专利名称：具有抗微生物活性的模板固定的肽模拟物的制作方法
技术领域：
本发明提供了如下定义的引入12个a -氨基酸残基的模板固定链的模板固定的^ -发夹肽模拟物，所述残基根据其在链中的位置是Gly，或Pro，或特定的类型。这些模板固定的3-发夹模拟物具有选择性的抗微生物活性。此外，本发明提供了有效的合成方法，通过该方法，可以根据需要以平行库形式来制备这些化合物。这些3-发夹肽模拟物显示出提高的功效、生物利用率、半衰期，最重要的是显著提高的抗细菌活性(一方面)和红细胞的溶血(另一方面)之间的比率。
背景技术：
不断增加的微生物对已有抗生素的耐药性问题刺激了开发具有新作用模式的新抗微生物剂的强烈兴趣(H. Breithaupt, Nat. Biotechnol. 1999,17,1165-1169)。一类新兴的抗生素是基于天然存在的阳离子肽(T. Ganz, R. I. Lehrer, Mol. Medicine Today 1999,5,292-297 ；R. M. Epand, H. J. Vogel, Biochim. Biophys. Actal999，1462，11-28)。这些包括二硫桥接的P -发夹和P -折叠肽(如蛋白溶菌素(protegrin) [V. N. . M. ；0. V. Shamova,H. A. Korneva, R. I. Lehrer, FEBSLett. 1993, 327, 231-236]，當素[T. Nakamura, H. Furunaka,T. Miyata, F. Tokunaga, T. Muta, S. Iwanaga, M. Niwa, T. Takao, Y. Shimonishi, Y. J. Biol.Chem. 1988，263，16709-16713]，和防御素[R. I. Lehrer, A. K. Lichtenstein, T. Ganz，Annu.Rev. Immunol. 1993，11，105-128]，两性a -螺旋肽(例如，杀菌肽、皮抑菌肽、马加宁和蜂毒素[A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero,Biopolymers 2000, 55,4-30]),以及其他线性和环状结构肽。尽管抗微生物阳离子肽的作用机理还没有得到充分的了解，它们主要的相互作用位点是微生物细胞膜(H. ff. Huang, Biochemistry2000，39，8347-8352 )。暴露于这些试剂时，细胞膜经历透化作用，接着是快速细胞死亡。然而，目前不能排除更复杂的作用机理，例如，涉及受体介导的信号传导(M. Wu, E. Maier, R. Benz, R. E. Hancock, Biochemistry 1999,38,7235-7242)。这些阳离子肽中许多的抗微生物活性通常与其优选的次级结构相关，不管是在水溶液或是在膜样环境中观察到的(N. Sitaram, R. Nagaraj, Biochim. Biophys.Actal999，1462，29-54)。通过核磁共振(NMR)光谱的结构研究已经表明阳离子肽如蛋白溶菌素 I (A. Aumelas, M. Mangoni, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy,
B.Calas,A.Chavanieu,A. Eur. J. Biochem. 1996, 237, 575-583 ；R. L. Fahrner,T. Dieckmann,S. S. L. Harwig, R. I. Lehrer, D. Eisenberg, J. Feigon, J. Chem. Biol. 1996, 3, 543-550)和當素 I (K. Kawano, T. Yoneya, T. Miyata, K. Yoshikawa, F. Tokunaga, Y. Terada,S. J. Iwanaga, S. J. Biol. Chem. 1990，265，15365-15367)由于两个二硫桥的限制作用而呈现出明确的￠-发夹构象。在缺乏这些二硫键中的一个或两个的蛋白溶菌素类似物中，￠-发夹构象的稳定性下降，并且抗微生物活性降低(J.Chen，T. J. Falla, H. J. Liu,M. A. Hurst, C. A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu,J. C. Fiddes, Biopolymers2000, 55, 88-98 ；S. L. Harwig, A. Waring, H. J. Yang, Y. Cho,L. Tan, R. I. Lehrer, R. J. Eur. J. Biochem. 1996, 240, 352-357 ；M. E. Mangoni, A. Aumelas,P. Charnet, C. Roumestand, L. Chiche, E. Despaux, G. Grassy, B. Calas, A. Chavanieu, FEBSLett. 1996,383,93-98 ；H. Tamamura, T.Murakami, S.Noriuchi, K.Sugihara, A.Otaka,ff. Takada, T. Ibuka, M. Waki, N. Tamamoto, N. Fujii, Chem. Pharm. Bull. 1995,43,853-858)。对當素 I 的类似物(H. Tamamura，R. Ikoma, M. Niwa, S. Funakoshi, T. Murakami, N. Fujii,Chem. Pharm. Bull. 1993，41，978-980)和兔防御素 NP-2 的发夹-环模拟物(S. Thennarasu,R. Nagaraj, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1999, 254, 281-283)进行了相似的观察。这些结果表明，￠-发夹结构在这些蛋白溶菌素样肽的抗微生物活性和稳定性中起着重要作用。在偏爱a -螺旋结构的阳离子肽的情况下，螺旋的两性结构似乎在确定抗微生物活性中起着关键作用(A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero, A. Biopolymers2000, 55,4-30)。短杆菌肽S 是具有明确 P -发夹结构的主链-环肽(S. E. Hull, R. Karlsson, P. Main, M. M. woolfson,E. J. Dodson, Nature 1978, 275，206-275)，呈现出有效的对抗革兰氏阳性和革兰氏阴 性细菌的抗微生物活性(L. H. Kondejewski, S. ff. Farmer, D. S. Wishart, R. E. Hancock,R. S. Hodges, Int. J. Peptide Prot. Res. 1996,47,460-466)。然而，短杆菌妝 S 的高 溶血活性阻碍了它作为抗生素的广泛使用。NMR的最新结构研究表明，高溶血活性明显与该环状0 -发夹样分子的高度两性性质有关，但可以通过调整构象和两亲性而使抗微生物活性和溶血活性分离(L. H. Kondejewski, M. Jelokhani-Niaraki, S. ff. Farmer, B. Lix, M. Kay,
B.D. Sykes, R. E. Hancock, R. S. Hodges, J. Biol. Chem. 1999, 274,13181-13192 ；C. McInnesL.H. Kondejewski, R. S. Hodges, B.D.Sykes, J. Biol. Chem. 2000,275,14287-14294)。最近报道了一种来自灵长类白血球的新环状抗微生物肽RTD-I (Y. -Q. Tang,J. Yuan, G. OSdpayj K. Osapayj D. Tran, C. J. Miller, A. J. Oellette, M. E. Selsted,Sciencel999，286，498-502)。这个肽含有三个二硫桥，其用于将环肽主链限制成发夹几何。这三个二硫键的断裂导致抗微生物活性的显著损失。还报道了含有环肽主链，以及多个二硫桥以加强两性发夹结构的蛋白溶菌素(J. P. Tam, C. Wu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000,267,3289-3300)和鲎素(J.-P. Tam，Y.-A. Lu，J. _L. Yang，Biochemistry2000，39，7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j,Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000, 267, 783-790)的类似物。在这些情况下，所有胱氨酸限制的去除并不总是导致大的抗微生物活性损失，但却调整了溶膜选择性(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur. J. Biochem. 2000，267，3289-3300)。设计新的选择性阳离子抗微生物肽的关键问题是生物利用率、稳定性和降低的溶血活性。天然存在的蛋白溶菌素和鲎素对人红细胞产生明显的溶血活性。这种情况对于蛋白溶菌素类似物如IB367也是如此(J. Chen, T. J. Falla, H. J. Liu, M. A. Hurst,
C.A. Fujii, D. A. Mosca, J. R. Embree, D. J. Loury, P. A. RadeI, C. C. Chang, L. Gu, J. C. Fiddes,Biopolymers 2000, 55,88-98 ；C. Chang, L. Gu, J. Chen, US-Pat :5, 916, 872,1999)。该高溶血活性基本上排除了将其体内使用，并且表示临床应用中的一个严重缺点。另外，类似物的抗生素活性通常随着盐浓度的增加而明显下降，使得在体内条件下(约100-150mM NaCl)抗微生物活性明显下降。蛋白溶菌素I在低和高盐分析中呈现出对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌的功效和类似活性。该宽抗微生物活性与快速作用模式，及其杀死耐受其它类别抗生素的细菌的能力相结合，使得它们成为开发临床上有用的抗生素的有吸引力的目标。对抗革兰氏阳性细菌的活性通常高于对抗革兰氏阴性细菌的活性。然而，蛋白溶菌素I还呈现出对抗人红细胞的高溶血活性，并且因此对微生物细胞的低选择性。定向CD实验(ff. T. Heller, A. J. Waring, R. I. Lehrer, H. ff. Huang,Biochemistry 1998，37，17331-17338)表明蛋白溶菌素I在与膜相互作用时可以呈现出两种不同的状态，而且这些状态明显受到脂质组成的影响。对环状蛋白溶菌素类似物的研究(J.-P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300)已经显示，由主链环化和多个二硫桥引起的构象刚性的增加可以产生溶膜选择性，这使得抗微生物活性与溶血活性分开，至少在所研究系列的化合物中是如此。蛋白溶菌素I是具有酰胺化羧基末端和两个二硫桥的18残基线性肽。鲎素I含有17个残基，也具有酰胺化羧基末端和含有两个二硫桥。最近描述的主链-环状蛋白溶菌素和鲎素类似物通常含有18个残基和最高三个二硫桥(J. P. Tam, C. ffu, J. -L. Yang, Eur.J. Biochem. 2000，267，3289-3300 ； J. P. Tam，Y. -A. Lu，J. -L Yang，Biochemistry 2000，39，
7159-7169 ；N. Sitaram, R. Nagarai j, Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000，267，783-790)。目前正在研究的抗菌肽(Cathelicidin) (37-残基线性螺旋型阳离子肽)和类似物被用作囊性纤维化(CF)肺疾病的吸入治疗剂(L. Saiman, S. Tabibi，T. D. Starner，P. San Gabriel，P. L Winokur, H. P. Jia，P. B. McGray, Jr.，B. F. Tack, Antimicrob. AgentandChemother. 2001,45, 2838-2844 ；R.E. W.Hancock, R. Lehrer, Trends Biotechnol. 1998，16,82-88) o超过80%的CF病人受到铜绿假单胞菌的慢性感染(C. A. Demko, P. J. Biard,P. B. Davies, J. Clin. Epidemiol. 1995,48,1041-1049 ；E. M. Kerem, R. Gold，H. Levinson,J. Pediatn 1990，116，714-719)。对抗假单胞菌的其它抗微生物肽(Y. H. Yau, B. Ho，N. S. Tan，M. L Ng, J. L Ding，Antimicrob. Agent and Chemother. 2001，45，2820-2825 和其中引用的参考文件)，如FALL-39，SMAP-29，和鳞翅目昆虫杀菌肽呈现出较少的所需特性，如宽范围pH内的有效抗微生物活性、快速杀死率和低溶血活性。在以下描述的化合物中，引入了新的策略来稳定呈现出选择性抗微生物活性的主链-环状阳离子肽模拟物中的￠-发夹构象。这包括将阳离子和疏水性发夹序列移植到模板上，模板的功能是将肽环主链限制成发夹几何。文献中已经描述了结合模板的发夹模拟物肽(D, Obrecht, M. Altorfer,J. A. Robinson, Adv. Med. Chem. 1999,4,1-68 ；J. A. Robinson, Syn. Lett. 2000,4,429-441),并且目前已经建立了使用组合和平行合成方法产生P -发夹肽模拟物的能力(L. Jiang,K. Moehle, B. Dhanapal, D. Obrecht, J. A. Robinson, Helv. Chim. Acta. 2000,83, 3097-3112)。国际专利申请W002/070547A1和W02004/018503A1中已经描述了抗菌的模板固定的肽模拟物及其合成方法，但这些分子没有呈现出高的血浆稳定性选择性和特别高的功效。

发明内容
在此所述的方法能够合成和筛选大的发夹模拟物库，这随后明显有助于结构-活性研究，并因此发现具有有效选择性抗微生物活性和对人红细胞非常低的溶血活性的新分子。本方法能够合成对各种多药物耐药性假单胞菌菌株具有新选择性的3-发夹肽模拟物。本发明的P -发夹肽模拟物是具有以下通式的化合物
权利要求
1.以下通式的化合物
2.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是dPix)-LPix)并且位置1-12的氨基酸残基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
3.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Gly ;和 -PI2 Dab0
4.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Abu ;和 -PI2 Dab0
5.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Thr ;和 -P12 Dab o
6.根据权利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Tyr ；-P3 :Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-P12 Dab o
7.根据权利要求I的通式I的化合物,其中模板是DPro-Lpro并且位置1_12的氨基酸残基是-Pl Ala ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ；-PII Ala ;和-PI2 Dab0
8.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Lys ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
9.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Lys ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
10.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Lys0
11.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Gln ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
12.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPIX)-LPIX)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Val ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ；-P7 Dab ；-P8 Trp ；-P9 Dab ；-PlO Dab ； -PU Ala ;和 -PI2 Dab0
13.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是-Pl Thr ；-P2 Trp ；-P3 Ile ；-P4 Dab ；-P5 Lys ；-P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Hse ;和 -PI2 Dab0
14.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是 -Pl Thr ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
15.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ； -P3 Ile ； -P4 Dab ； -P5 Lys ； -P6 DDab ； -P7 Dab ； -P8 Trp ； -P9 Dab ； -PlO Dab ； -PU Ala ;和 -P12 :Gln。
16.根据权利要求I的通式I的化合物，其中模板是DPr0-Lpix)并且位置1-12的氨基酸残基是 -Pl Glu ； -P2 Trp ；-P3 Ile ； -P4 Gln ； -P5 Lys ； -P6 Dab ； -P7 Dab ； -P8 Ser ； -P9 Dab ； -PlO Dab ；-PU Ala ;和-P12 SerD
17.含有根据权利要求I至16任一项的化合物和药物学上惰性载体的药物组合物。
18.根据权利要求17的组合物，是适用于口服、局部、或注射的形式。
19.根据权利要求17的组合物，是适用于经粘膜的形式。
20.根据权利要求17的组合物，是适用于经皮、口腔或肺部给药的形式。
21.根据权利要求17或18的组合物，是片剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、霜剂、膏剂、喷雾或栓剂的形式。
22.根据权利要求17或18的组合物，是溶液或悬浮液的形式。
23.根据权利要求17或18的组合物，是糖浆的形式。
24.根据权利要求I至16任一项的化合物的用途，用于制备治疗或预防感染或与该感染相关的疾病的药物。
25.根据权利要求24的用途，其中所述感染与呼吸道疾病相关；与皮肤或软组织疾病相关；与胃肠疾病相关；与眼疾病相关；与耳疾相关；与CNS疾病相关；与骨病相关；与心血管疾病相关；与gastrourinal疾病相关；与癌症相关；或与H IV相关。
26.根据权利要求I至16任一项的化合物的用途，作为杀菌剂或防腐剂，用于食品、化妆品和药物。
27.根据权利要求1-16任一项的化合物的制备方法，该方法包括 Ca)将适当官能化的固体支持物与在所需终产物中处于位置5，6或7的氨基酸的适当N-保护衍生物偶联，可存在于所述N-保护氨基酸衍生物中的任何官能团同样得到适当保护； (b)从如此得到的产物中去除N-保护基团； (c)将如此得到的产物与在所需终产物中接近N-端氨基酸残基的一个位置的氨基酸的适当N-保护衍生物偶联，可存在于所述N-保护氨基酸衍生物中的任何官能团同样得到适当保护； Cd)从如此得到的产物中去除N-保护基团； (e )重复步骤(c )和(d)直至N-端氨基酸残基已被引入； (f)将如此得到的产物与具有以下通式的化合物偶联
28.根据权利要求1-16任一项的化合物的制备方法，该方法包括 (a’ )将适当官能化的固体支持物与具有以下通式的化合物偶联
全文摘要
说明书和权利要求中限定了通式(I)的模板固定的β-发夹肽模拟物及其盐，其中Z是模板固定的12个α-氨基酸残基的链，这些残基根据它们在链中的位置(从N-端氨基酸开始计数)，是Gly或Pro，或是特定类型的，上述通式中剩余的符号亦是如此，该肽模拟物具有选择性地抑制微生物如铜绿假单胞菌生长或杀灭微生物的特性。它们可以用作杀菌剂，用于食品、化妆品、药物或其他含营养素的物质，或作为药物，用于治疗或预防感染。可以通过基于混合的固相和液相合成策略的方法来制备这些β-发夹肽模拟物。
文档编号A61P13/00GK102796179SQ20121024558
公开日2012年11月28日 申请日期2007年1月15日 优先权日2006年1月16日
发明者F·贡贝特, D·奥伯莱希特, W·维利吉伯罗德, R·蒂亚斯, S·J·德马科, J·A·罗宾逊, N·斯里尼瓦斯 申请人:波利弗尔有限公司, 苏黎世大学