专利名称：一种动物通用人工红细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以猪血红蛋白为基础的血红蛋白脂质体即一种动物通用人工红细胞的制备方法，属于生物医学领域。
背景技术：
输血是临床上一项重要的抢救和治疗措施，尤其在急救医学中的作用是其它任何手段无法完全替代的，其应用非常广泛。在动物临床医学中，输血疗法也是很重要的一种治疗方法。但由于输血可能导致的疾病的感染和传播,血液贮存期短,动物血型种类繁多和血液来源紧张以及动物相关血库尚未建立等原因，动物输血疗法的应用受到了限制。目前国内宠物的输血目前大都饲养活体犬和猫来满足输血的需求，血型的限制比较大，有成本高，操作复杂繁琐的缺点。寻找安全有效的血液替代品成为世界范围的研究热点。猪血红蛋白脂质体微囊动物人工红细胞具有有效扩充血容量并向组织供氧、复苏濒临死亡的宠物及珍稀动物的功能，在宠物医学、奶牛业、良种畜禽治疗及保护野生动物治疗上具有广泛应用前
旦
-5^ O由于血红蛋白储存期长、来源广泛，因此以血红蛋白为原料的血液代用品被广泛研究。但是游离血红蛋白能与NO结合，也能与血管收缩肽内皮素、巨噬细胞、白细胞和血小板作用，导致血管收缩，血压升高；同时血红蛋白被降解释放铁离子也能使细菌快速生长而造成败血症；血红蛋白在血浆中易解聚为二聚体分子，在血浆循环中的半衰期仅为2-4h,且会产生强烈的肾毒性，导致肾功能下降。一种经5-磷酸吡哆醛(PLP)交联的血红蛋白血液替代品再用戊二醛进行分子间关联，形成大分子血红蛋白，使血红蛋白的半衰期延长。Sloan等在美国18个创伤中心对112例失血性休克患者进行了多中心、随机、单盲的临床试验，有患者均多聚血红蛋白或生理盐水500毫升注入。其结果却显示血红蛋白溶液组28d死亡率显著高于对照组，虽然死亡率差异是否完全是由于直接的输血或其他因素导致，还应当应进一步分析调查，这一结果限制了血红蛋白溶液在临床上的应用。Powanda研究表明交联PolyHb-SOD-CAT的血红蛋白，不会造成短暂性脑缺血再灌注模型缺血的组织损伤，也不会造成血脑屏障破坏或脑水肿。为延长血红蛋白的循环半衰期，通常还采用惰性分子如聚乙二醇修饰来增大相对分子质量，该血液替代品具有较长的血浆半衰期、低P50值和高粘度等特点。PEG可以保持Hb的氧结合部位的结构完整性，降低Hb免疫原性，提高血红蛋白存留时间，减少过敏和免疫反应。聚乙二醇修饰的血红蛋白，具有独特的PEG-Hb的结合物分子特性，PEG-Hb的四聚体其结构和较高稳定性。PEG-Hb可以降低NO减少而导致的血压升高，并增大血红蛋白的分子质量防止血红蛋白溢出到组织间隙。重组血红蛋白由基因工程生产而成，该制品可以解决Hb来源问题，不受输血相关传染病的影响，通过基因突变方法改变了 Hb空间结构，使重组Hb不容易与NO结合，因此具有较好的前景。但由于目前技术水平的限制，重组Hb在细菌或真核细胞中表达率较低，产物分离纯化困难等，因此造成Hb的纯化费用过大，影响了该制品的商业化。脂质体可以屏蔽无基质血红蛋白的毒副作用，且延长血红蛋白的血浆半衰期。Terajima等的研究也表明，通过检测血流动力学、血液平均动脉血压、中心静脉压，心脏指数值在液体休克复苏时脂质体血红蛋白可以保护微循环免受损伤。Sakai等的研究证明，在大鼠出血性休克模型复苏实验中，LHl对出血性休克的大鼠能迅速恢复血压，并能显著改善功能性毛细血管的密度和组织的氧合作用，脂质体血红蛋白能正常保存I年以上。

发明内容
本发明的目的是提供一种动物通用人工红细胞的制备方法。本发明方法无毒、收率高，得到的人工红细胞大小均匀，适于应用，操作简便，制备得到的人工红细胞对于动 物兔、猫、犬是安全的，无免疫原性，不会激活动物的正常免疫系统功能，输血时不需要验血型，可以直接使用节省抢救时间。一种动物通用人工红细胞的制备方法，包括以下步骤大豆卵磷脂和胆固醇按质量比例2:1充分溶于10-20ml乙醚中，再加入IOml提纯的浓度范围为100-250g/L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. IMPa至-O. OlMPa减压旋转缓慢蒸发，水浴温度为20_35°C，除去乙醚，再加入IOml生理盐水洗涤，同时40KHZ水浴超声振荡5_10min，形成人工红细胞；500rpm离心5min去除下层大颗粒人工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层人工红细胞，然后40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，500rpm离心3_5min ;取上液，收集人工红细胞；所得的动物通用人工红细胞直径小于10微米。本发明所使用的血红蛋白为猪红细胞破碎提取液。所使用的制备方法为胀破法，将得到的上清液依次通过5. O μ m，I. 2 μ m，O. 22 μ m微孔滤膜过滤，得到无基质猪血红蛋白。测得在波长540nm下稀释100倍后A值为O. 784，根据下列公式计算猪血红蛋白浓度C=K* 稀释倍数 *OD540其中Κ=0· 170计算出血红蛋白浓度为133. 3g/L。本发明解决了目前脂质体类血液替代品制备过程中使用有毒有机溶剂的问题如目前制备大都会用到氯仿，而氯仿是有毒药品，对心、肝、肾有损害，吸入或经皮肤吸收引起急性中毒；且光照时会与空气中的氧气作用，逐渐被分解成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢。而光气是剧毒物质，常用来农药生产，人吸入3200mg/m3即可致死。我们使用的是低毒的有机溶剂乙醚，这样即使存在少量的残留，也不会对动物机体产生很大的影响，同时不会导致气体污染以及操作人员吸入有毒物质氯仿和光气的危险，保障了操作人员的人身安全。而且乙醚低毒，对血红蛋白活性无影响。反应过程中严格控制温度，反应条件温和。经血红蛋白活性保持验证试验证明本发明所采用的条件对血红蛋白的活性无影响。本方法采用同时加入血红蛋白溶液和有机溶剂减压旋转蒸发，在整个过程中乙醚同大豆卵磷脂分散在血红蛋白周围，形成“油包水，水包油”的一种动态的平衡，随之乙醚的挥发减少，大豆卵磷脂逐渐将血红蛋白溶液包裹起来，形成人工红细胞。由于减少常规方法中制备脂质体膜的过程和缩短了水和脂质体膜的过程，整个过程只需要5-6小时，同专利201110050117中采用常规方法制备脂质体人工红细胞至少需要4_6天的时间相比，本方法极大地缩短了人工红细胞的制备时间。本发法通过同时减压旋转蒸发血红蛋白溶液和有机溶剂、水浴超声和探头超声等手段协同作用，不仅是人工红细胞的大小较为均一，还提高了血红蛋白的包裹率通过高速离心法测得未包裹的猪血红蛋白溶液的浓度为41. 3g/L，通过制备前后血红蛋白浓度的对t匕，可以计算出包裹率为38%，与樊晶等在天津医药，32 (2)，101-103，2004中《脂质体包裹人血红蛋白微囊的制备及其对大鼠血液的影响》报道包裹率为27. 7%，洪民等在中国生物化学与分子生物学报，17 (6)，772 776，2001中《脂质体包埋猪血红蛋白的制备及其注入小鼠体内的初步试验》报道包裹率为10-30%以及专利201110050117中脂质体人工红细胞包裹率为25%左右对比，包裹率有了较大的提 升。本方法还使用了梯度离心处理最后获得的人工红细胞，利用不同的转速对红细胞施加不同的离心力，从而将大小不同的人工红细胞分离。在本方法中先500rpm离心5分钟，取上液6000rpm离心5min,取下层,可以将大颗粒人工红细胞去除,收集大小适合人工红细胞收集，探头超声将较大的人工红细胞变小，再通过500rpm离心3_5min取上液。本方法可以通过该手段得到大小较为均一的脂质体人工红细胞。


图I是本发明制备的动物通用人工红细胞的直观示意图；图2是人工动物通用红细胞显微镜照片。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例I200mg大豆卵磷脂和IOOmg胆固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提纯的血红蛋白浓度为133. 3g/L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液于加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. 05MPa减压旋转蒸发加热，使水浴温度为20°C，除去乙醚，加入IOml生理盐水洗漆,40KHZ水浴超声振荡5-10min,形成人工红细胞。500rpm离心5分钟,去除下层大颗粒人工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层大小适合人工红细胞，40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，使红细胞粒径减小，500rpm离心5min。取上液，收集人工红细胞，用生理盐水稀释至20ml人工红细胞，在显微镜下人工红细胞呈圆形。将稀释后的人工红细胞溶液15ml输给约I. 5kg健康新西兰兔，兔存活15天以上。实施例2200mg大豆卵磷脂和IOOmg胆固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提纯的血红蛋白浓度为133. 3g/L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液于加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. 05MPa减压旋转蒸发加热，使水浴温度为20°C，除去乙醚，加入IOml生理盐水洗漆,40KHZ水浴超声振荡5-10min,形成人工红细胞。500rpm离心5分钟,去除下层大颗粒人工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层大小适合人工红细胞，40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，，使红细胞粒径减小，500rpm离心5min。取上液，收集人工红细胞，用生理盐水稀释人工红细胞至20ml，将稀释后的人工红细胞溶液3ml耳缘静脉输给约I. Ikg健康新西兰兔，输血前和输血后兔临床指标体温和心跳等正常，检测并比较输血前和输血后血常规和尿常规红细胞数目和白细胞数目只有小幅度的增加红细胞数目从6. 25X IO12/L增加到10. 02X1012/L,白细胞数目从6. 5X109/L增加至Ij 7. 2X 109/L，血红蛋白含量从144g/L增加到222g/L，说明人工红细胞没有激活兔的免疫系统和猪血红蛋白到兔体内后被释放出来；尿胆原有略微增加到33mmol/L，表明猪血红蛋白在兔体内被释放后在血液中会逐步被机体代谢。兔输血实验说明人工动物通用红细胞对兔安全可用。实施例3200mg大豆卵磷脂和IOOmg胆固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提纯的血红蛋白浓度为133. 3g/L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液于加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. 05MPa减压旋转蒸发加热，使水浴温度为20°C，除去乙醚，加入IOml生理盐水洗漆,40KHZ水浴超声振荡5-10min,形成人工红细胞。500rpm离心5分钟,去除下层大颗粒人 工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层大小适合人工红细胞，40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，使红细胞粒径减小，500rpm离心5min。取上液，收集人工红细胞，用生理盐水稀释人工红细胞至20ml，将稀释后的人工红细胞溶液Iml输给约O. 520kg健康猫，监测猫输血前和输血后5天的血常规和尿常规白细胞数、红细胞数目和血红蛋白在输血后第一天增加，分别达到23. 8X 109/L、10. 62X 1012/L，263g/L，之后均恢复恢复正常水平。其中红细胞数目只是轻微的增加。表明输血没有导致猫产生输血反应。蛋白质、胆红素和尿胆原升高后持续2-4天，其中蛋白质、胆红素和尿胆原在输血后第一天达到最大值3g/L、8. 6 μ mol/L、66 μ mol/L,随后逐步恢复输血前的正常水平，输入的血红蛋白在逐步被代谢。输血前和输血后猫临床指标正常。输血实验说明人工动物通用红细胞对猫安全可用的。实施例4200mg大豆卵磷脂和IOOmg胆固醇充分溶于20ml乙醚中，再加入IOml提纯的血红蛋白浓度为133. 3g/L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液于加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. 05MPa减压旋转蒸发加热，使水浴温度为20°C，除去乙醚，加入IOml生理盐水洗漆,40KHZ水浴超声振荡5-10min,形成人工红细胞。500rpm离心5分钟,去除下层大颗粒人工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层大小适合人工红细胞，40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，，使红细胞粒径减小，500rpm离心5min。取上液，收集人工红细胞，用生理盐水稀释人工红细胞至20ml，将稀释后的人工红细胞溶液13ml分别输给2只约3kg健康犬，监测犬输血前和输血后5天的血常规和尿常规在输血后犬I和犬2白细胞数.在8. 1-17 X 109/L之间，血红蛋白含量在135-198g/L之间，属于正常范围内。犬I犬2中胆红素分别达到66umoL/L和100umoL/L和蛋白质均达到彡3. Og/L,其趋势是2_3天内升高后慢慢降低到输血前的正常水平，尿胆原持续的略有升高。输血前和输血后犬的临床指标正常。输血实验人工动物通用红细胞对犬安全可用的。
权利要求
1.一种动物通用人工红细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 大豆卵磷脂和胆固醇按质量比例2:1充分溶于10-20ml乙醚中，再加入IOml提纯的浓度范围为 IO O - 2 5 O g/ L的猪血红蛋白溶液，将混合溶液加入旋转蒸发仪中，转速为90rpm, -O. IMPa至-O. OlMPa减压旋转缓慢蒸发，水浴温度为20-35 °C，除去乙醚，再加入IOml生理盐水洗涤，同时40KHZ水浴超声振荡5_10min，形成人工红细胞；500rpm离心5min去除下层大颗粒人工红细胞，取上液6000rpm离心5min，收集下层人工红细胞，然后40KHZ探头超声5秒，停10秒，共10次，500rpm离心3_5min ;取上液，收集人工红细胞；所得的动物通用人工红细胞直径小于10微米。
全文摘要
本发明公开了一种动物通用人工红细胞的制备方法，将大豆磷脂和胆固醇按比例溶于有机溶剂乙醚；再将猪血红蛋白溶液加入到乙醚溶液中；将混合溶液旋转蒸发，除去乙醚；加入生理盐水洗涤，水浴超声振荡；离心、洗涤、收集人工红细胞；超声，离心，取上清。所述的动物通用人工红细胞大小为直径小于10微米。本发明方法无毒、收率高，得到的人工红细胞大小均匀，适于应用，操作简便，制备得到的人工红细胞对于动物兔、猫、犬是安全的，无免疫原性，不会激活动物的正常免疫系统功能，输血时不需要验血型，可以直接使用，节省抢救时间。
文档编号A61K38/42GK102836126SQ20121025565
公开日2012年12月26日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者贾杏林, 丁维, 李晓云, 莴小庆, 周放 申请人:湖南农业大学