专利名称：一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌病疫苗领域，特别是涉及一株血清4型副猪嗜血杆菌株。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPs)为巴氏杆菌科嗜血杆菌属中的一种革兰氏阴性球杆菌，是猪的一种条件性病原菌，呈世界性分布，感染仔猪后引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的猪格拉泽氏(Glasser’s)病。主要危害2 8周龄的仔猪，发病率一般为10% 15%，死亡率可达50%以上。副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻，生长严格需要V因子(NAD)，目前认为胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基与胰蛋白胨大豆(TSB)培养基是培养副猪嗜血杆菌的最适培养基。在添加NAD的TSA平板培养基上培养24h可见针尖大小灰白色菌落，呈隆起圆形，表面光滑、湿润、边缘整齐。HPs在巧克力琼脂平板上生长困难，有报道显示，巧克力平板上HPs不能进行传代培养，不适用于体外传代培养，但巧克力琼脂平板可以用于分离该菌，初次分离培养时供给5% 10%的二氧化碳(CO2)可促进生长。液体培养时需要在肉汤或TSB培养基中添加血清与V因子(NAD)，但添加V因子浓度不断增加细菌浓度不会随之升高。由于葡萄球菌生长过程中会将自身代谢产物V因子释放到培养基中，所以HPs与金黄色葡萄球菌共同接种于鲜血琼脂平板培养，HPs在金黄色葡萄球菌两侧生长良好，随着与金黄色葡萄球菌距离增加，菌落逐渐变小，该现象被称为卫星现象。HPs对外界环境抵抗力极弱，体外培养极易死亡。HPs菌株间抗原性和毒力差异很大，血清学分型是区别不同菌株的重要方法之一。目前，由Kielstein等1992年提出的基于热稳定抗原免疫扩散试验的血清学分型方法(KRG)已在世界范围内被接受，该方法将HPs分成15个血清型，然而有15.2% 41%的分离株血清型不能确定。根据日本、德国、美国和西班牙等国的血清流行病学调查，以血清型4、5和13最为流行。HPs在我国普遍流行，目前,在河北、河南、湖北、湖南、安徽、上海、广东、江西等12个省市均有副猪嗜血杆菌病发生和分离 出HPs的报道。由于兽医临床上常常大量甚至不合理使用抗菌药，致使猪场细菌在药物压力下选择出耐药菌群。因此，用药物防控副猪嗜血杆菌病的难度越来越大，而且随着人们对食品安全问题的担忧，抗生素在防控动物疾病方面的应用会更少，而将发挥更大作用的是相应的疫苗。HPs血清型较多，且不同血清型菌株的毒力与致病力差异较大，各个血清型之间免疫交叉保护力很低，所以，现有国内外商品化的副猪嗜血杆菌病疫苗均不能对该病提供完全有效的保护。因此，分离筛选免疫原性强的通用型HPs菌株，并利用其制备高效疫苗是防控副猪嗜血杆菌病的重中之重。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株(FS0307株)，该疫苗株具有较强的毒力和很高的免疫原性。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis),菌株号为FS0307,已保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号:CCTCC N0:M2013094，保藏日期:2013年3月21日。该菌株是发明人于2003年4月于河北省衡水市自行采集筛选获得一株具有较强的毒力和很高的免疫原性的菌株。上述血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备治疗猪副猪嗜血杆菌病药物中的应用。其中，所述的药物为疫苗，优选油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。其中，血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株与药学上可接受的载体或辅料组合构成药物，如单价苗、多价苗或联苗等等。其中，所述血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在疫苗中含菌量为2X 109CFU/mL以上。有益效果:本发明的血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株具有稳定的生物学特性，对仔猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性。应用其制备的油佐剂灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果均达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效预防副猪嗜血杆菌的流行。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株的分离纯化和鉴定。1.生产用培养基TSA固体培养基配制:准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121 °C高压蒸汽灭菌15min，冷却至50 60°C时，加入过滤除菌的牛血清50mL、IOmL过滤除菌的0.0P/oNAD,混合均匀后倒板备用。TSB液体培养基配制:准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121°C高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的牛血清50mL、IOmL过滤除菌的0.01%NAD即可。2.副猪嗜血杆菌分离纯化及鉴定2.1分离纯化2003年，我国河北地区的某规模化猪场大量出现疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪，以持续发热、胸膜炎、腹膜炎、关节炎等为特征，选取病猪的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置 37°C、5%C02条件下培养24 48小时，挑取半透明隆起的小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。同时接种鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基，结果TSA/NAD固体培养基上生长良好，鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基没有菌落生成。
2.2生化鉴定取纯培养菌液接种TSA/NAD固体培养基，置37°C、5%C02条件下培养24 48小时。观察菌落形态，可见针尖大小，圆形，边缘整齐，扁平，灰白色半透明隆起的小菌落。取单个菌落涂片革兰氏染色，为革兰氏染色阴性，呈多形性，为单个小球杆菌或细长的丝状杆菌。将纯培养菌液在脱纤绵羊鲜血琼脂固体培养基上与金黄色葡萄球菌作交叉划线，置37°C、5%C02条件下培养24 48小时后，呈小而透明的菌落，越靠近葡萄球菌附近生长越好，呈现出典型的卫星生长现象，并且鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象。将纯培养菌液接种于TSA/NAD固体培养基，再分别贴上浸溃有X、V、X+V因子的圆形滤纸片。置37°C、5%C02条件下培养24 48小时，结果只有在含V、X+V因子的纸片周围有菌落生长，表明该菌株只依赖V因子，而不依赖X因子。将纯培养菌液接种微量生化反应管，分别补充终浓度0.01%的NAD，置37°C静置培养，48h后判定生化特性结果。结果表明分离菌株对葡萄糖、蔗糖和果糖发酵，对麦芽糖、半乳糖、木糖和果糖不发酵，吲哚试验、氧化酶试验和脲酶试验呈阴性，硝酸盐还原试验和接触酶试验阳性,符合副猪嗜血杆菌的生化特性。根据该菌株的来源地将其命名为FS0307株。2.316S rRNA基因序列测定与分析2.3.1引物设计根据GenBank中副猪嗜血杆菌P5基因序列设计两条引物，引物序列为:P1:5’ -gctccacaagctaacactttc-3J，P2:5’ -catagaaacttcttttgaacc-3>,由上海生工生物工程有限公司合成，该引物扩增片段大小为1038bp。2.3.2菌体DNA模板的制备取FS0307株培养物1.5mL, 10000r/min离心5min，弃上清，沉淀用200 μ L双蒸水 重悬，100°C水浴IOmin后，12000r/min离心5min收集上清，即为PCR模板，_20°C保存备用。2.3.3PCR扩增及测序用提取的菌体DNA作为PCR模板。PCR扩增体系为:10XPCRBuffer5.0 μ L，MgCl2 (25mM)2.5 μ L, dNTP (2.5mM)4.0 μ L，弓丨物 Pl (50 μ Μ)0.5 μ L,引物 Ρ2 (50μΜ) 0.5μ L，模板 DNA3.Ομ L，Taq 酶(5U/μ L) 0.5 μ L 加双蒸水至 50 μ L。反应条件为:95°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环，72°C终延伸lOmin。取10 μ L PCR扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了与标准株相同的1038bp大小的特异性条带，说明分离到的FS0307株为副猪嗜血杆菌。经过回收鉴定为阳性的PCR扩增产物交由上海生工生物工程有限公司测序。副猪嗜血杆菌FS0307株P5基因测序结果如SEQ ID N0.1所示，该序列与GenBank中公布的序列进行BLAST比对，与国内外已有的副猪嗜血杆菌相应序列的同源性达95%以上。2.4副猪嗜血杆菌FS0307株血清学鉴定按Kleletein-Rapp-Gabriedson (KRG)琼脂扩散血清分型方法对副猪嗜血杆菌FS0307株的血清型作鉴定。将副猪嗜血杆菌FS0307株按5%的比例接种于TSB培养基，37°C、5%C02条件下培养18 24小时后，将菌液浓缩至含菌量为I X 101(lCFU/mL，菌液5000r/min离心IOmin,取上清用于琼脂扩散试验的分型抗原。配制1%琼脂平板,打孔(中间I个孔周边6个),孔径5.0mm,孔距3.0mm。。在周边的6个孔内加入6 μ I副猪嗜血杆菌标准株兔抗高免血清(正上方孔标记为I,加I型高免血清,其余各个血清型的血清依次按血清型递增顺序以顺时针的方向加样)，中间孔加待检菌株的热处理分型抗原6 μ 1，湿盒37°C孵育，分别在24h、48h、72h观察并记录结果，同时设标准菌株的对照。琼脂扩散试验表明，副猪嗜血杆菌FS0307株的高压提取抗原只与4型副猪嗜血杆菌标准株的阳性血清有沉淀线，与其它型标准株的血清型无沉淀线，说明副猪嗜血杆菌FS0307株为血清4型。2.5动物攻毒试验血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株经TSB/NAD液体培养基培养，进行活菌计数，浓缩后，使感染滴度达到lX109CFU/ml，经腹腔注射50 60日龄健康易感猪5头，5ml/头。另设I组对照组，5头，腹腔注射TSB/NAD培养基，5ml/头。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察14日，每日测体温，观察临床症状。攻毒14日后剖检，根据临床症状与剖检病变计算发病数。同时，取发病猪的组织病料做细菌分离和鉴定。攻毒结果显示，连续观察14日后，血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株攻毒组的5头实验猪均先后发病；对照猪表现正常。临床症状表现为，实验猪感染副猪嗜血杆菌分离株I日后体温升高，随后逐渐出现食欲降低，被毛粗乱，耳朵及全身皮肤发红，鼻液增多，后期出现呼吸困难，关节肿胀，卧地不起。剖检发现，发病猪和病死猪出现胸腔、腹腔积液，有不同程度的胸膜、腹膜粘连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血，淋巴结肿胀等病变。结果见表I。 利用分离菌株攻毒的组织病料进行细菌分离。结果从FS0307株攻毒组中的4头发病猪中分离到菌落和菌体形态与副猪嗜血杆菌标准株相似的细菌。同时对所有分离到的细菌进行PCR鉴定，结果在1038bp处出现特异性条带，证明分离病原为副猪嗜血杆菌。表I副猪嗜血杆菌FS0307株的毒力试验结果..
权利要求
1.一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)，菌株号为FS0307，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号=CCTCCN0:M2013094，保藏日 期:2013年3月21日。
全文摘要
本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌病疫苗领域，公开了一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株号为FS0307，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2013094，保藏日期2013年3月21日。本发明的血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株对猪有较强的致病性，具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活疫苗安全可靠，对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少。无论是单苗还是联苗，其免疫效果均达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效预防副猪嗜血杆菌的流行。
文档编号A61P31/04GK103194413SQ20131012619
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者邵国青, 刘茂军, 周勇岐 申请人:江苏省农业科学院