专利名称：一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于制药领域，涉及一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的其制备方法。
背景技术：
紫杉烷类药物(如紫杉醇、多烯紫杉醇等)是目前临床上所使用的最有效的抗肿瘤药物之一。紫杉醇为七十年代发现的从红豆杉或其种属的树皮或针叶中分离得到的天然产物多烯紫杉醇为半合成产物，之后发现这是一类具有特殊抗肿瘤作用机制的抗肿瘤剂。紫杉烷类药物的抗肿瘤作用机制是促进微管聚合，降低微管的解聚速度，从而使微管处于稳定的非功能性状态，从而达到阻止肿瘤细胞有丝分裂和增殖的目的。且临床前研究表明多烯紫杉醇与紫杉醇相比，对微管的亲和力更强、血浆半衰期更长及细胞内滞留时间更长。尽管紫杉烷类药物具有良好的抗肿瘤作用，但是其水溶性均较低(约lOug/ml)， 因此临床上所使用的紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液均需要分别使用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80 (吐温-80)以及助溶剂乙醇来到溶解紫杉醇药物的目的。紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液则最早分别是由美国百时美施贵宝公司和法国赛诺菲-安万特公司成功开发上市的产品。虽然使用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80后可以配制成注射液，但是其在临床应用中的毒副作用较大，容易引起较多的并发症，较为常见的包括过敏反应、骨髓抑制(主要表现为中性粒细胞减少)、液体潴留、神经毒性、脱发等不良反应。大量的研究显示聚氧乙烯蓖麻油在体内可促进大量组织胺释放，进而产生过敏反应，还可导致神经传导延迟感觉神经病变。此外，聚氧乙烯蓖麻油还可以在血液中形成微小颗粒包囊紫杉醇分子，影响了药物分子向组织的扩散，从而影响了其抗肿瘤效应。还有研究表明聚氧乙烯蓖麻油可溶解PVC输液器中的二乙烯己基邻苯二甲酸盐(Diethylehexy Phthalate)。而聚山梨酯80 (吐温-80)具有溶血性，且黏度大，临床用药很不方便。上述注射液制剂在毒副作用、给药方便性以及稳定性等方面均存在一定的问题，因此开发新的紫杉烷类药物给药剂型成为必要。许多生物相容性的聚合物可以用来制备聚合物外壳，包裹在不溶于水的药理活性药物的外部。实际上任何一种聚合物，天然的或是人工合成的，只要能根据需要在其结构内含有巯基或二硫键，就可以用于在实际上不溶于水的药理活性药物的周围形成一层二硫键交联外壳。含有半胱氨酸和/或二硫键的蛋白质是药学上可接受的生物学载体，本专利以人血清白蛋白为例。人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量66. 5kDa，是人血浆中最丰富的蛋白质(占人体血浆总蛋白的 50% -60% )，具有化学性能稳定、安全无毒、无免疫原性、生物相容性好、生物可降解、体内长循环(半衰期长达19天)的特点。
HSA作为抗肿瘤药物载体材料，具有很多优点，主要包括①优越的药物负载潜力HSA多肽链上带有较多的极性基团及疏水性氨基酸，对 70%的小分子药物、特别是难溶性药物具有高度的亲和力，且可发生可逆结合，为其有效负载和释药提供可能；白蛋白二级结构中含有约48%的α-螺旋结构，15% β-折叠片结构， 其余为无规线团结构，因此具有很多的网状空隙，为携带药物创造了有利的空间条件。②广谱肿瘤靶向白蛋白是肿瘤细胞的重要氮源，快速生长的肿瘤具有很强的摄取和储备白蛋白能力。HSA作为抗肿瘤药物载体，通过与血管内皮细胞膜上的白蛋白受体结合，激活细胞膜上的窑蛋白，从而将抗肿瘤药物转移到肿瘤细胞间质中。肿瘤细胞间质和肿瘤细胞表面富含大量的半胱胺酸酸性分泌性蛋白，该蛋白功能类似于白蛋白受体，能专门吸引和粘附白蛋白，而半胱胺酸酸性分泌性蛋白在几乎所有的肿瘤组织(膀胱、肝脏、卵巢、肾、消化道、乳腺等)都过度表达，这就形成了肿瘤组织中的药物储藏池，为载有抗肿瘤药物的白蛋白纳米载体的广谱靶向杀伤提供了可能。③结构可修饰性HSA结构中含有大量的反应活性基团，如游离氨基、羧基、巯基等，可与抗肿瘤药物通过化学键偶联，改善药物溶解性、提高体内循环时间以及肿瘤靶向性；也可与抗体或配体等“靶分子”偶联，进一步提高HSA纳米载体的肿瘤靶向性能。近年来，也有报道将HSA和葡聚糖、己醛醣或聚异丙基丙烯酰胺等高分子材料相偶联以改善HSA 作为药物载体材料的理化性质。鉴于HSA作为药物载体材料具有独特优势，目前国内外对基于白蛋白的药物递送系统研究主要集中于两个方向①前体药物利用HSA大量的反应活性基团，将药物、尤其是抗肿瘤药物(阿霉素、 紫杉醇、多烯紫杉醇、甲氨喋呤、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶)化学偶联于HSA的游离氨基、羧基或巯基，以改善药物溶解性、提高体内循环时间以及肿瘤靶向性，国外已有较多报道。然而通过将HSA和药物直接化学偶联，存在以下问题1)药物可选择范围窄药物需有一定的反应活性基团，且在化学偶联过程中药物易失效；2)疗效发挥的不定性药物与HSA之间化学键断裂的容易程度决定了药物疗效的发挥，过快断裂，HSA失去作为载体材料的优势，过慢断裂，药物则无法发挥疗效；3)成本高，载药量低偶联过程中，药物投料量远远大于HSA，而偶联药物量有限，造成制备成本大(特别是抗肿瘤药物原料价格昂贵)，体系载药量低的缺陷。②纳米递药体系物理包封药物可显著提高载体材料对药物的负载。目前，国内外报道的白蛋白纳米粒制备或载药工艺主要有乳化凝聚法、去溶剂化法、PH凝聚法以及Nab 技术。前三种方法虽然研究应用时间最长，报道最多，但仍存在很多问题1)粒径大。纳米粒粒径0. 5-10 μ m，且易受操作条件影响，小于200nm的白蛋白纳米粒几无报道，过大的粒径不利于纳米载体通过肿瘤的EI^R效应蓄积于肿瘤；2)需固化。由于HSA高度水溶，所制得的纳米粒子需要固化操作，S卩加入化学交联剂使白蛋白发生交联或加热使蛋白发生变性，前者毒性较大，且易使药物同时发生交联而失去疗效，后者则不适合温度敏感药物的负载；另外，还有人认为采用交联或加热固化的方法会减少HSA纳米粒表面的亲水性，从而减少在血液中循环时间，不利于肿瘤靶向；3)后处理工艺复杂。由于工 艺中使用了表面活性剂、油、化学交联剂等有毒添加齐IJ，需以大量有机溶剂清洗纯化，但是少量残留仍将给用药安全带来隐患；采用高速离心分离(16000-2(KKK)g)收集纳米粒，不仅对仪器要求高，而且在水中重分散性差；4)适用药物范围小。仅适合于水溶性药 物的负载，而相当一部分抗肿瘤药物为难溶性药物。Nab技术是美国生物科学公司近年来建立的药物结合白蛋白纳米技术。该技术仅适合于血浆蛋白结合率比较高的脂溶性药物的包裹。2005年，以该技术制备的紫杉醇结合白蛋白纳米粒(凯素 )获得FDA批准上市，主要用于转移性乳腺癌联合化疗失败后或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌。该制剂相对于传统的聚氧乙烯蓖麻油制剂(泰素 )具有更低的毒性、更好的疗效，但是也存在不少缺陷，包括1)毒性溶剂的使用。采用氯仿为溶媒，虽有真空蒸发操作， 但增加了工艺难度，并且产品可能有溶剂残留；2)载药量低。仅能控制在2-10wt%，需消耗大量的HSA ;3)体内外稳定性差。该制剂在pH>5.8条件下，药物在几小时内极易析出，因此制剂PH值需控制在pH5. 4-5. 8范围内(在此范围也仅稳定24h)。而人体内环境pH值为7. 4，该制剂进入血液循环以后，预计药物短时间将从载体析出而不利于肿瘤的特异性摄取，目前临床上用药剂量是泰素 制剂的1. 5倍。由于超声波技术等制备方法均不能用于工业化规模的生产，并且其得到的微粒粒径太大，这使其不合适和不能用于病人给药使用。因此美国生物科学有限公司在专利 US2007082838以及CN98808225和CN97199720中记载了并要求分别保护用高压勻化方法制备可以重制的多烯紫杉醇/紫杉醇和人血清白蛋白的冷冻干燥制剂，且所得重构后混悬液的稳定性超过24小时。高剪切技术具有超强的混合、粉碎、分散、乳化等功能，对于SBS、SBR等高分子弹性材料有特别显著的粉碎效果，能有效解决各类物料的粉碎、乳化难题，取代了传统的胶体磨设备。与传统的生产工艺相比，具有能耗低、生产成本低、产品质量高、超细化等优势。在CN98808225和CN97199720专利中记载并要求保护含有水不溶性药物以及蛋白质包衣颗粒的药物输送系统及其制备方法，其中所述的颗粒平均直径为10-200nm。其所述药物组合系统的制备方法为将含所述水不溶性药物并在其中分散的有机相和含蛋白质的水性介质组成的混合物置于3000-30000Psi的高压勻浆器内，使其接受高剪切处理，产生上述颗粒，并且该组合物不含有表面活性剂。本发明人曾多次重复上述专利的实施例，特别是CN97199720的实施例1、5和6，不曾得到在此专利的实施例和权利要求中所说明的结果。本发明人制备了所公开的混合物， 然后在其所推荐的压力范围内用Avestin高压均质机对混合物进行处理，得到pH = 6. 8的纳米乳剂，并且按照专利中所述的用旋转蒸发器蒸发除去溶剂，可产生平均粒径约为220nm 的纳米颗粒，在进行冷冻干燥后加入生理盐水后很容易重制成为混悬液，但是其纳米颗粒大小较冷冻干燥前明显增加，平均粒径由冷冻干燥之前的220nm增大为390nm，且在4h内即出现纳米颗粒的沉淀。此外，以专利CN97199720中所记载的微孔滤膜进行过滤，但结果是滤器很容易出现堵塞，且药物产率低于30%，这与专利中所陈述的70-100%的产率结果不同。在US2007082838专利中记载并要求保护加入稳定剂柠檬酸钠和/或氯化钠的包含多烯紫杉醇药物的白蛋白纳米粒，其平均粒径< 200nm，并且如专利中所述，这些用高于勻化方法得到的纳米乳剂据称有很高的稳定性，此处术语“稳定性”的意义既表示平均粒径不随时间或冷冻干燥过程而变化，也表示不出现纳米颗粒的药物沉淀(US200708283，实施例 12)。本发明人曾多次重复上述专利的实施例，特别是US200708283的实施例11，16，和 18，不曾得到在此专利实施例和权利要求书中所公开的结果。本发明人制备了所公开的混合物，然后在其推荐的压力范围内用Avestin高压均质机对其处理，得到pH = 7. 2的纳米乳剂，利用旋转蒸发器蒸发除去有机溶剂后，产生平均粒径约280nm的纳米颗粒。但是很快出现纳米颗粒的沉淀，在进行所述的微孔滤膜过滤(1. 2um，0. 8um，0. 45um和0. 22um)时较难，滤膜容易出现堵塞的情况，且其冻干物在生理溶液中重制后形成的纳米混悬液不稳定， 约8小时内出现肉眼可见的沉淀，这些与专利中声称的稳定性大于24小时的结果截然不同。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述问题和缺点，本发明提供一种制备工艺更简单、性质更稳定以及更佳的临床应用性质的蛋白纳米颗粒。 本发明的另一个目的是提供上述蛋白纳米颗粒的制备方法。本发明人在制备蛋白纳米颗粒的过程中无意中发现，当将水溶性载体材料(如， 聚乙二醇，甘露醇，PVP，等)加入蛋白质体系后，包载紫杉烷类药物的蛋白质纳米颗粒更易形成，同时粒径均勻，稳定性提高。为了考察此水溶性载体材料在体系中的作用，本发明人研究了水溶性载体材料与蛋白质类之间的关系，令人惊奇的是，透射电镜和差示扫描量热的结果均反映出，此二者并不是简单的混合体系，而是通过相互作用形成了一种新的复合体系。我们推测由于此新的复合体系的形成，使得紫杉烷类药物可以更好的被包载，从而使得制备工艺的可操作性显著提升，同时使得纳米颗粒更稳定与更均勻。由于此新复合体系的显著优势，本发明人继而尝试将此水溶性载体与紫杉烷类药物先混合，使紫杉烷类药物以分子分散的形式存在于水溶性载体中，二者以固体分散体的形式加入蛋白质类溶液中，混合并经过高剪切力的作用形成紫杉烷类药物的蛋白质纳米颗粒。结果发现蛋白质纳米颗粒更易形成，稳定性更佳；同时，该纳米颗粒具有明显的血液长循环和组织、器官靶向性，具有更优良的药效学性质。本发明提供一种将紫杉烷类药物(如紫杉醇，多烯紫杉醇，等)以分子分散状态的形式加入到一个纳米级别载体的制备方法。该方法比nab技术更易获得紫杉烷类药物纳米颗粒(平均直径小于200纳米)，且不需加入任何有毒的有机溶剂(如，二氯甲烷，氯仿，等等)，避免了有机溶剂在制剂中的残留，大大提高临床用药的安全性。同时，本发明提供一种蛋白纳米颗粒，该蛋白纳米颗粒对紫杉烷类药物载药量高， 可以显著降低蛋白质类物质的用量；该蛋白纳米颗粒还具备良好的体内外稳定性，液体制剂在室温条件下可长时间稳定保存，提高用药方便性和安全性。该方法所获得的紫杉烷类药物的纳米颗粒具有明显的血液长循环和组织、器官靶向性，因此具备更加良好的药效学性质。综上所述，本发明提供一种制备工艺更简单、性质更稳定以及更佳的临床应用性质的蛋白纳米颗粒。该蛋白纳米颗粒具有粒径均勻、稳定性好、安全性好高等特征。本发明的目的是通过下列技术方案实现的
—种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒，该蛋白纳米颗粒的配方含有下列重量百分比的物质0. 1 10%紫杉烷类药物，0. 1 40%水溶性载体材料，50 90%蛋白质类物质。所述的蛋白纳米颗粒，其中紫杉烷类药物选自下列物质中的一种或多种紫杉醇， 多烯紫杉醇，或者它们的衍生物。所述的蛋白纳米颗粒，其中所述水溶性载体材料选自下列物质中的一种或多种 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、甘露醇、尿素、海藻酸钠、羟丙基纤维素钠、聚丙烯酸树脂、明胶、羧甲基纤维素钠。本发明所称的蛋白质类物质是指能够通过巯基和/或二硫键交联的下列物质天然存在或合成的蛋白质及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的类蛋白及其衍生物，或者它们的混合物。所述天然存在的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血红蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、纤维蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物选自含有游离巯基和/或二硫基修饰的下列物质中的一种或多种聚乙醇、聚乙基恶唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸内酯或其共聚物、合成聚氨基酸。 所述的蛋白纳米颗粒的制备方法，该方法包括下列步骤a.将紫杉烷类药物与水溶性载体材料制成含有紫杉烷类药物的水溶性载体固体分散体；b.将所得的固体分散体加入含蛋白质类物质的水性介质中，混合均勻，混合物经高剪切条件处理得到包裹了紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的混悬液；c.将混悬液进行干燥或先经过无菌过滤再干燥，按所需剂型制成包裹了紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的固体制剂、半固体制剂或气体制剂；或者将步骤b得到混悬液直接作为液体制剂或进一步制备成其他类型的液体制剂、或将混悬液干燥或先经过无菌过滤再干燥后再复溶制成液体制剂。所述的制备方法，其中水性介质选自注射用水，纯水，甘露醇溶液，磷酸盐水溶液， 右旋糖酐溶液，葡萄糖水溶液，氯化钠水溶液，氨基酸溶液，维生素溶液，碳水化合物溶液， 或它们的任意两种或两种以上的混合物。所述的制备方法，其中制备含有紫杉烷类药物的水溶性载体固体分散体的方法为熔融法、溶剂法、溶剂_熔融法、溶剂_喷雾(冷冻)干燥法、研磨法、或双螺旋挤压法；且这些方法不引入任何有机溶剂或者任何除乙醇之外的其他有机溶剂；优选采用溶剂-熔融法；(熔融法、溶剂法、溶剂-熔融法等方法是制备固体分散体的常规方法。例如，将药物用乙醇溶解(溶剂)，水溶性载体加热熔融(熔融)，两者混合，此即溶剂-熔融法。再例如， 将药物加热熔融，水溶性载体加热熔融，两者混合，此即熔融法。如果是溶剂_熔融法，则为 “不需要引入任何除乙醇之外的其他有机溶剂”即，只用乙醇。如果是熔融法，则为“不需要引入任何有机溶剂”。本发明优选采用的是溶剂-熔融法，溶剂-熔融法相较熔融法的优势是有些药物直接熔融，会导致温度过高，发生降解，稳定性不能保证，因此本专利主要采用溶剂-熔融法，具体采用何种方法可以根据选用的药物及载体的性质决定。)
所述高剪切条件是指应用同时具备高压和高切变力的设备，使混合物达到高效的混合、粉碎、分散及乳化目的；其中，高压是指压力范围在5000至30000磅/英寸2，优选 6000 25000磅/英寸2。所述的制备方法，其中该蛋白纳米颗粒的平均粒径为20 lOOOnm，优选为20 200nmo 所述的制备方法，其中干燥方法采用冷冻干燥或喷雾干燥；无菌过滤采用 0. 22 μ m滤器过滤。详细地说，本发明是提供一种将紫杉烷类药物(如紫杉醇，多烯紫杉醇，等)以分子分散状态的形式加入到一个纳米级别载体的制备方法。该方法比nab技术更易获得紫杉烷类药物小纳米颗粒(平均直径小于200纳米)，且不需加入任何有毒的有机溶剂(如，二氯甲烷，氯仿，等)。该方法所获得的紫杉烷类药物的纳米颗粒更加稳定，并且载药量高，具有明显的血液长循环和组织、器官靶向性，因此具备更加良好的药效学性质。该方法提供一种通过去溶剂技术形成紫杉烷类药物的纳米颗粒的方法，比如，高剪切力(如超声，高压勻浆作用或类似条件)可被用来在缺乏任何常规表面活性剂和任何聚合核心物质的条件下形成纳米颗粒的基质。该方法提供一种可重复使用的小纳米颗粒(直径小于200纳米)的制备方法，该颗粒可通过0. 22微米滤器无菌过滤。这种可通过0. 22微米滤器过滤的一定大小的纳米颗粒的制备意义重大，因为含有大量任何蛋白质(如白蛋白)的制剂均不能用常规的方法如高压灭菌进行消毒，因为热可使蛋白变性。当然，如果采用孔径更大的滤器也可将颗粒的平均粒径控制在IOOOnm左右，但本发明优选将颗粒的平均粒径控制在20 200nm。在水性介质中加入蛋白质类物质(例如，人血清白蛋白)的浓度范围约为 0. 05-25% (w/v, g/ml，下同)，范围在0. 5%-10% (w/v)内更好。这些水性介质有生理盐水、缓冲生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液或类似的介质，以及任何2种以上这些介质的混合物。与常规的纳米颗粒形成方法不同，混合物内不需要加入表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、卵磷脂、吐温80、多聚醇F68和类似化合物等)或有毒有机溶剂(例如，二氯甲烷、氯仿等)。将紫杉烷类药物(紫杉醇、多烯紫杉醇等)与水溶性载体(如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆等)通过熔融法、溶剂法或熔融溶剂法等方法制备成一种紫杉烷类药物和水溶性载体的固体分散体(粉末)。该固体分散体的形成不需要引入任何除乙醇之外的其他有机溶剂，甚至根本不需要引入有机溶剂，避免了有机溶剂(如氯仿，二氯甲烷等) 在制剂中的残留，大大提高临床用药的安全性。于低剪切力下经均化作用形成一种由微米和纳米小滴组成的混合物。这可以通过本领域技术人员公知的方式来完成，例如，采用一种操作范围在大约2，000至大约15，000
转/分钟的常规实验室均浆器。载药纳米颗粒是在高剪切力条件下经均化作用形成的。这种均化作用通常在高压均浆器内进行，典型的操作压力在5，000至30，000磅/英寸2的范围内，此过程在6，000至 25，000磅/英寸2范围内进行更好。生成的乳剂含极细微的水性载体纳米小滴(含溶解的药理活性物质等)和极细微的蛋白质纳米小滴。可接受的均化方法包括可赋予高剪切和空化作用，如高压均浆器、超声处理器、高剪切搅拌器，和类似设备。
液体混悬物可经干燥得到包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的粉末。生成的粉末可于任何合适的时间和在适宜的水性介质中再分散得到能对哺乳动物给药的混悬液。这些水性介质有生理盐水、缓冲生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液或类似的介质，以及任何2种以上这些介质的混合物。为得到这种粉末所采用的方法包括冷冻干燥、喷雾干燥，和类似的技术。通过除去其内含的水分，例如，在适宜的温度-时间范围内用真空冷冻干燥方法即可进一步转换成粉末形式。蛋白质(例如，人血清白蛋白)本身起冷冻保护剂作用，不需要使用常规冷冻保护剂如甘露醇、蔗糖、甘油，和类似的化合物，并且这种粉末通过加入水、 生理盐水或缓冲液可以容易地重组。尽管不需要，但当然可以理解为如十分必要，这些常规的冷冻保护剂可以加入到本发明的配方中。

根据本发明一个实施方案，提供了一个形成极为细小的亚微米颗粒(纳米颗粒)， 即直径小于200纳米的颗粒的方法。这种颗粒在以液体混悬液方式使用之前能进行无菌过滤。本发明配制过程所得最终产品(即药物颗粒)能无菌过滤是有重要意义的，因为不可能用常规方法如压热器对含高浓度蛋白质(例如，人血清白蛋白)的混悬液进行灭菌。所述包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒在制药中的应用，该蛋白纳米颗粒可以用于胃肠道给药和非胃肠道给药所用。该蛋白纳米颗粒的制剂形式可以是固体剂型、半固体剂型、液体剂型以及气体剂型，包括冻干粉、胶囊剂、颗粒剂、软膏剂、糊剂、混悬剂、注射剂、 喷雾剂、吸入剂等。本项发明的实施中，许多生物相容性的蛋白质类物质可以用来制备蛋白纳米颗粒的载体外壳，包裹于紫杉烷类药物的外部。实际上任何一种蛋白质类物质，天然的或是人工合成的，只要能根据需要在其结构内含有巯基或二硫键，就可以用于在紫杉烷类药物的周围形成一层二硫键交联外壳。巯基或二硫键可预先存在于聚合物结构中或可以通过适当的化学修饰导入，例如天然存在的聚合物如蛋白质、肽、多核苷酸、多聚糖(如淀粉、纤维素、 葡聚糖、褐藻胶、脱乙酰壳多糖、果胶、透明质酸等)、蛋白多糖、脂蛋白等均是用这种修饰的候选者。本发明中的蛋白质类包括白蛋白(含有35个半胱氨酸)、免疫球蛋白、酪蛋白、月旨蛋白、血红蛋白(每一个α 2β2单位含有6个半胱氨酸残基)、溶菌酶(含有8个半胱氨酸残基)、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、纤维蛋白原、脂肪酶等。其中蛋白质、肽、酶、抗体及其它们的混合物是本发明常规应用的蛋白质类物质。目前用于本发明的优选的蛋白质类物质是白蛋白。例如α-2-巨球蛋白(一种周知的调理素)，可以用于增强巨噬样细胞对载体包裹的紫杉烷类药物的摄取，或可以促进这种载体包裹的紫杉烷类药物进入到肝脏和脾脏。同样，含有半胱氨酸残基的合成多肽也是在紫杉烷类药物的外周形成外壳的蛋白质类物质的良好的候选者。另外，聚乙烯醇、聚羟乙基异丁烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等均是化学修饰(如引入巯基和/或二硫键)，和形成外壳(如引起交联)的良好候选者。所以，计划用于本发明实施的这些材料的例子是，含有半胱氨酸残基和/或二硫键的合成多氨基酸；聚乙烯醇，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚羟乙基异丁烯酸酯，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚丙烯酸，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚乙噁唑啉，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚丙烯酰胺，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚乙烯吡咯烷酮，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚二醇，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；聚交酯、聚乙交酯、聚己酸内酯，或它们共聚物，经修饰后含有自由巯基和/或二硫键；以及上述 材料的任何两种或多种的混合物。本发明的有益效果本发明提供一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的制备方法，该方法将混悬的紫杉烷类药物颗粒包封于一种由可生物相容的复合聚合物壳体内，其直径为纳米级。该方法不需要引入任何除乙醇之外的其他有机溶剂，甚至根本不需要引入有机溶剂，避免了有机溶剂(如氯仿，二氯甲烷等)在制剂中的残留，并且不会产生因添加助溶剂或乳化剂而引起的过敏反应，大大提高临床用药的安全性；该方法也不需要使用常规的表面活性剂。该方法提供一种更易形成和更加稳定的紫杉烷类药物纳米颗粒，该方法工艺简单、成本低、操作性强。该方法本发明同时提供一种能无菌过滤的纳米颗粒的制备方法。同时，本发明提供一种蛋白纳米颗粒，该蛋白纳米颗粒对于紫杉烷类药物的载药量高，可以显著降低蛋白质类物质的用量；该蛋白纳米颗粒还具备良好的体内外稳定性，液体制剂在室温条件下可长时间稳定保存，提高用药方便性和安全性。该方法所获得的紫杉烷类药物的纳米颗粒具有明显的血液长循环和组织、器官靶向性，因此具备更加良好的药效学性质。综上所述，本发明提供一种制备工艺更简单、性质更稳定以及更佳的临床应用性质的蛋白纳米颗粒。该蛋白纳米颗粒具有载药量高、粒径均勻、稳定性好、安全性高等特征。


图1是熔融法制备紫杉醇白蛋白纳米制剂强度粒径分布图。(纵坐标是强度百分比(％ )，横坐标是粒径(nm)，图2、图7-图11均类同。)图2是熔融-溶剂挥发法制备紫杉醇白蛋白纳米制剂强度粒径分布图。图3是WAXD图。其中样品a 紫杉醇粉末，样品b 冻干人血清白蛋白粉末，样品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物，样品d 紫杉醇制剂样品。图4是DSC图。其中样品a 冻干人血清白蛋白粉末，样品b 紫杉醇粉末；样品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物；样品d 紫杉醇制剂样品。图5是透射电镜图。其中样品a:人血清白蛋白冻干粉末，样品b:聚乙二醇白蛋白粉末，样品c 紫杉醇白蛋白纳米制剂冻干粉末。图6是荧光扫描图。图中随着曲线a —h方向，聚乙二醇浓度增加。图7是多烯紫杉醇白蛋白纳米制剂强度粒径分布图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1通过熔融法作用制备紫杉醇白蛋白纳米颗粒将500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。1200毫克聚乙二醇于60°C油浴加热完全熔融后，将紫杉醇溶液加入其中，磁力搅拌直至其完全混合均勻，旋转蒸发除去乙醇后， 在剧烈搅拌条件下迅速冷却。真空干燥过夜后，将固体分散体加入85毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5% w/v, g/ml，下同)。混合物经高速分散器(XHF-1，上海金达生化仪器厂)预混1分钟以形成粗乳，然后转移到高压均质机(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。高压均质在5000-30，000磅/英寸2的条件下进行，将乳剂重复循环至少5次，得蛋白纳米颗粒混悬液，获得的产品有较浓的乳光。经激光粒径仪(NanO-ZS90，英国Malvern公司)测定，结果得到的紫杉醇白蛋白纳米颗粒一般直径在130-220纳米，结果如图1所示。蛋白纳米颗粒混悬液在不添加任何冷冻保护剂的情况下进一步冻干48小时，得到的粉状物可通过添加无菌水或生理盐水很容易重构成蛋白纳米颗粒混悬液。重构后颗粒的大小与冻干前大致相同。实施例2通过熔融_溶剂挥发法制备紫杉醇白蛋白纳米颗粒将300毫克紫杉醇溶解于6. 0毫升乙醇。900毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升无水乙醇，在45°C油浴加热完全熔融后，将紫杉醇溶液加入其中，磁力搅拌直至其完全混合均勻， 旋转蒸发除去乙醇后，在剧烈搅拌条件下迅速冷却。真空干燥过夜后，将固体分散体加入 65毫升人血清白蛋白水溶液中(4.5%w/v)。混合物经高速分散器(XHF-1，上海金达生化仪器厂)预混1分钟以形成粗乳，然后转移到高压均质机(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin 公司)中。乳化在5000-30，000磅/英寸2的条件下进行，将乳剂重复循环至少6次，得蛋白纳米颗粒混悬液，获得的产品有较浓的乳光，经激光粒径仪(NanO-ZS90，英国Malvern公司)测定，结果得到的紫杉醇白蛋白纳米颗粒一般直径在120-200纳米，结果如图2所示。蛋白纳米颗粒混悬液在不添加任何冷冻保护剂的情况下进一步冻干48小时，得到的粉状物可通过添加无菌水或生理盐水很容易重构成蛋白纳米颗粒混悬液。重构后颗粒的大小与冻干前大致相同。实施例3小于200纳米的可无菌过滤的紫杉醇白蛋白纳米颗粒的制备将500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。800毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升无水乙醇，在45°C油浴加热完全熔融后，将紫杉醇溶液加入其中，磁力搅拌直至其完全混合均勻， 旋转蒸发除去乙醇后，在剧烈搅拌条件下迅速冷却。真空干燥过夜后，将固体分散体加入97 毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5 % w/v)。混合物经高速分散器(XHF-1，上海金达生化仪器厂)预混1分钟以形成粗乳，然后转移到高压均质机(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。乳化在10000-40，000磅/英寸2的条件下进行，将乳剂重复循环至少6次，得蛋白纳米颗粒混悬液，获得的产品有较浓的乳光，经激光粒径仪(NanO-ZS90，英国Malvern公司)测定，结果得到的紫杉醇白蛋白纳米颗粒一般直径在120-170纳米。蛋白纳米颗粒混悬液通过一个0. 22微米的微孔滤器进行过滤，混浊性或颗粒大小没有任何改变。紫杉醇含量的HPLC分析显示超过95%的紫杉醇过滤后可回收，结果如表 1所示。此方法可提供一种无菌的紫杉醇白蛋白纳米混悬液。无菌混悬液在不添加任何冷冻保护剂的情况下进一步冻干48小时，得到的粉状物可通过添加无菌水或生理盐水很容易重构成蛋白纳米颗粒混悬液。重构后颗粒的大小与冻干前大致相同。表 权利要求
1.一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒，其特征在于该蛋白纳米颗粒的配方含有下列重量百分比的物质0. 1 10%紫杉烷类药物，0. 1 40%水溶性载体材料，50 90%蛋白质类物质。
2.根据权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于紫杉烷类药物选自下列物质中的一种或多种紫杉醇，多烯紫杉醇，或者它们的衍生物。
3.根据权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于所述水溶性载体材料选自下列物质中的一种或多种聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、 甘露醇、尿素、海藻酸钠、羟丙基纤维素钠、聚丙烯酸树脂、明胶、羧甲基纤维素钠；所述蛋白质类物质是能够通过巯基和/或二硫键交联的下列物质天然存在或合成的蛋白质及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的类蛋白及其衍生物，或者它们的混合物。
4.根据权利要求3所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于所述天然存在的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血红蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、纤维蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物选自含有游离巯基和/或二硫基修饰的下列物质中的一种或多种聚乙醇、聚乙基恶唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸内酯或其共聚物、合成聚氨基酸。
5.如权利要求1所述的蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤a.将紫杉烷类药物与水溶性载体材料制成含有紫杉烷类药物的水溶性载体固体分散体；b.将所得的固体分散体加入含蛋白质类物质的水性介质中，混合均勻，混合物经高剪切条件处理得到包裹了紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的混悬液；c.将混悬液进行干燥或先经过无菌过滤再干燥，按所需剂型制成包裹了紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒的固体制剂、半固体制剂或气体制剂；或者将步骤b得到混悬液直接作为液体制剂或进一步制备成其他类型的液体制剂、或将混悬液干燥或先经过无菌过滤再干燥后再复溶制成液体制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述水性介质选自注射用水，纯水，甘露醇溶液，磷酸盐水溶液，右旋糖酐溶液，葡萄糖水溶液，氯化钠水溶液，氨基酸溶液，维生素溶液，碳水化合物溶液，或它们的任意两种或两种以上的混合物。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于制备含有紫杉烷类药物的水溶性载体固体分散体的方法为熔融法、溶剂法、溶剂_熔融法、溶剂_喷雾(冷冻)干燥法、研磨法、 或双螺旋挤压法；且这些方法不引入任何有机溶剂或者任何除乙醇之外的其他有机溶剂； 优选采用溶剂_熔融法；所述高剪切条件是指应用同时具备高压和高切变力的设备，使混合物达到高效的混合、粉碎、分散及乳化目的；其中，高压是指压力范围在5000至30000磅 /英寸2，优选6000 25000磅/英寸2。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于该蛋白纳米颗粒的平均粒径为20 lOOOnm，优选为 20 200nm。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于干燥方法采用冷冻干燥或喷雾干燥； 无菌过滤采用0. 22 μ m滤器过滤。
全文摘要
本发明属于制药领域，公开了一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒及其制备方法。该颗粒的配方含有下列重量百分比的物质0.1～10％紫杉烷类药物，0.1～40％水溶性载体材料，50～90％蛋白质类物质。该方法先将紫杉烷类药物与水溶性载体材料制成含有紫杉烷类药物的水溶性载体固体分散体；再将所得的固体分散体加入含蛋白质类物质的水性介质中，混合均匀，混合物经高剪切条件处理得到包裹了难溶性药物的蛋白纳米颗粒的混悬液；然后进一步制成所需剂型。该蛋白纳米颗粒具有载药量高、粒径均匀、稳定性好、安全性高等优点，该方法避免了有毒的有机溶剂残留，提高临床用药的安全性，且工艺简单、成本低、操作性强。
文档编号A61P35/00GK102327230SQ20111029978
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者周建平, 崔蓓, 霍美蓉 申请人:中国药科大学