专利名称：siRNA缀合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种缀合物、制备该缀合物的方法以及利用该缀合物传递SiRNA的方法，其中，在癌症和其它传染性疾病的基因疗法中用于促进siRNA传递的聚合物通过可降解键(degradable bond)或不可降解键缀合到siRNA。
背景技术：
RNA干扰是指这样一种机制，其为在基因表达过程中，双链RNA(dsRNA)通过核苷酸序列特异性方式启动基因转录后沉默，并且这种机制首先在线虫(C.elegans)中被发现，并常见于植物、果蚬和脊椎动物(Fire等，自然(Nature), 391:806-811, 1998 ； ；Novina&Sharp,自然(Nature) ,430:161-164，2004)。已知以如下方式发生RNA干扰进入到细胞内的19 25bp的dsRNA与RISC(RNA-诱导的沉默复合物)结合，且仅反义(向导)链与mRNA结合而与mRNA的核苷酸序列互补，从而通过存在于RISC的核酸内切酶结构域降解IE mRNA(Rana, T. M. , Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. , 8:23-36, 2007 ；Tomari, Y.和 Zamore, P.D., Genes Dev. , 19:517-529，2005)。当dsRNA被传递到细胞中，它特异性地结合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被认为是一种可调控基因表达的新型工具。然而，对于人类来说，由于向人体细胞引入dsRNA会诱导抗病毒干扰素途径，因此难以获得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等发现向人体细胞导入21nt长度(核苷酸长度)的小dsRNA不会引起干扰素途径，但特异性地降解革巴 mRNA (Elbashir, S. M. , Harborth, J.，Lendeckel, ff. , Yalcin, A. , Weber, K. , Tuschl,Τ·，自然(Nature)，411，494-498，2001 ； ；Elbashir, S. Μ.，Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，基因(Genes) &Dev. , 15, 188-200，2001 ； ；Elbashir, S. M. , Martinez, J. , Patkaniowska, A. , Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 长度的 dsRNA 已经作为一种新型的功能基因组工具引起了公众的注意，并命名为小干扰RNA(siRNA)。自从siRNA被报道在动物细胞中抑制特定基因表达上具有极好的效果，siRNA作为一种基因治疗的药物引起了广泛关注。实际上，由于它的高活性和精确的基因选择性，根据20年的研究结果，siRNA有望成为一种目前用作治疗药物的反义寡核苷酸(ODN)的替代治疗药物(Dana J. Gary等，控释杂志(Journal of ControlledRelease) 121:64-73，2007)。用于治疗的siRNA技术具有显著的优势，与其它药物相比，它易于设计并具有高目标选择性和抑制特定基因表达的性能。此外，由于RNA干扰利用生命系统中天然存在的机制抑制基因表达，所以它毒性较低。目前0ΡΚ0 Inc.开发的湿性老年黄斑变性病的治疗药物“贝伐西尼(Bevasiranib) ”为一种siRNA，其可选择性地作用于血管内皮生长因子(VEGF)，诱导新血管形成以抑制VEGF的表达，并通过了三期临床试验(Dejneka NS等，Mol Vis.，28 (14) : 997-1005，2008)。此外，目前正在研发含有革巴向多种基因的 siRNA 的治疗药物(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery7:115-116，2008)。尽管各种结果表明体内通过RNA干扰诱导特异性的表达抑制，但siRNA在体内的传递还有许多问题需要解决，如在血液中被酶降解、与血液中组分的相互作用以及非特异性地传递给细胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22
(3): 142-151，2007)。正在通过部分地利用抗核酸酶的核苷酸类似物或改良传递技术，尝试克服这些问题。改良的传递技术的实例包括利用病毒如腺病毒、逆转录病毒等的基因传递技术，以及利用脂质体、阳离子脂质和阳离子聚合物的非病毒载体的基因传递技术。然而，由于传递的基因有可能整合到宿主的染色体中，从而诱导宿主基因的正常功能发生异常并激活致癌基因，因此病毒载体存在安全性方面的问题，此外，即使以较小的量连续表达病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒载体诱导的修饰的病毒感染情况下，可能不会引起有效的保护性免疫。同时，非病毒载体的有效性低于病毒载体，但考虑到体内安全性和经济可行性，其具有副作用低和生产成本低的优势(Lehrman S.，自然(Nature). 401 (6753) : 517-518，1999)。此外，非病毒传递方法要求有效地保护酶或非酶的降解，以便传递包括siRNA的RNA分子，其中一种方法为利用编码短发夹RNA (shRNA)的DNA表达质粒。通过DNA的系统的优势在于，仅当表达载体存在时进行siRNA表达。此外，目前siRNA化学修饰的研究提出一种用于改良针对核酸酶的稳定性以及低胞内摄取的方法(Shigery Kawakami和MitsuruHashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3):142-151，2007)。
在一种siRNA的化学修饰中，作为被核酸酶降解部位的磷酸二酯键用硫代磷酸连接进行修饰，或戊糖的2’位被2’ -0-meRNA、2’ -脱氧-2’ -氟尿嘧啶核苷或通过2’位和4’位连接形成的锁核酸(LNA)修饰,结果提高了血清中的稳定性((Braasch D. A.等,Bioorg.Med. Chem. Lett. 14:1139-1143，2003 ； ；Chiu Y. L.和 Rana T. Μ.，RNA, 9:1034-1048，2003 ；；Amarzguioui Μ.等,Nucleic Acid Res. 31:589-595，2003)。在另一种化学修饰中，官能团连接到正义(反向导)链的3’端区域，结果与对照相比，药动力学特性得到了改良，体内通过siRNA的亲水性和疏水性的平衡在施用时诱导出较高的效率(Soutschek J.等，Nature432:173-1782004)。然而，上述方法在保护SiRNA免于核酸酶的消化以及改良细胞膜透性效率上仍然有许多有待改进之处。基于这一原因，发明人发现了一种缀合物，其中亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到SiRNA，改良了 siRNA的体内稳定性，并基于此完成了本发明。

发明内容
技术问题本发明的一个目的在于提供一种缀合物，其中作为生物相容性聚合物的亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到siRNA的正义链或反义链的末端，以提高siRNA在细胞内传递的效率。本发明的另一个目的在于提供一种含有聚合物的固相支持物，具体地，施用到人体时稳定性得到证实的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以及提供一种有效地制备包括RNA、DNA,RNA-DNA嵌合体及其类似物的寡核苷酸的方法，其中，通过支持物将PEG结合到它的3’端。本发明又一目的在于提供制备siRNA缀合物的方法，以及利用siRNA缀合物传递siRNA的方法。技术方案为实现上述的目的，首先，本发明提供一种siRNA-聚合物缀合物，其结构如下A-X-R-Y-B(其中，A和B独立地为亲水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y独立地为简单的共价键或接头介导的(linker-mediated)共价键；且R为siRNA)。其次，本发明提供一种siRNA-聚合物缀合物，其结构如下A-X-R(其中，A为疏水性聚合物；X为简单的共价键或接头介导的共价键；R为siRNA)第三，本发明提供一种缀合物，其中SiRNA(R)的单链含有19 31个核苷酸。第四，本发明提供一种缀合物，其中疏水性聚合物(A)的分子量为25(Tl，000。第五，本发明提供一种缀合物，其中疏水性聚合物㈧为ClfTC5tl烃或胆固醇。第六，本发明提供一种缀合物，其中共价键(Χ，Υ)为不可降解键或可降解键。第七，本发明提供一种缀合物，其中不可降解键为酰胺键或磷酸键。第八，本发明提供一种缀合物，其中可降解键选自二硫键、酸裂解键、酯键、酸酐键、生物降解键和酶裂解键。第九，本发明提供一种缀合物，其中亲水性聚合物(Α或B)为分子量为1，000^10, 000的非离子聚合物。第十，本发明提供一种缀合物，其中亲水性聚合物选自下组聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。第十一，本发明提供一种结合聚乙二醇的固相支持物，其结构如下
权利要求
1.存活素特异性SiRNA和聚合物的缀合物，其结构如下A-X-R-Y-B 其中，A和B之一为亲水性聚合物且其另一为疏水性聚合物；X和Y各自独立地为简单的共价键或接头介导的共价键；且R为存活素特异性siRNA。
2.根据权利要求I所述的缀合物，其中所述存活素特异性siRNA(R)的单链由19-31个核苷酸组成。
3.根据权利要求I所述的缀合物，其中所述存活素特异性siRNA(R)的单链为核苷酸序列 SEQ ID No. Γ4 之一。
4.根据权利要求I所述的缀合物，其中所述存活素特异性SiRNA(R)具有化学修饰。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述化学修饰包括至少下述之一 将磷酸二酯键修饰为硫代磷酸酯连接； 将戊糖2’ -位上的-OH修饰为2’ -OCH3或2’ -脱氧-2’氟尿嘧啶核苷；和 通过连接戊糖的2’ -位和4’ -位而将戊糖2’ -位上的-OH修饰为锁核酸型式。
6.根据权利要求I所述的缀合物，其中所述疏水性聚合物的分子量为25(Tl，000;所述亲水性聚合物为分子量为1，00(Γ10，000的非离子聚合物；且所述共价键为不可降解键或可降解键。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述疏水性聚合物为ClfTC5tl饱和烃或胆固醇。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述不可降解键为酰胺键或磷酸键；且所述可降解键选自二硫键、酸裂解键、酯键、酸酐键、生物降解键和酶裂解键。
9.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述亲水性聚合物包括至少下述之一聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
10.一种纳米微粒，其包含权利要求I所述的缀合物。
11.一种组合物，其包含权利要求I所述的缀合物作为药物有效成分。
12.—种组合物，其包含权利要求10所述的纳米微粒作为药物有效成分。
全文摘要
本发明提供一种siRNA-聚合物缀合物及其制备方法，更具体地，涉及一种通过siRNA和用于提高siRNA生物稳定性的聚合物的共价结合而形成的杂合缀合物，以及制备该杂合缀合物的方法。本发明的缀合物能提高siRNA的生物稳定性，从而实现治疗性siRNA向细胞的有效传递，且即使相对低浓度的小剂量也具有siRNA的活性。因此，该缀合物不仅可有利地用作癌症和其它传染性疾病的siRNA治疗工具，也可用作一种新型的siRNA传递系统。
文档编号A61P35/00GK102888404SQ20121030155
公开日2013年1月23日 申请日期2010年5月13日 优先权日2009年5月14日
发明者韩宝蓝, 朴翰浯, 申美湜, 李三用 申请人:株式会社百奥尼