专利名称：寡核苷酸螯合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸螯合物、其组合物和将寡核苷酸(ON)配制为螯合物的方法以及这些ON螯合物对施用ON的用途。
背景技术：
盐是由酸和碱的相互作用(中和)产生的离子化合物。盐由阳离子和阴离子组成，所述阳离子和阴离子相互作用以便保持电中性状态。阴离子可以是无机的(例如CD或有机的例如乙酸根(ch3coo_)。由于在含水环境中阴离子和阳离子对呈解离状态，含溶解的盐(电解质)的水溶液能够导电。寡核苷酸是聚阴离子并且之前已被认为仅表现为盐，其中其阳离子相对物以解离状态存在于溶液中。对人患者施用ON通常伴随着与存在的核苷酸序列无关的一些广泛的副作用。这些包括血液的抗凝(凝血酶原时间或PTT时间的提高)(Kandmiml Ia等,1998,Bioorgan. Med. Chem. Let. , 8:2103 ；Sheeban 等,Blood, 1998，92:1617 ;Nicklin等，1197, Nucleosides&Nucleotides,16:1145 ;Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech.第2版，第374页)和皮下施用时的注射部位反应或ISR(硬化、炎症、触痛和疼痛)(Webb等，1997，Lancet, 349:9059 ;Schrieber 等，2001，Gastroenterol.，120:1339 ;Seawell等,2002,J.Pharmacol. Exp. Therap. , 303:1334 ；Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech.第 2版，第383页；Raal等，2010, Lancet, 375:998)。抗凝作用被认为是由与凝血级联反应的蛋白质的非序列特异性相互作用介导的。因为ON已经显示出具有免疫刺激特性(通过Toll样受体或TLR-介导的细胞因子诱导)，ISR通常归因于对皮下(SC)注射时需要以小体积(通常为Icc)施用高浓度0N，这被认为在注射部位导致局部炎症。近年来随着基于核酸的治疗的出现，在临床研发中基于ON的化合物的增长数量也得到增加。历史上大多数ON给药方案已采用必须经胃肠道外给予的一周多次剂量或一周单次剂量，因为ON的口服生物利`用度差。因为ON的静脉输注通常由反应性(发热、寒战、虚弱)进行剂量和速率限制并且将是慢性剂量方案中的逻辑需求，最近ON的临床应用已使用皮下(SC)施用途径。这引起最小的全身给药副作用但通常伴随着不同严重程度的注射部位反应(如上所述)，这也限制了通过这种施用途径可实现的给药。因此，提供IV或SC途径施用过程中将减轻反应性的ON制剂将是有用和可取的。此外，虽然认为施用ON的抗凝作用是最小的，但其对消除ON的副作用以为人和非人受试者提供更大的范围的安全性同样是有用的。因此，需要提供一种改善的ON制剂。

发明内容
根据目前的描述，现在提供一种包含由多价阳离子连接的两个或更多个寡核苷酸的寡核苷酸螯合物。进一步提供用于皮下施用的寡核苷酸制剂，该寡核苷酸制剂包含如本文所述的寡核苷酸螯合物。还公开了一种包含本文所述的寡核苷酸螯合物或寡核苷酸制剂以及载体的药物组合物。进一步公开了一种减少与对受试者施用寡核苷酸相关的肝或肾功能障碍的方法，所述方法包括如下步骤对受试者施用作为如本文所述的螯合物的寡核苷酸、如本文所公开的寡核苷酸制剂或如本文所公开的药物组合物。本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来阻抑、抑制或减少由ON引起的血液抗凝的方法。本文还公开了通过制备作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来改善通过IV输注施用的任何ON的耐受性的
方法。
本文公开了用于阻抑或减少施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物时的注射部位反应的方法。特别地，通过皮下施用所述0N。本文公开了通过提供作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来阻抑金属与通过任何途径施用的任何ON螯合的方法。本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来减少任何ON的血清半衰期的方法。本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来减少血清蛋白质与任何ON相互作用的方法。特别地，通过IV输注对受试者施用该寡核苷酸螯合物、制剂或组合物。本文还公开了一种寡核苷酸制剂，其中在寡核苷酸使用时给寡核苷酸提供来自下列任何一种的二价金属阳离子源作为ON螯合物钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和/或锌。因此本文描述了包含钙的寡核苷酸制剂；包含镁的寡核苷酸制剂；包含钴的寡核苷酸制剂；包含铁(2+)的寡核苷酸制剂；包含锰的寡核苷酸制剂；包含铜的寡核苷酸制剂；包含锌的寡核苷酸制剂。本文公开了单独或组合使用以下任何金属阳离子制备ON金属螯合物的方法钙、镁、钴、铁、猛、钡、镍、铜和/或锌。还公开了一种制备如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括将任何寡核苷酸钠盐溶解在药学上可接受的水性赋形剂中，并且逐渐地将二价金属盐溶液加入到溶解的寡核苷酸中，以使该寡核苷酸螯合物保持溶解性。本文公开了一种在受试者体内使用寡核苷酸钠盐螯合以下二价金属阳离子的方法丐、镁、钴、铁、猛、钡、镍、铜、锌、镉、萊、铅、铍、银、错和/或任何其他金属、过渡金属、后过渡金属、能够以2+或3+电荷状态存在的镧系元素或锕系元素。本文还公开了一种通过制备作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来改善任何ON在溶液中的稳定性的方法。特别地，公开了一种使寡核苷酸在水溶液中稳定的方法。本文涵盖多价阳离子是二价阳离子。本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的碱土金属。本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的过渡或后过渡金属。本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的镧系金属。本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的锕系金属。二价阳离子可以是，单独或组合的钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和/或锌。特别地，·本文所述的螯合物可以包含两种或更多种不同的二价金属阳离子。在进一步的实施方案中，该螯合物包含至少一种双链寡核苷酸。在另一个实施方案中，该螯合物包含至少一种具有一个硫代磷酸键的寡核苷酸。该螯合物还可以包含至少一种完全硫代磷酸化的寡核苷酸。该螯合物还可以包含至少一种具有一个2’修饰核糖的寡核苷酸。该螯合物还可以包含至少一种每个核糖经2’ 0-甲基化的寡核苷酸。在一个实施方案中，该螯合物或制剂适于皮下施用，适于至少以下施用途径眼内、口服、肠溶、吸入、皮肤注射、肌内注射、腹腔内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉注射、静脉输注和局部施用。特别地，吸入施用可以是气雾剂。进一步涵盖寡核苷酸由SEQ ID NO:3至14组成。进一步涵盖在添加金属盐之前溶解的寡核苷酸浓度是0. 01-100mg/mlo特别地，加入到溶解的寡核苷酸中的金属盐的比例可以是每IOOmg寡核苷酸为0. l-40mg 二价盐。进一步涵盖寡核昔酸终浓度是0. l-lOOmg/ml。在进一步的实施方案中，该金属盐是以下中的至少一种盐酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐和丙酸盐。在另一个实施方案中，该金属盐溶液包含以下中的至少一种钙、镁、钴、铁(2+)、锰、铜和/或锌。本文还涵盖螯合物是钙螯合物；镁螯合物；或混合的镁/钙螯合物。还提供了如本文所述的多价阳离子在制备寡核苷酸螯合物中的用途。另外提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用的用途。提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于阻抑或减少所述皮下施用寡核苷酸的受试者中的皮下注射部位反应的用途。还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于改善通过IV输注施用时受试者中寡核苷酸的耐受性的用途。还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少对受试者通过IV输注施用时寡核苷酸的血清蛋白质相互作用的用途。进一步提供如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少受试者中的寡核苷酸的血清半衰期的用途。
还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少与在受试者中施用寡核苷酸相关的肝或肾功能障碍的用途。还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于使寡核苷酸在水溶液中稳定的用途。表述“抗凝”意指正常血凝集或血块形成的抑制。表述“螯合”意指通过另一种分子从游离溶液反应中掩蔽或移除反离子(负或正)，所述另一种分子能够与反离子结合形成螯合的络合物。表述“二价金属阳离子”是指以2+电荷状态自然存在并且包括碱土金属(根据IUPAC命名法的第2族元素)、过渡金属、后过渡金属、类金属或镧系元素的任何金属阳离子。表述“三价金属阳离子”是指以3+电荷状态自然存在并且包括过渡金属、后过渡金属、类金属、镧系元素或锕系元素的任何金属阳离子。


现在将参照附图图1示出ON的一般生理化学特征。A)通过高效液相色谱共分离REP 2006和具有确定序列的21mer硫代磷酸ON。B)通过质谱鉴定21mer ON中的种类。C)通过质谱鉴定REP 2006 ON中的种类。图2示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钙螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL)、IOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2 ’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO: 4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钙与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钙螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图3示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镁螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL,SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镁与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镁螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图4示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钴螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL,SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钴与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钴螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图5示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铁螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铁与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铁螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图6示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-锰螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化锰与FIT C-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-锰螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图7示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钡螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钡与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钡螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图8示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镍螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镍与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镍螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图9示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铜螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铜与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铜螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图10示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-锌螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化锌与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-锌螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图11示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镉螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镉与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镉螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图12示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-汞螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON 。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化汞与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-汞螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。
图13示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铅螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸 ON 为A)各种大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铅与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铅螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图14A示出不依赖ON序列的ON的一般化学性质。无论序列如何，任何ON作为聚合物存在，其同时具有疏水和亲水活性。硫代磷酸化(该图中的化学结构所示)用于增加该ON聚合物的疏水性，但不影响亲水性。图14B将二价和三价金属阳离子的寡核苷酸螯合的性质概念化。金属阳离子(以灰色实心圆圈表示)通过磷酸二酯键中两个或三个非桥氧或硫原子之间的金属离子桥(以椭圆表示)连接ON聚合物的亲水性表面。图15示出在二价金属阳离子存在下的不同ON和二价金属阳离子浓度的ON的溶液行为的模型。A)低二价/三价金属阳离子、低ON浓度产生二聚体或低阶ON螯合物。B)增加二价/三价金属阳离子浓度在溶液中产生更完全的ON螯合物形成。C)在二价或三价金属存在下随着金属浓度的增加进一步增加ON浓度能够产生更高阶的ON螯合物。(A)至(C)中所有螯合物在水溶液中是可溶的，由于其具有仍暴露在含水环境的亲水性表面因此保持溶解度。D)在足够的ON和金属浓度时，现在所有亲水性表面被限制在该ON螯合物内，仅留下暴露在含水环境的疏水性表面。这导致ON螯合物的沉淀。图16示出荧光-ON螯合物的溶液行为对荧光偏振的影响。随着金属浓度的增加，ON螯合物形成的大小(和质量)也增加(见图15)并且因此在溶液中翻滚更慢。该络合物在溶液中的这种较慢翻滚导致荧光偏振增加和mP值增加。

图17示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO:7)形成 ON 螯合物。B)用 REP2033-FL(SEQ ID NO: 5)和REP 2029_FL(SEQ ID NO: 2)形成ON螯合物。值表示重复测量的
平均值+/_标准偏差。图18示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP2028-FL没有形成ON螯合物和用REP 2057_FL(SEQ ID NO:8)形成ON螯合物。B)用REP2120-FL和REP 2030-FL形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图19示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID N0:12)和 REP 2126_FL(SEQ ID NO:9)形成 ON 螯合物。B)用 REP2128-FL(SEQ ID NO: 11)和 REP 2127_FL(SEQ IDNO: 10)形成 ON 螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图20示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO: 13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用 REP 2045-FL和 REP 2007-FL
形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图21示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO:7)形成 ON 螯合物。B)用 REP2033-FL(SEQ ID NO:5)和 REP 2029_FL(SEQ ID NO: 12)形成 ON 螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图22示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP2028-FL(SEQ ID NO: 11)没有形成 ON 螯合物，且用 REP 2057_FL(SEQ ID NO:8)形成 ON 螯合物。B)用REP 2120-FL和REP 2030_FL(SEQ ID NO: 3)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图23示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID N0:12)和 REP 2126_FL(SEQ ID NO:9)形成 ON 螯合物。B)用 REP2128-FL(SEQ ID NO: 11)和 REP 2127_FL(SEQ IDNO: 10)形成 ON 螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图24示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO: 13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用 REP 2045-FL和REP 2007-FL
形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/_标准偏差。图25示出如通过荧光偏振所测量，在氯化钙或氯化镁存在下形成两种不同的双链 ON 螯合物。通过 REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2033_FL(SEQ ID NO: 5)杂交以及REP 2057-FL(SEQ ID NO:8)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO: 7)杂交制备双链 ON。值表示三次
重复测量的平均值+/_标准偏差。图26示出仅在二价金属阳离子(Mg2+和Ca2+)存在下而不是在一价阳离子(Na+、K+或NH4+)存在时，形成不同的ON螯合物。值表示三次重复测量的平均值+/_标准偏差。图27示出向人血液 添加不同大小(REP 2004，REP 2006)和不同化学成分(REP2006，REP 2107)的各种浓度的ON的抗凝作用。通过使用简并寡核苷酸(REP 2004，REP2006，REP2107)证明该相互作用的非序列依赖方式，但也使用序列特异性的寡核苷酸(REP2031 ;SEQ ID N0:4)得到证明。采用公认的临床实验室测试方法，通过测量凝血酶原时间(PTT)并将其与血液中生理盐水存在下的PTT进行比较来监测这些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在药物时的PTT的比值产生归一化比值(NR)。NR为I表明正常血液凝集活性并且NR大于I表明血液凝集活性已减弱(抗凝)。图28示出通过添加CaCl2阻抑寡核苷酸的抗凝作用。将REP2055 (具有序列(AC) 20的40mer硫代磷酸；SEQ ID NO:6)以2. 5mM添加至血液，该浓度诱导显著的血液抗凝。将REP 2055与CaCl2的各种组合相结合并且使用公认的临床实验室测试方法测定添加的每种浓度的CaCl2的作用。使用公认的测试方法，通过测量凝血酶原时间(PTT)并将其与血液中生理盐水存在下的PTT进行比较来监测这些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在药物时的PTT的比值产生归一化比值(NR)。NR为I表明正常血液凝集活性并且NR大于I表明血液凝集活性已减弱(抗凝)。图29示出在患有慢性肝病的患者中长期ON治疗对总血清钙的钙螯合作用。未接受矿物质补充剂的患者如(A)所示,而接受补充剂同时经历ON治疗的患者如(B)所示。
具体实施例方式本文提供了以下证明，ON螯合不同的二价金属阳离子，包括钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞和铅。进一步证明这些二价阳离子的螯合导致形成由通过金属阳离子连接的两个或更多个ON组成的ON螯合物，并且例如，但不限于，在长度在6和80之间的核苷酸的0N，并且在磷酸二酯或硫代磷酸寡核苷酸存在下发生。螯合还同样伴随在核糖含有2’修饰的或不含修饰的寡核苷酸发生。此外，金属阳离子的螯合不依赖于所存在的核苷酸的序列，但依赖于所有寡核苷酸共同的生理化学特征(见图14A)。本文提出如下发现，在含有任何简单的二价金属阳离子(例如但不限于，Ca2+、Mg2+、Fe2+)的水溶液中寡核苷酸不是作为盐存在，而是作为ON的螯合的络合物存在。这些络合物由寡核苷酸二聚物或更高阶分子组织组成，其中ON通过二价金属离子桥在其磷酸二酯主链相连(见图14B)。在具体的ON和金属阳离子浓度时，这些螯合的络合物在水溶液中是稳定的和可溶的，并且有效地从溶液相互作用中掩蔽ON螯合物中的任何二价阳离子。这种螯合物形成同样有可能用带3+或更多电荷的简单金属阳离子发生(如图14B所示)。因此ON用作二价阳离子螯合剂并且不与二价阳离子形成盐。重要地是，寡核苷酸螯合物的形成不用一价阳离子例如Na+、K+或NH4+发生，并且因此不大可能用任何一价阳离子发生。因此，术语“寡核苷酸盐”明确地仅限于具有一价阳离子或具有不与寡核苷酸形成螯合物的阳离子的寡核苷酸盐，并且不正确地用于描述以具有二价金属阳离子(或甚至三价金属阳离子)的溶液或粉末形式存在的寡核苷酸。本领域中的标准清晰地教导了仅作为钠盐的ON的施用。这通过在临床试验中施用大量作为钠盐的寡核苷酸进行例证，其中包括Fominirisen (ISIS 2922)、Mipomersen(ISIS 301012)、Trecovirsen(GEM 91)、Custirsen(0GX-011/ISIS 112989)、Genasense(G3139)和 Aprinocarsem(ISIS3531/LY 900003) (Geary 等，2002，Clin.Pharmacokinetics, 41:255-260 ；Yu 等，2009，Clin.Pharmacokinetics,48:39-50 ；Sereni 等，1999，J. Cl in. Pharmacol.，39 : 47-54 ;Chi 等，2005，J. Nat. Cane.1nst. , 97:1287-1296 ;Marshall 等，2004，Ann. Oncol. , 15:1274-1283 ;Grossman 等，2004, Neuro-OncoI, 6:32-40)。本文还提供如下证明，如通过由加入氯化钙来恢复血液中正常的游离钙而逆转寡核苷酸诱导的抗凝所表明，由寡核苷酸引起的血液的抗凝是由寡核苷酸对钙的螯合而导致的。本文还提供如下证明，如通过注射制备为钙螯合物的ON抑制注射部位反应(ISR)所表明，用皮下注射寡核苷酸所观察的注射部位反应(硬化、炎症、触痛和疼痛)至少部分是由于钙和可能其他二价阳离子(例如镁)在注射部位被寡核苷酸局部螯合。荧光偏振是一种常见的用于检验分子间相互作用的方法。在该技术中，用荧光标签(例如FITC)标记诱饵(即任何0N)。在溶液中，由于布朗运动诱饵分子自由地翻滚，这导致当诱饵受到正确波长的光激发时的差偏振荧光发射。使用足够分子量(至少与诱饵的大小相同)的配体，诱饵和配体间的相互作用引入大量络合物在溶液中翻滚的抑制。由于这种溶液中抑制的翻滚，荧光发射在激发后变得显著偏振。因此使用这种技术，可以在溶液中测量相互作用而对任何结合配偶体无物理限制。将荧光偏振报道为无量纲mP，其与反应中所结合的诱饵分子的分数成正比。例如，若很少部分的诱饵分子由特定的配体结合，则将存在很小的荧光偏振，并从而有很小的mP值。在谱的另一端，若大部分诱饵分子由特定的配体(或与更高浓度的配体)结合，则将存在大量的荧光偏振，并从而有大的mP值。以这种方式，可通过在固定量的荧光标记的诱饵存在下改变配体的浓度来产生特定诱饵-配体相互作用的结合等温线。本文采用不同的荧光标记的ON以检验在一价和二价阳离子存在下其络合物的形成。虽然通过荧光偏振监测络合物的形成要求这些ON经荧光标记，但是将标记在3’端附着于ON以便不干扰ON的含氮碱基或磷酸二酯主链是有问题的。此外通过刚性3碳连接基团使荧光标签远离0N,以进一步排除溶液中正常ON行为的任何扰动。因此采用含荧光标记ON的使用荧光偏振在本文观察的任何ON络合物的形成是未标记ON(无论络合或未络合)的溶液行为的准确代表。术语寡核苷酸(ON)指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)和/或其类似物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸以及具有类似地发挥作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。由于其理想的特性，例如，增强的细胞摄取、对靶核酸增强的亲和力和核酸酶存在下增强的稳定性，与其天然形式相比，这种修饰的或取代的寡核苷酸通常是优选的。在本申请中，术语“简并寡核苷酸”意指在每一个位置具有一个摆动(wobble) (N)，例如NNNNNNNNNN的单链寡核苷酸。将每一个碱基合成为一个摆动，如此这种ON实际上以不同的随机产生的相同长度和生理化学性质的序列的群存在。例如，对于40个碱基长度的ON简并物，群中任何特定 序列将理论上代表总部分的1/44°或8. 3X 10_25。鉴于I摩尔=6. 022X IO23个分子，并且迄今没有合成已超过2毫摩尔的简并物的事实，所以具有存在的特定序列的任何寡核苷酸在任何制剂中有效地存在不超过I次。因此在这种制剂中观察的任何络合物的形成必须是由于寡核苷酸的非序列依赖(或不依赖于序列)的生理化学性质，因为具有确定序列的任何特定的寡核苷酸(在制备中是唯一的)不能预期有助于来自其具体核苷酸序列的任何活性。作为这个概念的进一步说明，实施例1通过高效液相色谱和质谱将REP2006 (具有简并硫代磷酸化序列的40mer ON)与确定序列的21mer的特征相比较,并且清晰地显示具有相似大小和化学修饰(即硫代磷酸化)的任何ON将具有高度相似(若不相同)的不受所存在的核苷酸序列影响的生理化学性质。寡核苷酸可以包括各种修饰，例如，稳定化修饰，因此并且可以包括在磷酸二酯键和/或在糖和/或在碱基上的至少一种修饰。例如，寡核苷酸可以包括但不限于，一个或多个硫代磷酸键、二硫代磷酸键和/或甲基磷酸键。不同的化学相容的修饰键可以组合，例如，其中合成条件是化学相容的修饰。虽然修饰的键是有用的，但是寡核苷酸可以包括其中寡核苷酸聚合物的一般生理化学性质基本不受影响的磷酸二酯键。另外有用的修饰包括但不限于，在糖的2’ -位的修饰，例如2’ -0烷基修饰(例如2’ -0-甲基修饰)、2’ -氨基修饰、2’ -卤代修饰(例如2’ -氟代)；无环核苷酸类似物。本领域还已知其他修饰，并且可以用于例如锁核苷酸。特别地，整个寡核苷酸具有修饰的键，例如，硫代磷酸；具有3’-和/或5’ -帽；包括末端3’ -5’键；寡核苷酸是或者包括由被连接基团接合的两个或更多个寡核苷酸序列组成的多联体。还提供了一种药物ON组合物，其使用治疗有效量的药理学上可接受的如本文所述的寡核苷酸螯合物来防止寡核苷酸诱导的抗凝，该螯合物使用以下任何金属阳离子制备钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。还提供了一种药物ON组合物，其防止伴随皮下施用的注射部位反应，所述皮下施用含有治疗有效量的药理学上可接受的如本文所述的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。还提供了一种药物ON组合物，其改善IV输注的耐受性，所述IV输注含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。还提供了一种药·物ON组合物，其使用治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物防止寡核苷酸诱导的钙、镁、铁、锰、铜或锌的缺乏，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。还提供了一种药物ON组合物，其具有改善的储存稳定性，其含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。还提供了一种药物ON组合物，其具有降低的血清半衰期或减少的与血清蛋白质的相互作用，其含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备丐、镁、钴、猛、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。此外，上述组合物可以包括生理上和/或药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂。载体的特征可取决于施用途径。术语“药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂”是指可以对受试者施用，并入本发明的组合物中，并且不破坏其药理学活性的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂。可用于本文所述的药物组合物中的药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和赋形剂包括但不限于下列离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化递药系统(“SEDDS”)、以药物剂型使用的表面活性剂(例如吐温或其他相似的聚合递送基质)、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯卩比咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂、环糊精(例如a-、￠-和Y-环糊精)或化学修饰的衍生物(例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-环糊精的)或其他溶解的衍生物也可以用于增强本发明组合物的递送。本文描述的组合物可以含有如下所述的其他治疗剂，并且可以，例如，根据药物配制领域的技术人员熟知的技术，通过采用常规的固体或液体媒介物或稀释剂，以及适用于预期施用方式的类型的药物添加剂(例如，赋形剂、黏合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)进行配制。本文描述的组合物可以通过任何合适的方式施用，例如，口服，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂或粉末的形式；舌下；口含；胃肠外，例如通过皮下、静脉内、肌内或胸骨内(intrastemal)注射或输注技术(例如，作为无菌可注射水或非水溶液或悬浮液)；经鼻，例如通过吸入喷雾；局部，例如乳膏或软膏形式；或直肠，例如栓剂形式；以含有无毒、药学上可接受的媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。本发明组合物可以，例如，以适合即时释放或延长释放的形式施用。即时释放或延长释放可以通过使用合适的药物组合物实现，或，特别是在延长释放的情况下，通过使用装置(例如皮下植入物或渗透泵)实现。因此，上述组合物可以适于通过以下任何途径施用眼内、口服、肠溶、吸入、皮肤注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射、鞘内注射或输注、气管内、静脉注射或输注或局部施用。用于口服施用的示例性组合物包括悬浮液，其可含有例如，用于提供大量藻酸或藻酸钠作为悬浮剂的微晶纤维素、作为增稠剂的甲基纤维素和甜味剂或调味剂例如本领域已知的那些；并且即时释放片剂可以含有，例如，微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，例如本领域已知的那些。本发明的组合物也可以经由舌下和/或口含施用通过口腔递送。模制片、压制片或冻干片是可以使用的示例性形式。示例性组合物包括用快速溶解的稀释剂例如甘露糖醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精配制本发明的组合物的那些。在这种制剂中也可以包括高分子量的赋形剂例如纤维素(avicel)或聚乙二醇(PEG)。这种制剂也可以包括有助于使粘膜附着的赋形剂，例如羟基丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)和控制释放的试剂，例如聚丙烯酸共聚物(例如，Carbopol934)。为了方便加工和使用，还可以添加润滑剂、助流剂、调味齐[J、着色剂和稳定剂。本文描述的化合物的有效量可以由本领域的普通技术人员确定，并且包括用于成人的示例性剂量即每天约0. l -500mg/kg体重的活性化合物，可以以单剂量或单次分剂量施用，例如每天从I至5次。应理解，对任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以改变并且将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和活动长度、种类、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用的方式和时间、排泄和清除的速率、药物组合以及特定病症的严重程度。对于治疗的优选的受试者包括经受血管生成依赖性或血管生成相关病状的动物，更优选地哺乳动物例如人和家养动物例如狗、猫
坐寸o该药物组合物也可以含有其他增强活性的活性因子和/或活性剂。用于施用的药物组合物和制剂可以包括皮肤药贴、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末和气雾剂。常规的药物载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或需要的。其他制剂包括其中ON与局部递送剂(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合的那些。优选的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基磷酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负(例如，二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰基四甲氨丙基D0TAP、二油酰基磷酰基乙醇胺D0TMA)和其他的递送剂或分子。ON可以包封在脂质体内或可以形成络合物，其中特别是阳离子脂质体。可替代地，ON可以络合至脂质，特别是阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1,烷基酯(例如肉豆蘧酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。通过参照以下的实施例，将会更容易理解本公开。实施例1简并ON的表征图1A详述了同时注入柱中的两种寡核苷酸制剂通过HPLC (使用疏水柱)的分离。这些中的第一种被称为内标，并且是具有具体确定序列的21mer硫代磷酸寡核苷酸，第二种是REP 2006(40mer简并硫代磷酸寡核苷酸)。仅基于其生理化学特性(即大小和疏水性)将这两个种类分离为不同的确定的峰；存在于这些ON每一个中的核苷酸序列对其生理化学特性无重大影响，并且因此对其分离无影响。因此，仅由于这两种ON聚合物大小的不同，与REP 2006比较，该内标作为具有较小保留时间的严格确定的峰从柱中洗脱。请注意REP2006峰的任何一侧的肩是由于在生成较长的寡核苷酸中典型的失效序列。尽管REP 2006的不均匀序列性质，它由HPLC解析为充分确定类似作为21mer特定序列的峰，其说明了 REP2006制剂中所有种类的共同的生理化学性质，尽管存在非常大量的不同序列。REP 2006和21-mer峰经HPLC分离后，这些可以进行质谱分析(MS)以鉴定存在于这些确定峰内的种类(图1B 和 1C)。
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在图1B中，21mer被解析为丽为7402. 6Da的单一种类，与具有确定序列的该PS-ON—致。但是，REP 2006的MS分析(图1C)揭示存在非常大量的种类其质量范围具有近乎完美的正态分布，与其完全地简并性质一致。这个质量范围是从(最小的种类)到A40 (最大的种类)并且这些种类的普遍随着种类数量的增加(峰强度)非常小，因为它们的质量接近质量范围的中心。这是因为越来越大量的不同序列将导致相似的质量。在HPLC分离过程中存在于REP 2006的所有不同的ON种类在疏水柱上具有相同保留时间的事实清晰地证明相同大小和相同化学修饰(即硫代磷酸化)的所有ON将具有高度相似的(若不完全相同)生理化学性质并且因此，可以认为不依赖存在于特定ON分子中的核苷酸的序列关于任何应用或属性中功能相似。因此，用任何特定简并ON (例如REP 2003, REP 2004)观察的任何ON螯合物形成不可能依赖于存在的寡核苷酸的序列并且必须依赖于任何ON的保守生理化学性质。实施例1ION与不同二价金属阳离子形成螯合物通过如上所述的荧光偏振(FP)检验寡核苷酸铵盐与各种二价金属阳离子的相互作用。在寡核苷酸合成过程中，使用完善的试剂和合成方案通过刚性3碳连接基团在3’端将每一种寡核苷酸缀合至异硫氰酸荧光素(FITC)。这些寡核苷酸从合成中裂解并且作为铵盐离开。在该实施例中使用的寡核苷酸在表I中描述。激I实施例1中使用的ON
权利要求
1.一种寡核苷酸螯合物，其包含由多价阳离子连接的两种或更多种寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸螯合物，其中所述多价阳离子是ニ价金属阳离子。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述多价阳离子是呈2+电荷状态的碱土金属。
4.根据权利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ价金属阳离子是呈2+电荷状态的过渡金属。
5.根据权利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ价金属阳离子是呈2+电荷状态的镧系金属。
6.根据权利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ价金属阳离子是呈2+电荷状态的后过渡金属。
7.根据权利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ价金属阳离子是钙、镁、钴、铁(2+)、猛、铜或锌。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含两种或更多种不同的ニ价金属阳离子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー种双链寡核苷酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー种具有一个硫代磷酸键的寡核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー种完全硫代磷酸化的寡核苷酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー种具有ー个2’修饰核糖的寡核苷酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少一种每个核糖均经2’ O-甲基化的寡核苷酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其适于皮下施用。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其适于以下施用途径中的至少眼内、ロ服、肠溶、吸入、皮肤注射、肌内注射、腹腔内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射、静脉输注和局部施用。
16.根据权利要求15所述的寡核苷酸螯合物，其中所述吸入施用是气雾剂。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的寡核苷酸螯合物，其中所述寡核苷酸由SEQID NO:3至14组成。
18.一种用于皮下施用的寡核苷酸制剂，所述寡核苷酸制剂包含根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物。
19.根据权利要求18所述的制剂，其还适于皮下施用。
20.根据权利要求18所述的制剂，其中所述制剂还适于以下施用途径中的至少ー种眼内、ロ服、肠溶、吸入、皮肤注射、皮下注射、肌内注射、颅内注射、颅内输注、腹腔内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉注射、静脉输注和局部施用。
21.根据权利要求20所述的寡核苷酸制剂，其中所述吸入施用是气雾剂。
22.—种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物或权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂以及载体。
23.一种制备根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的方法，所述方法包括将任何寡核苷酸钠盐溶解在药学上可接受的水性赋形剂中，并且逐渐地将ニ价金属盐溶液加入到所述溶解的寡核苷酸中，以使所述寡核苷酸螯合物保持溶解性。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在加入所述金属盐之前所述溶解的寡核苷酸浓度是 0. 01-100mg/ml。
25.根据权利要求23所述的方法，其中加入到所述溶解的寡核苷酸中的金属盐比例是姆IOOmg寡核苷酸为0. l-40mg ニ价盐。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸终浓度是0.1-lOOmg/mlo
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述金属盐是以下中的至少ー种盐酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐和丙酸盐。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述金属盐溶液包含以下中的至少ー种钙、镁、钴、铁(2+)、猛、铜和锌。
29.—种阻抑或減少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
30.一种阻抑或減少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
31.ー种对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
32.—种对受试者通过IV输注施用时减少寡核苷酸的血清蛋白质相互作用的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
33.一种减少受试者体内寡核苷酸的血清半衰期的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
34.一种减少与对受试者施用寡核苷酸相关的肝脏或肾功能障碍的方法，所述方法包括对所述受试者施用作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
35.一种使寡核苷酸在水溶液中稳定的方法,所述方法包括制备作为根据权利要求1至17中任一项所述的螯合物的所述寡核苷酸、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物。
36.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述螯合物是钙螯合物。
37.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述螯合物是镁螯合物。
38.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述螯合物是混合的镁/钙螯合物。
39.多价阳离子在生产寡核苷酸螯合物中的用途。
40.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于阻抑或減少对受试者施用所述寡核苷酸的抗凝作用的用途。
41.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于阻抑或減少所述皮下施用寡核苷酸的受试者的皮下注射部位反应的用途。
42.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于改善通过IV输注施用时受试者中所述寡核苷酸的耐受性的用途。
43.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于减少对受试者通过IV输注施用时寡核苷酸的血清蛋白质相互作用的用途。
44.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于减少受试者中所述寡核苷酸的血清半衰期的用途。
45.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于减少与在受试者中施用所述寡核苷酸相关的肝或肾功能障碍的用途。
46.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸螯合物、根据权利要求18至21中任一项所述的寡核苷酸制剂或根据权利要求22所述的药物组合物用于使寡核苷酸在水溶液中稳定的用途。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸是寡核苷酸钙盐。
48.根据权利要求40至46中任一项所述的用途，包括寡核苷酸钙螯合物。
49.根据权利要求40至46中任一项所述的用途，包括寡核苷酸镁螯合物。
50.根据权利要求40至46中任一项所述的用途，包括混合的钙/镁螯合物。
全文摘要
本公开描述了无论大小或修饰，任何寡核苷酸(ON)与多种二价2+金属阳离子的广泛有效的螯合。该螯合作用对二价(或更高价)的阳离子具有特异性，并且导致不表现得像盐的寡核苷酸螯合物的形成。本文描述了一种使用任何ON和二价金属阳离子制备的ON螯合物的新型组合物以及在施用寡核苷酸过程中通过使用ON螯合物阻抑抗凝和或皮下注射部位反应和或改善寡核苷酸耐受性的方法。
文档编号A61K31/712GK103052405SQ201180035946
公开日2013年4月17日 申请日期2011年8月18日 优先权日2010年8月20日
发明者安德鲁·瓦利恩特, 米歇尔·巴齐内 申请人:里普利科股份有限公司