专利名称：反义多核苷酸的制作方法
同一个基因的有意义链或由它转录的mRNA互补并能杂交的核苷酸寡聚物(寡核苷酸)是反义寡聚物。当一个目标基因的有意义链或一个mRNA暴露于它的反义寡聚物，两者将会杂交，其结果是，只要此寡聚物一直杂交着，那么此基因或mRNA的转录将受到封闭。因而，该基因编码的蛋白质(如果该基因是编码调节蛋白的，那就是一组蛋白质)就不会产生。反义寡聚物因其性质有许多用途。例如依靠它们与目标核苷酸结合的能力，可用于诊断。而且，它们对蛋白质合成的影响使得反义寡聚物在治疗上也有用。反义寡核苷酸的概念及其组成与化学性质已总结在Chemical Reviews 90，544-579(1990)中。
NF-kB转录因子复合物是一个多效激活剂，它参与多种细胞和病毒基因的诱导作用参见(Baeuerle，P.A.，和D.Baltimore(1989)Genes Dev.31689-1698;Lenardo，M.J.，和D.Baltimore(1989)Cell 58227-229).
此活性复合物是由两个亚基组成的，它们称为P50和p65，参见(Baeuerle和Baltimore(supra);Ghosh，S.和D.Baltimore(1990)Nature(London)344678-682).
编码p50的基因已克隆出来，参见
(Ghosh，S.et al.(1990)Cell 621019-1029(Ref.1);Kieran，M.et al.(1990)Cell 621007-1018(Ref.2))和p65(Nolan，G.P.et al.(1991)Cell 64961-969(Ref.3);Ruben，S.et al.(1991)Science 2511490-1493(Ref.4));
并且这两个蛋白质的N-末端显示出与癌基因rel的产物有相当大的同源性。上面提到的参考文献1-4在表Ⅰ(实施例1)中以同样的数码被引用。
许多细胞粘合分子，(CAMs)，包括ICAM-1(Voraberger，G.et al.(1991)Immunol.1472777-2786)，vimentin(Lilienbaum，A.et al.(1990)J.Virol.64256-263)和ELAM-1(Whelan，J.et al.(1991)Nucleic Acids Res.192645-2653)在它们的5′调控区内有NF-kB结合部位。NF-kB可以通过调节这些粘合分子而影响细胞粘合，从而影响细胞生长。
有可能利用细胞的粘合来检测反义功能，例如用反义寡聚物对公认粘合分子和结肠直肠癌(DCC)中缺失的肿瘤抑制基因进行抑制，导致种种细胞的分离。
(Narayanan，R.et al.(1992)Oncogene 7553-561).
细胞与细胞以及细胞与底质间的粘合是通过几个不同的受体家族介导的，这些受体以特殊的细胞外基质(ECM)蛋白和相邻细胞的配基为靶子。
(Albelda，S.M.和C.A.Buck(1990)FASEB J.42868-2880).
这些受体也影响细胞生长、分化、细胞连接形成以及细胞极性的各个方面。
1990，supra;Hynes，R.O.(1992)Cell 6911-25).
在组织培养细胞中，焦点接触(细胞结合到ECM的特殊膜区)的形成包括蛋白多糖如肝素硫酸盐以及多种一体蛋白分子。一体蛋白是杂二聚体分子，它具有细胞与基质和细胞与细胞粘合的两种受体的功能(Albelda和Buck，1990，supra)。免疫球蛋白超基因家族的粘合分子也参与细胞与细胞间粘合。这些分子在胚胎发生、伤口愈合、炎症反应、血凝固和转移中起着重要的作用。
(Albelda和Buck，1990，supra;Hynes 1992，supra).
认识到细胞粘合分子与炎症有关已导致新的治疗方法的产生。特殊细胞粘合分子的单克隆抗体已用于抑制脓毒性休克和局部缺血-再灌注操作中皮肤炎症区的嗜中性募集。
根据本发明，与编码NF-kB转录因子的基因的一部分基本互补并杂交以基本阻止由上述基因决定的NF-kB转录因子产生的任何寡聚物，都能用来防止细胞粘合。细胞粘合在诸如炎症、伤口愈合、肿瘤生长的情况中是一个重要的因素。这些寡聚物有减轻这些症状的治疗应用价值。
与NF-kB基因部分杂交以基本阻止NF-kB复合物形成的寡聚物对防止细胞粘合是有用的。任何与NF-kB基因的这些部分结合的寡聚物会象所描述的那样阻止NF-kB产生。当在暴露于此寡聚物的细胞中NF-kB产物被阻断的时候，细胞会失去粘着于表面的能力。NF-kB基因中所提到的部分，当它们通过杂交封闭时会基本阻止NF-kB合成，具有下列序列或基本上是下列序列GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC [SEQ ID:1]和AGA ATGGCA GAA GAT GAT CCA [SEQ ID:2]要求授权的寡聚物能同编码NF-kB转录因子基团的一部分进行杂交。当这一寡聚物与NF-kB基因的一部分杂交时，该基因的NF-kB产物将会被基本上阻止。基本阻止意味着NF-kB不产生，或者在不起作用的水平上产生。正如在本文使用的一样，与基因结合的含义包括与相应的mRNA结合。NF-kB有两个亚基，叫做p50和p65，由不同的基因编码。其中每一个基因都被认为是编码NF-kB的基因。本文描述的寡聚物能与p50基因或p65基因结合，特别是人的基因。如果p65或p50基因通过与一寡聚物杂交而被封闭，NF-kB转录因子就不会产生。此寡聚物与它们的靶位点基本互补。它们不必反映出靶部位的准确互补序列，但必须是足够的互补，以与靶部位选择性地杂交。
关于寡核苷酸的设计，特别是有关杂交条件的专一性等需要考虑的一般问题，能够在本领域的陈述中找到，例如在Sambrook等编写的《分子克隆·实验室手册》，特别是第二版的第十一章，此书由冷泉港实验室出版(1989)。就本发明的目的而言，应该知道只有具目的核苷酸序列特定长度的寡核苷酸才是合适的。这一序列的最短长度能由本专业的技术人员依据有意义的给定靶序列的足够专一性的通常已知的考虑来确定(见上面Sambrook等所述)。这一序列的最大长度也能由专业人员根据技术中已知的需要来考虑确定，例如，考虑对细胞膜的足够的穿透效率，该效率能通过实验来检测。
特别是，含有或具有GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC [SEQID:3]序列的寡聚物与编码人p65亚基的基因的一部分相结合;含有或具有TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT [SEQID:4]序列的寡聚物与编码人p50的基因的一部分相结合。这些寡聚物也能与在那里互补的相应的mRNA杂交。
优选的寡聚物长度约是21个核苷酸，然而也可用5到50的寡聚物长度。较长寡聚物的一个特点是更高的专一性，然而这一特点应与对稳定性的考虑和易于通过细胞膜相权衡，这样较短的寡聚物更可取。具有根据[SEQID1]到[SEQID4]寡核苷酸序列的寡聚物最优选。
当本文公开的一个寡聚物引入一个细胞时，寡聚物通过与NF-kB基因或NF-kB mRNA的一部分结合，可基本上减少或阻止NF-kB合成。令人吃惊的是，结果该细胞失去了粘着到表面的能力。因此，这些寡聚物作为反义寡聚物是有用的，并且阻止暴露于它们的细胞粘着于表面。一个阻断NF-kB合成及细胞粘合的寡聚物能通过实施例中所述的细胞粘合试验来选择。
这是出人意外的，因为NF-kB是一个转录因子，因而它介导DNA到mRNA的转录，这是所有细胞的一个基本功能。如果阻断NF-kB的合成预料会扰乱一个细胞的代谢并且破坏或杀死细胞。令人惊奇的是处理过的细胞活了下来，但失去了其完成高度专一功能的能力，即粘着于表面的能力。粘合能力的丧失阻止细胞间或细胞与生理底物的粘合。因此，暴露于寡聚物的细胞会改变它们的特性。因为NF-kB是一种在各种细胞和组织中发现的蛋白，本公开的寡聚物将起减低或消除任何能粘着于表面的细胞的粘合作用。
要求授权的寡聚物可以由熟知的方法生产，例如，象实施例中叙述的那样，通过克隆或化学合成生产。寡聚物可以从一个靶基因的序列获得，或从由蛋白序列推断出来的核苷酸序列来获得。
用任何常规的方法生产的寡聚物通过测定它们基本抑制NF-kB合成的能力来筛选。能够与编码NF-kB基因的一部分杂交，进而基本阻止NF-kB合成的寡聚物的测定可通过测定杂交和细胞粘合的任何常规方法来完成。用于此筛选的细胞粘合检测叙述在实施例中。简短地说，能粘着到表面的任何类型的细胞可以在常规条件下生长，例如在培养皿(或任何可培养细胞的合适的容器)培养足够长的时间，让细胞粘着在皿的底部。将一层白明胶或任何其它合适的底物在细胞加入前覆盖在培养皿表面，寡聚物随后加入到培养的细胞中，一段时间后当细胞从培养皿的表面分开时，便观察到寡聚物的预期作用。12到24小时是观察丧失粘合的优选培养时间，然而，或许需要几个星期或更长时间。
阻断细胞粘合的寡聚物可以经修饰来增加其稳定性。组成寡聚物核苷酸的磷酸酯基团可以在像天然核苷酸磷酸酯部分的自由单键氧的位置进行修饰，可以是氧、甲基或硫。这样修饰的寡聚物通过实施例中叙述的常规合成得到。这些取代物的任一个都可以用已知方法通过将合适的分子加入一台自动合成仪中来得到。
因此，提供本发明中寡核苷酸的制备及其修饰方法也是本发明的目的之一，其特征在于将通过固相合成已得到的、经保护的固体支持物结合的相应核苷酸顺序的寡核苷酸脱保护，并从固相裂解下来，如果需要的话，然后进行修饰。脱保护和裂解过程依赖于所合成的寡核苷酸的类型，例如依赖于所用的保护基或如下所示的磷原子上的取代基Y。寡核苷酸，特别是其中的碱基也可以在合成中通过化学修饰或在合成的延长步骤中用已修饰前体(building blocks)在结构上加以修饰。这些过程对专业人员是已知的。
优选的寡聚物有下列简化的结构
碱基代表核苷碱基A、T、C、G。Y选自O-、S-、或甲基。
优选的修饰的寡聚物正如以上所描述的一样，具有下列的碱基序列GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC[SEQID:3]和TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT[SEQID:4]所以，要求授权的寡聚物由具有上面提供序列的核苷酸组成，而且它们的核苷酸是通过化学式为-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯基团连接的，其中Y选自甲基、氧或硫。
因为阻止细胞粘合，要求授权的寡聚物是有用的。正是此特性赋于寡聚物通过阻止细胞粘合反应在治疗炎症、促进伤口愈合以及分解肿瘤上的用途。
本发明的再一目的是提供一种药物组合物，它含有至少一种本发明的寡核苷酸或其修饰物，如果适当的话，还含有治疗上可接受的载体材料。
而且，利用本发明的寡核苷酸及其修饰物来制备上述的药物组合物，即用于阻止细胞粘合或用于诊断目的的药物组合物，也是本发明的一个目的。
就阻止细胞粘合而言，寡聚物可直接注射到血流或靶组织中，然后通过扩散透过细胞膜或经受体进入细胞内，这时它们与上述靶序列杂交。寡聚物可以与像抗体或受体片段那样的靶载体连接，或通过常规的方法包裹在脂质体或胶囊中，以便更有效地被送入细胞内。像叙述的那样，带有用甲基或硫取代的磷酸酯基的寡聚物的修饰导致对酶降解作用更稳定的寡聚物，因此，就治疗目的而言，修饰的寡聚物比同样序列未修饰的寡聚物更优选。另外，修饰的寡聚物比未修饰的寡聚物更易透过细胞膜。
任何施用一个具生物活性化合物的常规方法都可以用于施用有效量的寡聚物。更具体地讲，经修饰或未经修饰的寡聚物可以单独施用，也可通过与合适的药物载体组合或与载体连接来施用。载体的实例包括肽、免疫球蛋白及其片段、脂质体、受体分子、配基分子(如激素)、酶及任何供药用的常规化合物。
有效剂量的寡聚物的给药可以是口服、肠胃外、静脉、皮肤或通过其它传统给药途径给药。包括有效量寡聚物的常规制剂都是本发明天的一部分。寡聚物可以局部地用于阻止靶组织中细胞粘合。
寡聚物的有效剂量可由专业人员根据实验数据确定。例如，治疗部位的有效剂量可以通过提供对单个细胞有效剂量的体外实验确定。这些剂量可以被推断以用于治疗部位的细胞群，并考虑到因部分寡聚物不能到达治疗部位而造成的有效浓度的降低。寡聚物浓度依赖于各种已知的因素，它们包括寡聚物的稳定性(它基于寡聚物自身、长度、修饰及载体)，给药途径和给药媒介物(口服、皮下、胃肠外或静脉给药)，及治疗部位(它决定于生理屏障，如血-脑屏障)。治疗的病情也是一个考虑因素。
在治疗部位寡聚物的优选有效剂量是从约1×10-8M到约1×10-5M。在外用组合物中，所述优选有效量的寡聚物是存在于溶液、乳化液、或带有可接受载体的乳膏或油膏中。
药用赋形剂包括溶液、油膏、片剂、以及任何适合于给定施用模式的常规赋型剂。优选溶液或油膏。除寡聚物和/或它的盐外，溶液还可包括缓冲剂(如生理盐水)，稳定剂(如BSA)，以及其它常规成分。供局部应用的油膏、乳膏、乳化液、洗剂及香波包括已知的成分。
本发明的寡聚物可被用来治疗与细胞粘合有关的病症。
炎症是由细胞对底物和其它细胞的粘合而介导的。因此，防止细胞粘合会减轻局部炎症。所以，治疗炎症的方法包括给病人施用足以减轻炎症的一定量的要求授权的寡聚物。在炎症部位，寡聚物的优选存放浓度为约1×10-8M到1×10-5M。优选局部给药。伤口愈合也受细胞粘合的影响，因此，为了伤口愈合，要求授权的寡聚物可以完全按提到的治疗炎症的相同方式给药。
要求授权的寡聚物对破坏实体瘤也是有用的。细胞转化常与一体蛋白所有组成部分的性质改变有关(Plantefaber，L.C.and R.O.Hynes(1989)Cell 56281-290)。肿瘤侵入和转移的机制包括在正常的细胞与细胞间以及细胞与底质间的相互作用中发生的复杂变化，参见(Juliano，R.(1987)Biochim.Biophys.Acta 907261-278;Ruoslahti，E.和F.G.Giancotti(1989)Cancer Cells 1119-126;Albeda和Buck，1990，supra;Hynes，R.U.(1992)Cell 6911-15，supra).
肿瘤发展过程是复杂的并且在肿瘤发展的不同时期需要亚性细胞表现增加或减少粘合的性质，参见(Ruoslahti和Giancotti(supra);Edelman，G.M.和K.L.Crossin(1991)Annu.Rev.Biochem.60155-190;Edelman，G.M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 848502-8506).
肿瘤细胞要转移，必须首先附着在血管的细胞外基质上。要求授权的寡聚物抑制细胞与基质的粘合。因此，若用寡聚物处理会防止肿瘤细胞相互粘合，从而使肿瘤分解。然后未粘合的肿瘤细胞被免疫系统消除。而且，因为未粘合的肿瘤细胞不能附着便不会引起转移，并可回变为没有肿瘤形成可能性的正常表型。因此，要求授权的寡聚物可用于治疗实体瘤的方法中，它包括施用足够能引起实体肿瘤溶解的一定量的要求授权的寡聚物。实体瘤可以是转移肿瘤。
再者，本发明的寡核苷酸当依照已知的技术方法固定在固体支持物上时，可用于寡核苷酸分离及其自身对NF-kBDNA或RNA的检测。本发明用于诊断的寡核苷酸可根据已知的技术方法用一个作为信号的部分标记，如放射性同位素、酶、荧光化合物。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例方法1反义寡核苷酸寡核苷酸的硫类似物根据出版的会议记录(Matsukura，M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847706-7710).已用一台自动合成仪合成(model 394，Applied Biosystems，foster city，CA)。寡聚物由Nurayanan等(1992)(supra)纯化，他们作了这样的改变寡聚物在用无水乙醇洗涤前使用醚常规反复萃取(6次)。细胞经胰蛋白酶消化，与寡聚物(30μm)混合后象前面描述的那样放入不同的ECM-覆盖的皿中24小时至2周(Ito，E.etd.(1989)Oncogene 41193-1199)。在某些实验中每48小时加入一次寡聚物。在某些实验中，在寡聚物加入前先植入细胞并允许其粘合。反义寡聚物实验要用分别制备的寡聚物重复3到4次。可使用不同代的细胞。
方法2细胞培养将鼠ES细胞(CCE-24，L.Robertson，Columbia University)常规生长在含15%加热灭活过的胎牛血清(FBS)、10μg/ml的人白细胞抑制因子(LIF)(UBI，Lake Placid，NY)和4.5×10-4M的单硫甘油的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)中，培养皿覆盖有1%的明胶。移去LIF并在无LIF培养基中再培养6到8天，细胞开始分化。NIH 3T3、Rat-1、PC-12(ATCC CRL 1721)和S-17细胞株用Narayanan等[(1992)，supra]描述的方法维持。原代人血管内皮细胞(HUVECs)和原代角化细胞从Clonetech Inc.Palo alto，CA获得。RHEK-1细胞用Rhim，J.S.等所述方法[(1986)Science232385-388]维持。细胞外基质(ECM)是从喂养层成纤维细胞建立的，它是通过用含3.5×10-4M NH4OH的0.5%Triton X-100溶液在室温溶解融合的培养物5分钟，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次。
方法3PCR分析RT-PCR是用前述方法(Narayana等(1992)，Supra)完成的。
P65的引物 (1)5'GCG GCC AAG CTT AAG ATC TGC CGA GTA AAC3'和(2)5'CGC TGC TCT AGA GAA CAC AAT GGC CAC TTG CCG 3'限定了一个150bp的扩增子。p50的引物 (1)5'AAA GGT TAT CGT TCA GTT 3'和(2)5'TTG TAG ATA GGC AAG GTC 3'限定了一个250bp的扩增子。GAPDH引物已有描述[Narayanan，et al(1992)Supra]。细胞因子受体顺序也有描述[Schmitt，R.M.等(1991)Genes Dev.5728-740]。
方法4质粒构建m-P65 cDNA的一个350bp片段从NIH 3T3细胞cDNA中用RT-PCR方法克隆，包含起始密码子ATG。PCR引物包括(1)5'ACC GCT CGA GCT AGC CCG GGA CCC TGA CCA TGG AC3'和(2)5'CCG GAA TTC GCT AGC GCT TCA CAC ACT GGA TCC CCA GG 3'并且扩增片段插入MAM-Neo-CAT载体(Narayanan etd.(Supra))的NheI部位。有意义及反义克隆通过限制性分析来表示其特性并用测序证实。超螺旋质粒DNAs用电穿孔的方法转染PC-12细胞[Reiss et al，Biochem and Biophysical Res.Comm.137，244(1986)]。
方法5分离RNARNA用RNAzol用-B(Cinna Biotecx，Friendswood，Texas)分离。Northern blot用前述的方法完成(Narayanan et al，supra)。
实施例1细胞粘合分析证明要求授权的寡聚物的效用。合成了NF-kB个别亚基修饰的偶磷-硫寡核苷酸(表Ⅰ)。
基因 种类 序列(5'至3') 参考文献P65-S 鼠 ACC ATG GAC GAT CTG TTT CCC CTC 3P65-AS 鼠 GAG GGG AAA CAG ATC GTC CAT GGT 3P65-S 人 GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC 4P65-AS 人 GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC4P50-S 鼠 ACC ATG GCA GAC GAT GAT CCC 1P50-AS 鼠 GGG ATC ATC GTC TGC CAT GGT1P50-S 人 AGA ATG GCA GAA GAT GAT CCA 2P50-AS 人 TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT2表Ⅰ.实施例中使用的偶磷-硫寡聚物。寡核苷酸顺序相应于各自的mRNA的5′端并包含起始密码上游区的3-4个核苷酸。
用鼠ES细胞来检测NF-kB的p50及p65亚基的抑制作用。ES细胞在白血病抑制因子(LIF)存在时不分化，但从培养基中去除LIF后开始分化。在分化的和未分化的ES细胞中都加入p65反义寡聚物会使细胞从覆盖有明胶的培养皿上完全分离，而对照的有意义p65寡聚物对ES细胞的粘合无任何影响。实验的细胞消化后与p65的寡聚物混合(30μM)，再植入覆盖有明胶的培养皿，并在培养72小时后拍照以观察结果。
p50反义寡聚物依赖于ES细胞的分化状况表现出激动人心的作画用对ES未分化细胞，p50反义寡聚物没有作用。除去LIF六天后使ES细胞分化，这时加入p50反义寡聚物会引起细胞完全分开，这与p65反义寡聚物作用相同。与上面相似，胰酶消化的细胞(分化或未分化的)与p50寡聚物(30μM)混合并植入覆盖明胶的培养皿上并拍照。其中分化的ES细胞的状况用不同细胞因子受体(如Epo-R，C-kit，G-CSF-R，和CSF-1R)的上调来检测。与反义寡聚物分离的细胞用台盼兰排斥法可看出细胞的存活，并在反义寡聚物存在的情况下继续生长两至三周(寡聚物每48小时换一次)。这些反义寡聚物对ES细胞粘合的作用是高度专一性的，并且不是由于非专一性毒性。许多没有关系的反义寡聚物对ES细胞粘合没有这样的作用。反义寡聚物处理的ES细胞在悬液中长成聚集体，与ES细胞在甲基纤维素培养基中生长情况相似。
(Wiles，M.V.和G.Keller(1991)Development 111259-267).
此外，反义p50和p65的作用是短暂的，当没有新寡聚物存在时，反义寡聚物处理的ES细胞保持其分化或未分化形态。这些结果表明NF-kB在细胞与基质粘合中起重要作用，因此阻止NF-kB使其不能细胞粘合。
实施例2未分化的ES细胞在p65寡聚物(30μM)存在下进行培养。细胞72小时后经胰酶消化，再植入纤粘蛋白(10μg/ml)或层粘连蛋白(10μg/ml)覆盖的培养皿中并拍照作为对照。
在p65反义寡聚物存在下，植在纤粘蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白上的ES细胞是完全分开的。
但是，当ES细胞植在溶解的喂养层细胞产生的ECM上时，p65反义寡聚物的分散作用完全消失。其它一些粘合分子是由喂养细胞的总ECM提供的，而不依赖于NF-kB的作用。未分化的ES细胞在p65寡聚物(30μM)存在的情况下培养。细胞72小时后经胰酶消化再植在胶原IV型(5μg/ml)或由溶解3T3喂养细胞产生的ECM上，并拍照作分析。
P65反义寡聚物对ES细胞粘合的作用是很快的仅五小时内，p65反义处理的细胞便在其粘合性质上发生戏剧性的变化。未分化ES细胞在无寡聚物存在下在覆盖有明胶的培养皿上培养72小时。然后倾去培养基，在附着的细胞里加入含有30μM反义或有意义p65的新培养基。标出一个区域立即拍照(0时)，5小时后进行光学分析。最好，这些细胞在12到14小时内完全分开，而p65有意义或p50反义寡聚物直到二个星期仍对未分的ES细胞的粘合没有任何作用。
在另一个实验中，分离总RNA并用RT-PCR分析p65、p50和GAPDH的表达。
RT-PCR显示未分化和分化的ES细胞在p65反义存在下培养72小时后，p65反义寡聚物均阻止了p65mRNA的表达，而在这些细胞中的p50和管家酶GAPDH的表达却不受影响。相似地，p50反义寡聚物无论ES细胞分化与否均抑制p50 mRNA的表达，而对p65或GAPDH的mRNA表达没有影响。这些结果表明P65与p50反义寡聚物对ES细胞粘合的作用应归于对各自mRNA表达的选择性抑制作用。
p65反义寡聚物可使各种各样的细胞株及原代细胞完全分开，其作用是顺序的并具种属专一性。反义p50对表Ⅱ的细胞没有作用。这些结果有力地支持了NF-kB的多效性作用以及NF-kB的p65亚基在细胞粘合过程中更特殊的作用。
表Ⅱ细胞株 细胞类型 反义寡聚物1,2,3鼠3T3喂养物 成纤维 mp65细胞(原)RAT-1 成纤维 mp65NIH3T3 成纤维 mp65S-17 骨髓基质细胞 mp65PC-12 嗜铬细胞瘤 mp65人原代 内皮 hp65RHEK-1 上皮 hp65原代角化细胞 上皮 hp651)反义寡聚物对细胞粘合的抑制作用是种属特异性的。2)相应的有意义寡核苷酸没有作用。3)p50反义或有意义寡聚物不抑制这些细胞的粘合。
表Ⅱ.p65的反义寡聚物抑制多个细胞株的粘合。鼠与人的多种细胞株，包括成纤维细胞、基质细胞、神经元细胞、内皮细胞及上皮细胞，暴露于30μM人或鼠的p65寡聚物中并于48到72小时后拍照。在所列的每一个细胞株中都观察到对细胞粘合的显著作用。
实施例3为了确证p65反义寡聚物对细胞粘合的作用，我们使用了一种能利用MAM-Neo-CAT载体[Narayanan et al，(1992)(supra))表达经氟甲强的松龙诱导的p65反义寡聚物的稳定PC-12细胞株，并且建立了反义的和有意义的(作为对照)两种PC-12细胞转染体(transfectant)。在几个独立克隆中发现了高水平的经氟甲强的松龙诱导的p65反义RNA。对照组的有意义克隆在用氟甲强的松龙(1×10-6M)处理72小时后，自24小时开始重接种并拍照，发现细胞粘合性质没有改变。反义p65克隆在没有氟甲强的松龙存在时表现正常的形态，但经氟甲强的松龙诱导后，p65反义RNA对细胞与基质的粘合产生重大影响，这与这些细胞中p65反义寡聚物的作用相似。从这些反义克隆中移去氟甲强的松龙后，细胞又回复正常形态。
P65反义寡聚物对细胞粘合的抑制作用可用于被试细胞类型的回复，为NF-kB复合物对细胞粘合的多效性需要提供依据。个别的ECMs，如纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白不能克服由NF-kB作用调节的对CAMs的需要。然而，由喂养层细胞溶解产物产生的ECMs具有补充细胞粘合中对NF-kB作用的需要的能力。这说明不依赖于NF-KB的CAMs也可能介入细胞粘合。
在稳定的PC-12反义转染体中看到依赖于氟甲强的松龙的对细胞与基质间粘合的抑制作用，此PC-12反义转染体对诱导的p65反义RNA高表达。反义寡聚物同p65反义RNA一样使PC-12细胞与基质分离生长成为聚集体。P65的表达要能对细胞与基质间粘合作用的抑制远大于对细胞与细胞间粘合作用的抑制。
P50反义寡聚物对p50 mRNA的抑制作用除在ES细胞系统有明显作用外，对其它多种细胞型没有作用。未分化ES细胞的粘合不受P50表达抑制的影响，但在分化ES细胞中，与反义p65的作用相同，对p50 mRNA的抑制导致对粘合的显著抑制。结果表明在分化ES细胞中，NF-kB的p65亚基能与除p50外的一些亚基复合或作为同一二聚体来起作用。我们的观察进一步证实，在不同细胞型中只由p65表达的抑制能对细胞粘合产生巨大的作用。在这些条件下p50表达不受影响。而在正常细胞中，p65在调节参与细胞粘合的不同基因中起基本作用，而只与胞浆抑制蛋白Ⅰ(Baeuerle，P.A.and D.Baltimore(1988)Science 242540-546)复合也不能起作用。
实施例4恶性细胞在肿瘤演进过程中表现粘合下降。(Ruoslathi和Giancotti(supra);Edelman et al.(1987和1991)，supra).
反义p65对NF-kB的抑制作用也抑制肿瘤细胞生长。体外结果表明，ras转化的细胞其转化后表型受所用p65反义寡聚物的抑制。在这个实验中，K-ras转化的BALB/C 3T3细胞(ATCC CCL163.3)用p65的有意义或反义寡聚物处理，并在第十天测定其在软琼脂中的生长。
然后，将K-ras转化的BALB/C 3T3细胞在体内稳定表达有意义和反义RNA的细胞株用来证明对肿瘤的抑制作用，此细胞株如实施例3所述用氟甲强的松龙可诱导的载体来制备。反义克隆显示依赖于氟甲强的松龙的对P65 mRNA表达的抑制作用并且在琼脂中不能形成克隆，而对照组有意义克隆无上述现象。K-ras mRNA的表达在这些反义克隆中不被抑制。
最后，这些表达反义RNA的克隆植入裸鼠中，小鼠用或不用氟甲强的松龙处理。当用氟甲强的松龙处理时，反义克隆表现出完全丧失肿瘤形成能力。此外，不用氟甲强的松龙处理的带有反义克隆的荷瘤小鼠，在用氟甲强的松龙处理后肿瘤完全消退。
更特别地是，对照组有意义克隆在7到10天内，在裸鼠的注射区域很快长出肿瘤，无论氟甲强的松龙存在与否，在2至4周内肿瘤不断增大。在氟甲强的松龙存在下，反义p65比有意义p65产生的肿瘤生长缓慢得多(4到6倍)。再者，在无氟甲强的松龙存在下，两周内反义克隆产生的肿瘤，当小鼠用含氟甲强的松龙的水喂养一至两周后，肿瘤完全消退。并且小鼠在两个月内不长肿瘤。与此相反，对照组有意义克隆产生的肿瘤继续生长，在四至六周内杀死宿主。
基于p65反义RNA对致瘤性的结果，鼠p65反义寡聚物可用于对付裸鼠肿瘤。使用两种寡聚物给药方式皮下注射，每次1.4mg寡核苷酸，每周两次;定时释放(14天)的Alza泵(Alza Corporetion，Palo alto，Calif.)，其中含2.8mg寡核苷酸。两种小鼠肿瘤细胞株K-BALB(纤维肉瘤)细胞和B-16(黑色素瘤)细胞(ATCC CRL 6322)被选来在注射部位形成侵入肿瘤。当小鼠用有意义寡聚物处理时，无论哪种给药方式肿瘤均快速生长。与此相比，用反义p65治疗的小鼠70%以上肿瘤体积明显缩小(3至5倍)。在带有B-16黑色素瘤的免疫未受损害的同系小鼠中，在p65反义寡核苷酸治疗下肿瘤体积也明显缩小。p65 mRNA在用有意义寡聚物治疗的裸鼠的B-16黑色素瘤中可看到其表达，但用反义寡聚物治疗的却看不到p65 mRNA表达。NF-kB样结合活性用对照的有意义p65寡核苷酸治疗的K-B ALB和B-16细胞的核提取物来检测，此活性能被超过30倍体积克分子浓度的冷寡核苷酸对抗。与之相比，此活性在p65反义寡聚物处理的细胞中受到显著抑制。用放射性标记的p65有意义及反义寡聚物进行实验，注射后72小时检测到肿瘤中有2-4%的输入放射活性用p65反义寡聚物治疗的小鼠进行二周的疗程后未看到明显的血液学(haemotologic)血清化学或骨髓的变化。
序列表(1)一般数据(i)申请人:
(A)姓名:霍夫曼拉罗奇AG(B)街道:Grenzacherstrasse124(C)城市:Basle(D)州:BS(E)国家:瑞士(F)邮政编码(ZIP):CH-4002(G)电话:061-6882511(H)电传:061-6881395(I)电报:962292/965542hlrc(ii)发明题目:F-KappaB反义多核苷酸(iii)序列号:4(iv)计算机可读形式:
(A)中型号:Floppy盘(B)计算机:IBMPC(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS(D)软件:PatentInRelease#1.0,Version#1.25(EPO)(vi)优先申请数据(A)申请号:US07/950531(B)申请日期:1992.9.23(2)SEQIDNo.1数据:
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(2)SEQIDNo.2数据:
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AGATGGCAGAAGATGATCCA(2)SEQIDNo.3数据(i)序列特征:
(A)长度:21个碱基对(B)类型:核酸(C)股数:单链(D)拓扑学:线性(ii)分子类型:DNA(iii)假设:无(iv)反义:有(xi)序列说明:SEQIDNo:3GGGGAACAGTTCGTCCATGGCSEQIDNo.4的数据:
(i)序列特征:
(A)长度:21个碱基对(B)类型:核酸(C)股数:单链(D)拓扑学:线性(ii)分子类型:DNA(iii)假设:无(iv)反义:有(xi)序列说明:SEQIDNo:4TGGATCATCTTCTGCCATTCT
权利要求
1.包含或由一个核苷酸顺序组成的寡核苷酸，其特征在于它具有与编码人NF-kB转录因子的一部分基因杂交的能力，而且当此寡核苷酸与所述的那部分基因杂交后会阻止NF-kB转录因子的合成。
2.根据权利要求1的寡核苷酸，其中编码NF-kB转录因子的基因是mRNA。
3.根据权利要求1或2的寡核苷酸，其长度为5到50个核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一权项的寡核苷酸，其中NF-kB转录因子的p65亚基的部分基因具有与SEQ ID No1相同的序列或它的互补序列。
5.根据权利要求1-4中任一权项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸含有与SEQ ID No3相同的序列或它的具有SEQ ID No1序列的互补序列。
6.根据权利要求1-3中任一权项的寡核苷酸，其中NF-kB转录因子p50亚基的部分基因具有与SEQ ID No2相同的序列或它的互补序列。
7.根据权利要求1、2、3、或6中任一权项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸含有与SEQ ID No4相同的序列或它的具有SEQ ID No2序列的互补序列。
8.根据权利要求1-7中任一权项的寡核苷酸，其中该核甘酸由分子式为-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯基因连接，这里的Y为甲基、氧或硫。
9.根据权利要求1-8中任一权项的寡核苷酸，在疾病治疗中用作治疗活性化合物。
10.制备权利要求1-8中任一权项的寡核苷酸的方法，其特征在于将固体支持物连接、保护的通过固相合成的相应核苷酸序列的寡核苷酸脱保护、从固体支持物上解离下来，和如果需要的话，再进行修饰。
11.一种药用组合物，它至少含有权利要求1-8中任一权项的寡核苷酸，如果合适的话，还可含有治疗上可接受的载体物质。
12.将权利要求1-8中任一权项的寡核苷酸用于制备药用组合物。
13.将权利要求1-8中任一权项的寡核苷酸用于治疗疾病的药物的制造。
全文摘要
本发明公开了能与编码NF-KB的基因杂交的寡聚物。
文档编号A61K31/70GK1084564SQ9311783
公开日1994年3月30日 申请日期1993年9月22日 优先权日1992年9月23日
发明者R·那拉亚南, C·A·罗森 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司