mVEGF用Friend佐剂常规皮下注射免疫[Ol 30] 41没有任何处理的小鼠血清为阴性血清对照
低速离心压积为o．5ml免疫微球悬浮于5ml PBS中。
注射量为100微升第一次免疫后周后加强免疫，以后每周加强一次。
六周后摘眼球取血。
常规ELISA方法测定血清中抗体滴度。
结果见表l[Ol 32] 表1VEGF微球免疫小鼠血清抗体测定(OD450±SD)
权利要求
1.一种克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其包括微球介质，其特征在于，所述微球 介质外部包覆有疫苗抗原，所述微球介质内部包裹有用于活化T细胞的免疫载体蛋白。
2.如权利要求1所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述疫苗抗原 的B细胞表位位于所述免疫微球的表面，所述免疫载体蛋白的T细胞表位位于所述免疫 微球的内部，从而实现B细胞表位与T细胞表位的物理隔离。
3.如权利要求1所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述的免疫载 体蛋白选自嘁血蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、基因工程表达的破伤风病毒蛋白片 断、乙肝病毒壳蛋白、脑膜炎球菌蛋白、HIV外壳蛋白、感冒病毒蛋白。
4.如权利要求1所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述的疫苗 抗原选自表皮生长因子、血管生长因子、血管生长因子受体、IgE、表皮生长因子受体 EGFR及突变体、表皮生长因子受体肿瘤坏死因子、转化生长因子血管紧张素、CD20。
5.如权利要求1所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述微球介质 选自海藻酸钙、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸、琼脂糖、葡聚糖、蛋白。
6.如权利要求1所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述疫苗抗原 通过常规化学方法与所述微球介质偶联。
7.如权利要求6所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，利用双功能交 联试剂实现氨基-氨基、羧基-氨基、氨基-锍基的偶联。
8.如权利要求7所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，利用戊二醛试 剂实现氨基与氨基的偶联。
9.如权利要求1-8中任一项所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制备上的应用。
10.如权利要求1-8中任一项所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球在免疫佐剂上的应用。
全文摘要
本发明涉及一种克服B细胞免疫耐受的免疫微球及其应用，所述免疫微球包括微球介质，微球介质外部包覆有疫苗抗原，所述微球介质内部包裹有用于活化T细胞的免疫载体蛋白。所述的克服B细胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制备和免疫佐剂上的应用。通过上述技术方案，本发明提供的免疫微球通过抗原与B细受体结合被B细胞吞噬，载体蛋白在细胞内释放、降解；并通过B细胞MHC II提呈给Th细胞，激活Th细胞释放细胞因子，从而促使B细胞活化、增殖；经过亲和力成熟过程产生高滴度抗体。通过将抗原蛋白及免疫载体蛋白分置于微球表面及内部，避免了抗原蛋白表位与Th细胞活化表位同B细胞受体的竞争。
文档编号A61K39/39GK102008719SQ20101057127
公开日2011年4月13日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者张尚权, 谈立松, 陈宇光 申请人:上海微球生物科技有限公司