专利名称：细胞毒性cd44抗体免疫偶联物的制作方法
技术领域：
本发明是关于细胞毒性化合物与抗体的新的偶联物。包含此种化合物的药物组合物，及其在肿瘤疗法上的用途。
有许多研究企图将此种药物与抗肿瘤相关抗原的抗体偶联，以求用针对目标的方式输送至肿瘤，来提升药物的局部浓度，增进抗肿瘤药物的效能。有许多这类方法已臻至有限的成功，并且在文献中也已经对数种原因进行讨论来解释失败的结果。为了使诸如14-羟基柔红霉素(doxorubicin)或甲氨喋呤(methotrexate)的抗癌药物以化学计量的方式作用，因此较高的细胞内浓度对于呈现所需细胞毒性而言是必需的。这些浓度被认为以许多抗体-药物偶联物很难达成，因为(a)有许多普通的抗癌药物的效力不足，(b)抗原目标物在细胞表面的浓度太低，(c)抗原-抗体复合物未有效内化进入目标细胞，和(d)来自目标细胞内部偶联物的游离药物不能有效释出(Chari等人，1992年)。
先前提到的两种缺点，亦即(a)与(b)已由Chari及其共事者说明过(Chari等人，1992年；Liu等人，1996年；美国专利案第5,208,020号)。他们制备的抗体偶联物中的抗体是经由一种二硫键与美登木素生物碱(maytansinoid)连接。美登素属于安沙(Ansa)大环内酯类抗生素，其得自奴卡氏菌(Nocardiasp.)。由细菌发酵所生产的美登素安沙分裂素(ansamitocin)P-3，被用做制造美登木素生物碱DM1的前体分子。美登素及其衍生物的作用为抗有丝分裂剂(微管蛋白聚合的抑制剂)，类似于长春新碱，但具有显著高于长春新碱或其他已建立的化疗剂的效力(DM1在体外以～10-10M浓度即对细胞具有毒性)。相对于游离的美登木素生物碱的高细胞毒性，该抗体偶联物具有的毒性在抗原阴性细胞上要低于抗原阳性细胞数个数量级。二硫键连接具有的优点是这些键可以很容易被细胞内的谷胱甘肽在目标细胞中切断，释出具高毒性的游离药物。这一方法已被应用到对抗肿瘤相关抗原的抗体上，例如C242-DM1偶联物(Liu等人，1996年；Lambert等人，1998年)，和HuN901-DM1(Chari等人，2000年)。然而，这些偶联物的应用却受到限制，因为，相对应的目标抗原的表达有限。例如，被N901(CD56，N-CAM)识别的抗原主要是由神经内分泌来源的肿瘤所表达，而C242抗原(CanAg)的表达则大多受限于来源于肠胃道(GI)的肿瘤。
然而，吾人仍需藉由发现具有较佳抗原表达形式的适当的肿瘤相关抗体、在目标组织中高且具特异性的细胞表面抗原浓度、和有效的内化过程使与抗原复合的抗体偶联物被输送到细胞内部，来改进此方法。
CD44是一种蛋白质，其以数种相异的同种型表达在许多种细胞类型的表面。最小的同种型，亦即标准的CD44(CD44s)，是由各种不同的细胞表达，而被认为是介导细胞与细胞外培养基成份粘附，并且可以在淋巴细胞和单核细胞的活化中辅助刺激。相对的，在细胞外区域含v6结构域的CD44剪接变体(CD44v6)的表达则被限制在上皮细胞的亚系中。CD44v6的生理角色尚未完全被了解。
CD44v6以及其他变体的外显子(CD44v3，CD44v5，CD44v7/v8，CD44v10)等经显示为一种肿瘤相关抗原，在人类肿瘤和正常组织中有可利用的表达形式(Heider等人，1995年；Heider等人，1996年；Dall等人，1996年；Beham-Schmid等人，1998年；Tempfer等人，1998年；Wagner等人，1998年)，且被用于以抗体为基础的诊断和治疗方法中，尤其是肿瘤的放射免疫疗法(RIT)上(stromer等人，2000年，WO95/33771，WO97/21104)。
然而，有效地用抗体-美登木素生物碱偶联物杀死肿瘤细胞的先决条件是目标抗原充分内化。只有极少关于CD44进入细胞内部的数据可获得。Bazil和Horejsi报告过在以PMA刺激时，白细胞上CD44的下调乃是因为抗原的脱落而非内化所致(Bazil和Horejsi，1992年)。CD44的脱落亦被数项报导支持，该报导是关于肿瘤患者和正常个体的血清中的可溶性CD44(Sliutz等人，1995年；Guo等人，1994年，Martin等人，1997年)。在最近Aguiar等人的论文中，CD44在培养基完整的软骨细胞上内化的量大约为4小时内6％(Aguiar等人，1999年)。相似的肿瘤细胞上CD44v6低量内化的结果在以BIA实行的实验中被发现。把这些数据汇集，它们提出CD44受体较可能脱落而非内化，因此CD44特异性抗体并不被认为是美登木素生物碱偶联物的方法的适当候选者。这点业已由体外细胞增殖检验结果支持，其中AbCD44v6-DMI显示与缺乏该抗原的细胞相比较，其对抗原呈递细胞仅有些微提高的细胞毒性。
目前已出人意料地发现CD44特异性抗体藉由在细胞内可被切断的连接体连接至其高度细胞毒性的药物，在体内是非常有效的肿瘤疗法。
本发明提供包含CD44特异性抗体分子，而该分子经由在细胞内条件下可切断的连接体连接至具高度细胞毒性的药物的新的化合物。
尤其，本发明提供一种式A(LB)n(式(I))的化合物，其中A是对CD44具特异性的抗体分子；L是连接体分子部分；B是对细胞具有毒性的化合物；且n是n＝1至10的十进位数字。
所述抗体分子A对于CD44具有高度的结合特异性，优选对变体CD44有结合特异性。
“抗体分子”一词涵盖由淋巴细胞产生的完整免疫球蛋白，例如存在于血清者、以及由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体、由重组表达在宿主细胞中生产的多肽，其具有免疫球蛋白或单克隆抗体的结合特异性、以及经由进一步加工而得自所述免疫球蛋白、单克隆抗体或多肽，而能保留其结合特异性者。尤其，“抗体分子”一词包括包含两条重链和两条轻链的完整的免疫球蛋白，此种免疫球蛋白的片段如Fab，Fab′或F(ab)2片段(Kreitman等人，1993年)，重组方式生产的多肽，嵌合的、人类化的或完全的人类抗体(Breitling和Duebel，1999年；Shin等人，1989年；Gussow和Seemann，1991年；Winter等人，1994年，EP0 239 400，EP0 519 596；WO90/07861 EP0 368684；EP0 438 310；WO92/07075，WO92/22653，EP0 680 040，EP0 451 216)单链抗体(scFv，Johnson和Bird，1991年)及类似者。目前抗体亦可不必对实验室动物进行免疫接种即生产，例如藉由噬菌体展示法(Aujame等人，1997年；US5,885,793；US5,969,108；US6,300,064；US6,248,516；US6,291,158)。完全的人抗体可使用携带功能性人Ig基因的转基因小鼠来制备(EP0,438,474；EP0,463,151；EP0,546,073)。从先前提到的文献参考中，专家可从其知道如何生产这些型式的抗体分子，采用典型的方法像自动的肽和核酸合成、实验室动物免疫接种，杂交瘤技术，聚合酶链反应(PCR)，载体和表达技术、宿主细胞培养和蛋白质纯化方法。以下“抗体”和“抗体分子”可互换使用。
“对CD44具特异性”意指抗体分子对CD44上存在的表位具有专一的结合亲和力。在一项优选实施方案中，本发明的抗体分子对于由人类CD44基因的外显子v6变体编码的氨基酸序列具有结合特异性。外显子v6变体以及其他外显子变体的序列是本领域中已知者(Screaton等人，1992年；Tolg等人，1993年；Hofmann等人，1991年)。本发明的较佳的抗体分子会与具有或包含随附的序列一览表中的氨基酸序列SEQ ID NO1，或该序列的等位基因变体的肽或多肽专一地结合。优选，所述抗体分子对所述序列内的表位有结合特异性。优选，该抗体分子特异地结合至具有氨基酸序列SEQ IDNO2的肽，甚至更好的是结合至具有氨基酸序列SEQ ID NO3的肽。此种抗体可用本领域已知的方法很容易地生产(WO95/33771，WO97/21104)，例如用化学合成的具有先前提过的序列的肽，例如与牛抗原结合的，对实施室动物进行免疫接种，或者用重组生产的包含所述序列的融合蛋白进行免疫，并根据本发明已知的方法进行生产(Harlow，1988年；Catty，1988年；Koopman等，1993；Heider等，1993)。
优选，根据本发明的抗体分子是命名为VFF-18的小鼠单克隆抗体，其是以1994年六月七日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Deutschland/德国)的杂交瘤细胞系(保藏号为DSM ACC2174)生产的。也优选该单克隆抗体VFF-18的Fab，Fab′或F(ab)2片段。在另一项优选实施方案中，该抗体分子是人类化的重组抗体，其中VFF-18的互补性决定区(CDR′s)已被移植到人类免疫球蛋白的重链和轻链的相应基因之中。
单克隆抗体的“互补决定区”理解为与特异性抗原结合有关的那些氨基酸序列，如Kabat et al.，1991，和Chothia and Lesk，1987所述。
在另一项优选实施方案中，是将适当的此种CDR移植抗体的框架残基转变成小鼠的残基以增进结合亲和力。从和本领域有关的方法之中，专家会知道怎样得到VFF-18的CDR′s，从先前提到的具保藏编号DSM ACC2174的杂交瘤开始，选择并获取适当的人类免疫球蛋白基因，将CDR′s移植到该基因，修饰经挑选的框架残基，使CDR移植抗体在适当的缩主细胞中表达，例如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，并测试所得到重组抗体的结合亲和力和特异性(请参考例如以上的参考文献)。在另一项优选实施方案中，该抗体分子是具有抗体VFF-18的CDR的重组抗体。优选，此种重组抗体是人类化的抗体，并且是包含两个完整轻链和两个完整重链的完整免疫球蛋白。在本发明的另一项优选实施方案中，该抗体分子是与VFF-18抗体具有相同独特型的重组抗体。在本发明的另一项优选实施方案中，该抗体分子是结合至与抗体VFF-18同样的表位的重组抗体。
在一项尤其优选的实施方案中，该抗体分子A是包含具氨基酸序列SEQ ID NO4的轻链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。这种抗体称为BIWA 4，其为以上提过的抗体VFF-18的人类化版本，在完全人类框架中具有小鼠的单克隆抗体VFF-18的互补决定区，和人类的恒定区。因此，其在人体为免疫原性非常低的抗体，这是一项有利的特性。然而，因为其不具有小鼠的使抗原结合达到最佳的框架残基，因此其具有比亲代抗体VFF-18的显著较低的抗原结合亲和力，因此不被认为是医疗药物的好的候选者。未预料到的是，吾人发现BIWA4，尽管其结合亲和力很低，但却具有非常好的生物分布且在体内有非常好的肿瘤摄取结果，使其较诸VFF-18的其他具有较高结合亲和力的人类化版本更优越(Veral et al.，2002)。在一项更佳的具体实例中，抗体分子A是包含具有氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链，和氨基酸序列SEQ ID NO6的重链的抗体。这种抗体比BIWA4具有较高的结合亲和力，被称做BIWA8。
这些抗体可以如下方式生产。编码重链和轻链的核酸分子可藉由标准方法用化学和酶的方式合成。首先，适当的寡核苷酸可用本领域已知的方法合成(例如，Gait，M.J.，1984年)，该方法可用于生产人工合成的基因。用以从寡核苷酸产生合成基因的方法已见知于本领域中(例如，Stemmer等人，1995年；Ye等人，1992年；Hayden和Mandecki，1998年；Frank等人，1987)。优选，编码BIWA 4的轻链和重链的核酸分子分别具有SEQ ID NO5和SEQID NO7的核苷酸序列。这些序列包括编码被宿主细胞切割的前导肽的序列(SEQ ID NO5前60个核苷酸；SEQ ID NO7前57个核苷酸)。在进一步的具体实例中，编码根据本发明的抗体分子的重链与轻链的核酸分子分别具有SEQ ID NO9和SEQ ID NO7的核苷酸序列。然后这些编码抗体重链和轻链的核酸分子可经克隆到一个表达载体上(可使两种链均在一个载体上，或每个链克隆到分开的载体分子上)，然后将其导入宿主细胞中。适用于在原核或真核宿主细胞中表达免疫球蛋白的表达载体和将载体导入宿主细胞的方法在本领域中是已知的。通常，所述免疫球蛋白基因与适当的启动子功能性连接，所述启动子如人巨细胞病毒(CMV)启动子，仓鼠遍在蛋白质启动子(WO97/15664)，或猴病毒SV40启动子，它们位于Ig基因的上游。为终止转录，需要使用适当的终止/多腺苷酸位点，如牛生长激素或SV40的那些。另外，增强子序列也应包括在其中，如CMV或SV40增强子。通常，所述病毒载体还包括选择标记基因，如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，谷氨酰胺合成酶基因，腺苷脱氨酶基因，腺苷酸脱氨酶基因，或新霉素抗性基因，博莱霉素抗性基因，或嘌呤霉素抗性基因。各种表达载体可从商业渠道购买，如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA。例如，表达载体pAD-CMV1(NCBI基因库登录号码A32111)或pAD-CMV19(NCBI基因库登录号码A32110)可用于表达。该宿主细胞优选哺乳动物的宿主细胞，例如COS，CHO或BHK细胞，更好是中国仓鼠的卵巢(CHO)细胞，例如CHO-DUKX(Urlaub和Chasin，《PNAS》(美国国家科学院志)，第77期(7)4216-20页(1980年))，CHO-DG44(Urlaub等人，《细胞》，第33期405-412页(1983年)，或CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞。然后将该宿主细胞于抗体生产的条件下，培养在适当的培养基中，然后根据标准程序将抗体从培养物中分离出来。用于在宿主细胞中从重组DNA生产抗体的方法和对应的表达载体为本领域中已详知者(请参考，例如WO94/11523，WO97/9351，EP0481 790，EP0 669 986)。
为了将抗体分子A连接到对细胞有毒性的化合物B上，所以使用一种连接的分子部分L。在最简单的情形中，该连接用的分子部分L是化学键，优选在细胞内的条件下能被切断的共价键。在本发明的一项具体实例中，该链介于抗体分子的硫原子(例如位在半胱氨酸的侧链者)和另一个在毒性化合物中的硫原子之间。在另一项具体实例中，该连接用分子部分L由1个或更多原子或化学基团组成。适当的连接基团已详知于本领域，且包括二硫化物基团、硫醚基团、易被酸破坏的基团、易受光破坏的基团、易受肽酶破坏的基团和易被酯酶破坏的基团。较佳者为二硫化物基团和硫醚基团。
本发明的抗体分子与毒性化合物的偶联物可利用目前已知或较晚研发出来的技术来形成。该毒性化合物可经修饰以产生游离的氨基，然后经由一个易受酸破坏的连接物或者易受光破坏的连接物而连接到抗体分子上。该毒性化合物可与肽缩合并紧接着连接至一种抗体分子以产生易被肽酶破坏的连接物。该毒性化物可经处理以产生一级羟基，该羟基可经琥珀酰基化并连接至抗体分子而产生能被细胞内的酯酶切断以释出游离药物的偶联物。最好是将该毒性化合物处理使其产生游离或经保护的硫醇基团，然后将一个或更多含有二硫化物或硫醇的毒性化合物以共价方式经由二硫键连接至抗体分子。
例如，抗体分子可藉由已知的方法用交连剂如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，4-琥珀酰亚氨基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丁酸酯(SDPB)，N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚氨基-5-(2-吡啶基二硫代)戊酸盐、2-氢硫醇亚胺。或乙酰基琥珀酸酐来进行修饰，请参考，Carlsson等人，1978年；Blattler等人，1985年；Lambert等人，1983年；Klotz等人，1962年；Liu等人，1979年；Blakey和Thorpe，1988年；Worrell等人，1986年。在一项优选实施方案中，连接物分子部分是衍生自SPP的4-硫代戊酸盐或5-硫代戊酸盐。然后将由此得到的含有游离或经保护的硫醇基团的抗体分子与含有二硫化物或硫醇的毒性化合物反应以产生偶联物。该偶联物可藉由HPLC或凝胶过滤法予以纯化。
“有毒的”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的化合物。用于偶合的有毒化合物可具细胞静止或是细胞毒性的作用，且导致细胞周期停止或细胞死亡。这些化合物可在细胞周期不同的阶段起作用，例如藉由干扰核酸合成，使核酸失活，或藉由和微管蛋白结合。
在一项优选实施方案中，对细胞有毒的化合物B是美登木素生物碱，亦即一种美登素(CAS35846538)的衍生物。在优选实施方案中，其是美登木素生物碱的C-3酯。适于和抗体偶联而用于癌症疗法的美登木素生物碱，包括制备该美登木素生物碱及其与抗体分子的连接，已由Chari和其同僚说明过(Chari等人，1992年；Liu等人，1996年；美国专利案第5,208,020号)。这些美登木素生物碱可用于本发明。在一项优选实施方案中，该毒性化合物是N2′-去乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(CAS编号139504-50-0)，亦称为DM1。优选，该美登木素生物碱是一种美登素醇(maytansinol)衍生物，经由二硫键与抗体分子连接在美登素醇的C-3位置上，在一项尤佳的具体实例中，该抗体/美登木素生物碱偶联物可制备自下式的美登木素生物碱式(II) 其中R1代表H或SR4，其中的R4代表甲基、乙基、直链烷基、分支的烷基、环烷基、简单的或经取代的芳基或杂环基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
优选，R1是H，CH3或SCH3，R2是Cl，R3是CH3，且m＝2。
R1＝H，R2＝Cl，R3＝CH3且m＝2的化合物在文献中称为DM1。
在一项优选实施方案中，本发明的化合物具有下式式(III)
其中A是特异于CD44的抗体分子，其优选特异于外显子v6变体，优选特异于SEQ ID NO3氨基酸序列；(L′)是视需要而定的连接体分子部分p是十进位数字，p＝1至10。
优选，p为3至4，更好是大约3.5。
用于制备此种美登木素生物碱的方法在本领域中已知(尤其请参考美国专利案第5,208,020号，实施例1)。方便地制备方法是，第一步，由属于诺卡氏菌属或束丝放线菌属的微生物，例如ATCC31565，ATCC31281(US4,356,265；US4,450,234；WO01/77360)，通过细菌发酵制备美登木素生物碱C-3酯安丝菌素P3。安丝菌素P3可从培养物中用有机溶剂如乙基乙酸酯或甲苯来提取，用例如二氧化硅凝胶通过吸附层析进行进一步纯化。然后用LiAlH4(US4,360,462)或者用近来报道的LiAl(OMe)3H或其他LiAl或NaAl杂合体(WO02/16368)对其还原形成美登素醇。所述美登素醇可例如，应用二环己基碳二亚胺(DDC)(dicyclohexylcarbodiimide)和催化量的氯化锌(US4,137,230；US4,260,609)，在C-3位置用N-甲基-L-丙氨酸或N-甲基-L-半胱氨酸衍生物酯化以产生包含二硫化物的美登木素生物碱(US5,208,020；US5,416k,064；US6,333,410)。在有序那实施方案中，所述美登素醇用下式的N-甲基-N-(3-甲基二硫代丙酰基)-L-丙氨酸 以产生式(II)的美登木素生物碱，其中，R1＝SR4，R4＝CH3，R2＝Cl，R3＝CH3，且m＝2。
所述游离的硫醇基可通过用二硫苏糖醇(DTT)对二硫键的裂解来释放，以产生例如DM1。
当细胞内切割发生时，游离的毒性化合物就被从偶联物A(LB)n释出。从化合物A(LB)n释出的游离药物可具有式B-X，其中X是一个原子或化学基团，视该切割反应的本质而定。优选X是一个氢原子，例如当连接体分子(linker moiety)部分仅是介于两个硫原子中间的共价键时，或X为羟基。该切割部位亦可在连接体分子部分之中，若该连接体分子部分是一个化学基团，当切割时能产生式B-L＂-X的游离药物，其中X是一个原子或一个化学基团，视该切割反应的本质而定，优选X是氢原子或羟基。
在一项优选实施方案中，式(I)的化合物的毒性要比毒性化合物B、B-X或当细胞内切割作用发生时所释出的B-L＂-X的毒性小。体外检测细胞毒性的方法在本领域中已知(Goldmacher等人，1985年；Goldmacher等人，1986年；亦请参考美国专利案第5,208,020号，实施例2)。优选，该化合物(I)的毒性比切割作用时释出的游离药物的毒性要小10倍或更多，更好是100倍或更多，或甚至1000倍或更多。
优选抗体分子/美登木素生物碱偶联物是经由二硫键所连接者，如以上所讨论，其能运送美登木素生物碱分子。此种细胞结合偶联物是藉由已知的方法制备，如用琥珀酰亚氨基吡啶基-二硫代丙酸盐(SPDP)或戊酸盐(SPP)修饰单克隆抗体(Carlsson等人，1978年)。然后将所得到的硫代吡啶基藉由含硫醇的美登木素生物碱处理予以置换，产生以二硫化物连接的偶联物。或者，在芳基二硫代美登木素生物碱的情形中，该抗体偶联物的形成是藉由将先前导入抗体分子的氢硫基直接置换美登木素生物碱的芳基硫醇来实现的。包含1至10种以二硫键连接的美登木素生物碱药物的偶联物很容易由所述方法之一来制备。在本发明书的上下文中，吾人需了解式A(LB)n中的十进位数字n是一个平均数，因为并非所有给定制备物的偶联物分子都具有完全相同的整数个LB残基与抗体分子连接。
更具体地，将浓度为1毫克/毫升(存在于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0，其中包含1mM EDTA)的以二硫代吡啶基修饰的抗体溶液用含有硫醇的美登木素生物碱处理(1.25摩尔当量/二硫代吡啶基)。吡啶-2-硫酮从经修释的抗体释出是以光谱分析术在343纳米波长下进行检测，并且在大约30分钟内完成。将抗体-美登木素生物碱偶联物纯化，并藉由凝胶过滤法通过SephadexG-25柱除去未反应的药物和其他低分子量的物质。每一抗体分子上所结合的美登木素生物碱的数目是藉由测量波长252纳米和280纳米下吸光值的比率来决定。以此方法可得到平均有1-10个美登木素生物碱分子/每个抗体分子经由二硫键连接。
还有一方面，本发明是关于对CD44v6有特异性的抗体分子与美登木素生物碱的偶联物。在本说明书中，“CD44v6专一的”应意指该抗体对于存在于一种肽中的表位有特异的结合亲和力，而该肽具有由CD44的外显子v6变体所编码的氨基酸序列，该CD44则优选人类的CD44。本发明优选的抗体分子能特异地结合具有或包含附带的序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列的肽或多肽，或所述序列的等位基因变体。优选，所述抗体分子对所述序列中的表位具有结合特异性。更优选，所述抗体分子特异性结合具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的肽。
优选，所述偶联物中的抗体分子是单克隆抗体VFF-18(DSM ACC2174)或具有VFF-18的互补决定区(CDRs)的重组抗体。更优选该抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4，或者亦可选择SEQ ID NO8的轻链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。
该美登木素生物碱优选以二硫化物分子部分连接至抗体，且该美登木素生物碱具有下式式(IV) 其中，与抗体的连接是经由如式IV所示的硫原子到存在于抗体分子的第二个硫原子上。为了产生此种能用于键结的硫原子，可藉由导入如以上所列的适当连接体修饰该抗体分子。优选，所述美登木素生物碱通过S-CH2CH2-CO-，-S-CH2CH2CH2CH2-CO-或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-基团连接抗体分子。在所述连接体基团中的所述硫原子与美登木素生物碱形成二硫键，而羰基官能团被键合到抗体分子中氨基酸残基侧链上存在的氨基官能团上。
通过上述方式，一个或多个美登木素生物碱残基连接到抗体分子上。
最优选的是CD44v6特异性的抗体分子和美登木素生物碱的偶联物，其中所述的抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4的轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链，且其中所述的美登木素生物碱具有下式式(IV) 并且其通过二硫键与抗体连接。优选，所述连接基团是-S-CH2CH2CH2CH2-CO-或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-，并且每个抗体分子结合美登木素生物碱残基的数目是3到4个。
在另一实施方案中，本发明是关于生产式(I)化合物的方法，其包括以下步骤(a)将游离的或经保护的硫醇基导入对CD44具特异性的抗体分子；(b)使步骤(a)的抗体分子与对细胞有毒的化合物反应，该化合物具有一个或更多二硫化物或硫醇基团；且(c)回收所产生的偶联物。
优选，该抗体分子对CD44v6具特异性，更好是对SEQ ID NO3的氨基酸序列具特异性，且该对细胞有毒的化合物是美登木素生物碱，更优选为式(II)的美登木素生物碱，最好是具有R1＝H，R2＝Cl，R3＝CH3和m＝2的美登木素生物碱。在更佳的具体实例中，该抗体包含具有氨基酸序列SEQ IDNO4或SEQ ID NO8的轻链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。
在所述方法的优选实施方案中，(2-吡啶基)-3-二硫代丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯)，(2-吡啶基)-4-二硫代戊酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基二硫代)-戊酸酯)或(2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-琥珀酰亚氨基-5-(2-吡啶基二硫代)-戊酸酯)可用于将游离的或经保护的硫醇基引入到抗体分子中。本发明还涉及由所述方法获得的化合物。
在另一实施方案中，本发明是关于一种包含式(I)化合物的药物组合物，优选与一种医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂在一起的组合物。
适当的医药上可接受的载体、稀释剂和赋形剂是已知的，且可由熟习本领域者测定以做为临床情况的保证。适当的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括(1)杜贝克氏(Dulbecco′s)磷酸盐缓冲的盐溶液，pH大约为7.4，其含有大约1毫克/毫升至25毫克/毫升人类血清白蛋白，(2)0.9％盐溶液(0.9％w/v NaCl)和(3)5％(w/v)右旋糖。
更优选，存在于药物组合物中的抗体分子是单克隆抗体VFF-18，或具有抗体VFF-18的CDR′s(优选在人类框架中)的重组抗体。在另一优选实施方案中，该抗体包括具有氨基酸序列SEQ ID NO4或SEQ ID NO8的轻链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。优选该毒性化合物是式(II)的美登木素生物碱。
本发明的所述化合物可用于各种临床或非临床的应用中，其中毒性化合物靶向细胞表面表达CD44，优选表达CD44v6的细胞。
该偶联物可例如临床上在癌症治疗中自体移植之前，于体外使用以将肿瘤细胞从骨髓移除。治疗可如以下方式实行。从患者或其他个体收获骨髓，然后培养在含有添加了根据本发明的式(I)化合物的包含血清的培养基中，该化合物浓度范围是从大约10微摩尔浓度至1pM摩尔浓度，经大约30分钟至大约48小时，于大约37℃下进行培养。确切的培养的浓度与时间的条件(即等于剂量)可以很容易地由熟悉本领域者测定出来。培养之后，用含有血清的培养基冲洗骨髓细胞，并以根据已知方法的i.v.灌输送回病人体内。在患者于骨髓收获和再灌输经处理细胞之间接受了其他治疗，如消融性的(ablative)化学疗法过程或全身辐射治疗的情况下，该处理过的细胞则利用标准的医学设备在液态氮中冷冻保存。
在另一实施方案中，本发明是关于一种治疗癌症的方法，其包括如以上说明对患者施用一种药物组合物。尤其，本发明的这方面是关于一种治疗需要的患者体内癌症的方法，其包括对患者施用治疗有效量的如以上说明的化合物，或如以上说明的药物组合物。优选该癌症为头部和颈部的鳞状细胞癌(SCC)，食管SCC，肺SCC，皮肤SCC，乳腺腺癌(AC)，肺AC，子宫颈(cervix)SCC，胰腺AC，结肠AC或胃AC。
为了癌症的临床治疗，根据本发明的式(I)化合物可用作检测不育(sterility)和内毒素水平的溶液。偶联物施用的适当方法如下。偶联物可每周施给达一至六周，以i.v.大丸剂(bolus)方式，或以连续输注的方式输注五天。大丸剂可溶于50至100毫升生理盐水施予，该盐溶液中已添加了5至10毫升人类的血清白蛋白。连续输注则可在每24小时期间以250至500毫升的生理盐水形式施予，而该盐溶液已添加了25至50毫升的人血清白蛋白。每次的施用剂量为10毫克至400毫克/每平方米身体表面积。施用于患者的剂量必须够高才能有效，但必须低于毒性限制剂量(dose limiting toxicity)(DLT)。一般而言，低于DLT的充分良好的被耐受剂量被认为是最大可耐受剂量(MTD)。专家会知道如何测定MTD(Lambert等人，1998年)。用于每周施用，MTD可被期望在100至200毫克/平方米的范围。或者，施用的间隔可以更长，例如，二周至四周，优选三周。在此情形之中，MTD可被期望在200至300毫克/平方米的范围。或者，可采5次每日施用剂量，接着数周停止施用，而后可重复予以治疗。在此情形之中，每次施用的MTD被期望在低于100毫克/平方米。例如，偶联物可用单一i.v.输注的方式，以3毫克/分钟，每21日施用之。该施用达7个治疗循环。可以理解，如果临床需要上述使用的剂量可以超出所给定的范围。例如，如果发现MTD比所提示的高，可以以高于400mg/m2的剂量单次给药，或每周可以以高于200mg/m2的剂量给药。
剂量、施用途径、施用计划表、重复性与治疗疗程一般而言视疾病的本质(肿瘤的类型、等级和阶段等)和患者(体质、年龄、性别等)的情况，由负责该治疗的医学专家确定。除了固体肿瘤的治疗，根据本发明的医疗应用尤其有利于做为手术介入的佐剂，以治疗最少的残余疾病。
在另一实施方案中，本发明是关于式(I)化合物用于制备治疗癌症的药物组合物的应用。更好的是，存在于药物组合物中的抗体分子是单克隆抗体VFF-18，或具有抗体VFF-18的CDR′s的重组抗体，优选处在人类的框架中。最好的是一种包含具有SEQ ID NO4或SEQ ID NO8的轻链，与SEQID NO6的重链的抗体分子。优选该毒性化合物具有式(II)的化学式。优选该癌症为头部和颈部的鳞状细胞癌(SCC)，食管SCC，肺SCC，皮肤SCC，乳腺腺癌(AD)，肺AC，子宫颈SCC，胰腺AC，结肠AC或胃AC。
参考文献1.Aguiar DJ，Knudson W，and Knudson CB.Internalization of the hyaluronanreceptor CD44 by chondrocytes.Exp.Cell.Res.252292-302，1999.
2.Aujame L，Geoffroy F，Sodoyer R.High affinity human antibodies by phagedisplay.Hum Antibodies 1997；8(4)155-683.Bazil V and Horejsi V. Shedding of the CD44 adhesion molecule fromleukocytes induced by anti-CD44 monoclonal antibody simulating the effect of anatural receptor ligand.J Immunol 149(3)747-753，1992.
4.Blattler et al，Biochem.2415 17-1524(1985).
5.Breitling F，Duebel SRecombinant Antibodies.John Wiley，New York 1999.
6.Carlsson et al，Biochem.J.173723-737(1978).
7.Catty D.Antibodies.Oxford IR Press 1988.
8.Chari RVJ，Martell BA，Gross JL，Cook SB，Shah SA，Biattler WA，McKenzieSJ，Goldmacher VS. Immunoconjugates containing novel maytansinoidspromising anticancer drugs.Cancer Research 52127-31，1992.
9.Chari RVJ，Derr SM，Steeves RM，Widdison WCDose-response of theanti-tumor effect of HUN901-DM1 against human small cell lung cancerxenografts. Proceedings of the American Association of CancerResearch(2000)41(April 1-5)Abs 4405.
10.Goldmacher et al.，J Immunol 1353648-3651，1985.
11.Goldmacher et al.，J Cell Biol 1021312-1319，1986.
12.Gussow D，Seemann G.Humanization of monoclonal antibodies.MethodsEnzymol.20399-121(1991)13.Guo YJ，Liu G，Wang X，Jin D，Wu M，Ma J，and Sy MS.Potential use ofsoluble CD44 in serum as indicator of tumor burden and metastasis in patientswith gastric of colon cancer.Cancer Res 54(2)422-426，1994.
14.Harlow L D.Antibodies.Cold Spring Harbor Lab.198815.Hayden et Mandecki.Gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides.DNA 7(8)571-7(1988).
16.Heider，K-H，Hofmann，M.，Horst，E.，van den Berg，F.，Ponta，H.，Herrlich，P.，and Pals，S.T.A human homologue of the rat metastasis-associated variant ofCD44 is expressed in colorectal carcinomas and ademonatous polyps.J.Cell Biol.120227-233(1993).
17.Heider KH，Mulder JWR，Ostermann E，Susani S，Patzelt E，Pals ST，AdolfGRA.Splice variants of the cell surface glycoprotein CD44 associated withmetastatic tumor cells are expressed in normal tissues of humans andcynomolgus monkeys. Eur.J.Cancer 31A2385-2391，1995.
18.Heider KH，Sproll M，Susani S，Patzelt E，Beaumier P，Ostermann O，AhomH，Adolf GRA，Characterization of a high affinity monoclonal antibody antibodyspecific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cellcarcinomas.Cancer Immunology Immunotherapy 43245-253，1996.
19.Hofmann，M.，Rudy，W.，Zoller，M.，Tolg，C.，Ponta，H.，Herrlich P.，andGunthert，U.CD44 splice variants confer metastatic behavior in ratshomologous sequences are expressed in human tumor cell lines.Cancer Res.515292-5297(1991).
20.Johnson S，Bird R E.Construction of single-chain derivatives of monoclonalantibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol.20388-98(1991).
21.Koltz et al，Arch.Biochem.Biophys.96605(1962)22.Koopman，G.，Heider，K-H.，Horts，E.，Adolf，G. R.，van den Berg，f.，Ponta，H.，Herrlich，P. Pals，S.T.Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin’s lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associatedvariant of CD44.J.Exp.Med.177897-904(1993).
23.Kreitman R J Hansen H J，Jones A L，FitzGerald D J P，Goldenberg D M，Pastan I.Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibodyLL2 or LL2-Fab′induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma inmice.Cancer Res.53819-825(1993).
24.Lambert et al，Biochem.223913-3920(1983).
25.Lambert JM，Derr SM，Cook S，Braman G，Widdison W，Chari RVJ.Pharmacokinetics，in vivo stability，and toxicity of the Tumor-activated prodrug，C242-DM1，a novel colorectal cancer agent.Proceedings of the AmericanAssociation of Cancer Research(1998)39Abs 355026.Liu et al，Biochem.18690(1979)，Blakey and Thorpe，Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals，11-16(1988).
27.Liu C，Tadayoni BM，Bourret LA，Mattocks KM，Derr SM，Widdison WC，Kedersha NL，Ariniello PD，Goldmacher VS，Lambert JM，Blattler WA，ChariRVJ. Eradication of large colon tumor xenografts by targeted delivery ofmaytansinoids.Proc Natl Acad Sci USA 938618-23，1996.
28.Martin S，Janseri F，Bokelmann J，and Kolb H.Soluble CD44 splice variantsin metastasizing human breast cancer.Int J Cancer 74(4)443-445，1997.
29.Screaton，G.R.，Bell，M.V.，Jackson，D.G.，Cornelis，F.B.，Gerth，U.，and Bell，J.I.Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8912160-12164(1992).
30.Shin S-U，Morrison S L.Production and properties of chimeric antibodymolecules.Methods Enzymol.178459-476(1989).
31.Sliutz G，Tempfer C，Winkler S，Kohlberger P，Reinthaller A，and Kainz C.Immunohistochemical and serological evaluation of CD44 splice variants inhuman ovarian cancer.Br.J.Cancer 721494-1497，1995.
32.Stroomer JW，Roos JC，Sproll M，Quak JJ，Heider KH，Wilhelm BJ，Castelijns JA，Meyer R，Kwakkelstein MO，Snow GB，Adolf GR，van DongenGA. Safety and biodistribution of 99mTechnetium-labeled anti-CD44v6monoclonal antibody BIWA 1 in head and neck cancer patients.Clin Cancer Res6(8)3046-55，200033.Tolg，C.，Hofmann，M.，Herrlich，P.，and Ponta，H.Splicing choice from tenvariant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 211225-1229(1993).
34.Tolcher AW et al.SB-408075，a maytansinolid immunoconjungate directed tothe C242 antigena phase I pharmacokinetic and biologic correlative study.Poster presented at 11thSymp.on new drugs in cancer therapy(Nov 7-10，2000 inAmsterdam).
35.Urlaub and Chasin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77(7)4216-2091980).
36.Urlaub er al.，Cell 33405-412(1983).
37.Verel I，Heider Kh，Siegmund M，Ostermann E，Patzwlt E，Sproll M，SnowGB，Adolf GR，van Dongen GMS.Tumor targeting properties of monoclonalantibodies with different affinity for target antigen Cd44v6 m nude mice bearinghead and neck cancer xenografts.Int.J.Cancer 99396-402(2002).
38.Winter，G.，Griffith，A.D.，Hawkins，R.E.，Hoogenboom，H.R.Makingantibodies by phage display technology.Ann.Rev.Immunol.12，433-455(1994).
39.Worrell et al，Anti-Cancer Drug Design 1179-184(1986).
40.Ye et al.Gene synthesis and expression in E.coli for pump，a human matrixmetalloproteinase.Biochem Biophys Res Commun 186(1)143-991992).
实施例1.材料与方法1.1.体外的细胞增殖试验为了测定存活的细胞，吾人使用细胞效价96AQueous(Cell Titer 96AQueous)非放射性细胞增殖检测(Promega公司出品)。将每孔5000个细胞接种到含90微升没有酚红的培养基的96孔板中。使细胞放置1至3小时，然后添加免疫偶联物在10微升PBS中的连续稀释液。用不含免疫偶联物的细胞做为阴性对照组。将细胞培养在37℃，潮湿的5％CO2氛围中培养4天，然后根据制造商的建议添加20微升的MTS/PMS。在37℃培养另外1-4小时以后，利用ELISA平板读数机记录在490纳米波长下的吸光值。对每一个细胞株而言，分析三个重复样品。利用GraphPad Prism(第3.0版本)软件计算存活的细胞组分的百分率和IC50值。
1.2.制备BIWI 1把对于SEQ ID NO1中的表位有结合特异性的人类化重组抗体BIWA 4连接至如以上说明的美登木素生物碱MD1。该偶联物称为BIWI 1。
产生稳定转染的细胞株。将编码BIWA 4的轻链与重链的基因，即SEQID NO5和SEQ ID NO7连接到表达载体pAD-CMV 1(WO 92/01055；NCBIGenBank查询编号A32111)或pAD-CMV19(NCBI GenBank查询编号A32110)。对于第二种抗体BIWA 8而言，轻链是由具有SEQ ID NO9的基因编码，而重链则与BIWA 4中的相同。稳定转染的细胞株是藉由如下的电穿孔法产生的。吾人使用CHO DUX/57ss(中国仓鼠卵巢细胞的dhfr阴性突变株，经改造能适应无血清的上清液培养)。在胰蛋白酶处理和用RPMI-10(90％RPMI 1640，10％热失活的胎牛血清)使胰蛋白酶失活之后，将细胞用RPMI-0(不含血清的RPMI 1640)冲洗一次，并将1×107个细胞重新悬浮在0.8毫升RPMI-0之中。在添加线性化的DNA(每一质粒20微克；使编码轻链和重链的载体共同感染)之后，利用Hoefer氏电穿孔法在以下条件下进行电穿孔1080μF，320V，1000毫秒，一个脉冲。细胞容许留置5分钟，然后稀释成12500细胞/毫升和2500细胞/毫升于α-MEM 10d中(90％MEM-α，不含核苷且不含去氧核苷(GIBCO BRL出品)，10％热失活的经透析的胎牛血清)。将细胞接种到96孔微量滴定板中(200微升/每孔，分别相当于2500和500个细胞/每孔)。十天之后出现克隆。只对500个细胞/每孔的板作后续处理(3-6个克隆/每孔)。14至15天以后，将得自每孔的上清液以κ/γELISA试验将53个克隆接种于含α-MEM 10d的12孔板中。3至6天以后(视细胞汇合情况而定)，将上清液再次以κ/γELISA检测(连续稀释)，并且利用人类的IgG1标准物予以定量。将细胞冰冻并贮存在液态氮中。53个克隆的IgG含量范围是自12-417ng/ml。挑选10个具有最高表达水平的克隆，并予次克隆如下将每个克隆的细胞接种到96孔的微量滴定板中，密度为1和5个细胞/每孔在100微升/每孔α-MEM 10d中(每个克隆和每种密度使用一个板)。8天后，将上清液以1∶2稀释，并将此稀释液100微升以κ/γELISA检测，且利用BIWA 4制备物作为标准定量之。将每一克隆的5个次克隆转移到12孔板中。IgG的量是自1.3-908ng/ml的范围。用具有最高表达水平(384-908ng/ml)的14个克隆以氨甲喋呤扩增如下起初将克隆培养在25cm2的含α-MEM 10d和20，50及100nM氨甲喋呤的培养瓶中。待克隆长满后，将上清液以κ/γELISA测试。在紧接的扩增循环中，使氨甲喋呤的浓度提高到2000nM，起初最高表达水平的范围是从10.5-14.8微克/毫升(克隆A31/100，100nM氨甲喋呤)。进一步用500nM的氨甲喋呤进行扩增，产生19-20微克/毫升的表达(A31/500)。
抗体的纯化。以如下方式从细胞培养上清液纯化抗体。将含有抗体的组织培养上清液上样至5毫升蛋白A Sepharose柱上，在4℃以80-90毫升/每小时的流速进行。用50毫升结合缓冲液(0.1M磷酸钠，pH7.5)冲洗之后，用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7)洗脱Ig的级分。对波长280纳米的吸光值进行监测。
用SPP修饰BIWA 4以形成BIWA 4-SS-Py。用液态形式供应BIWA 4，在含Tween 20的PBS制剂中的浓度为5毫克/毫升。在将DM1偶合到MAb之前，先把Tween 20除去。用25mM MES缓冲液(pH5.6，含50mM NaCl)(MES缓冲液)将MAb溶液(40毫升)稀释15倍，然后上样至Sepharose S管柱(12.5毫升)上，该柱已用MES缓冲液(流速100cm/小时)平衡过。将该柱用10倍柱体积的MES缓冲液冲洗。抗体则以含有400mM NaCl的MES缓冲液洗脱。将抗体溶液对450mM磷酸钾缓冲液，pH6.5，含50mM NaCl和2mM EDTA(缓冲液A)进行透析。用SPP((2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰BIWA 4抗体以导入二硫代吡啶基。将缓冲液A中的MAb(185毫克，8毫克/毫升)用EtOH中过量7倍摩尔的SPP(5％v/v MAb溶液)进行修饰。使反应在室温下进行90分钟。然后用凝胶过滤层析对反应混合物进行处理，使之通过以缓冲液A平衡过的Sephadex G25F(2.6×31.5cm柱，167毫升)。将含MAb的级分汇集，藉由测量280nm的吸光值以及在343nm的吸光值变化来测定修饰的程度，该吸光值变化是由添加DTT所释出的2-巯基吡啶所引起。释出的2-巯基吡啶浓度乃利用的8080M-1cm-1的ε343nm来计算，而MAb的浓度则是在280nm吸光值经校正得知2-巯基吡啶的贡献后，利用224,000M-1cm-1的ε280nm来计算。(2-巯基吡啶的A280nm＝A343nm×5100/8080)。MAb的回收率为99.6％，每个MAb分子有5.5个可释放的2-巯基吡啶基团与之相连。
使BIWA 4-SS-Py与DM1连接。利用超过可释放的2-巯基吡啶基团1.7倍摩尔的DM1连接浓度为2.5毫克MAb/毫升的溶于缓冲液A的以上修饰过的MAb(184毫克)。将DM1添加到DMA(3％v/v的MAb溶液)中，并使反应混合物在室温下培养29小时。然后用凝胶过滤层析法在以PBS平衡过的Sephacryl S300 HR柱(5×50cm柱，980毫升，流速为10cm/小时)上分离出偶联物。该偶联物以单峰形式被洗脱出来，在带有少量先前洗脱的蛋白质的单体MAb的位置上。对各级分进行检验以得知与每个MAb分子连接的DM1分子的数目。(藉由测定波长252nm和280nm的吸光值测定所连接的DM1分子)。根据所得的结果，将代表63-77％柱体积的级分汇集起来。汇集溶液中的DM1/MAb比率经发现为3.1，且根据起始MAb得知偶联的BIWA 4的产率为75％。在非还原条件下进行SDS-PAGE以评估偶联物BIWI1，且发现其主要由单体(＞95％)和微量(＜5％)的二聚体偶联物所组成。
对体外的BIWI1结合进行分析。对BIWA 4抗体和BIWI1偶联物与抗原阳性FaDu细胞的结合进行测定。将细胞(1-2×10-5)在96孔板中，在冰上与不同浓度的抗体或偶联物培养1小时。把试验物从所述板上洗下来，并予添加FITC标记的抗人类IgG，然后在冰上继续避光培养1小时。在冲洗之后，把细胞用1％多聚甲醛固定，并且在荧光活化细胞分类机(FACS)上进行分析。BIWA 4抗体以1×10-9M的表观KD结合，而BIWI1则以1.8×10-9M的表观KD结合。因此，与DM1的偶联只不过些微地改变了抗体的结合亲和力。
1.3.在裸鼠身上进行的效力研究BIWI1在体内的抗肿瘤效力是在两个施用抗原阳性的人类肿瘤的裸鼠异种移植模型上进行的，其相异处在于肿瘤的来源，程度和CD44v6表达的同质性(homo geneity)A431(ATCC#CRL 1555；外阴的类上皮细胞癌)，FaDu(ATCC#HTB 43；咽部的鳞状细胞癌)。肿瘤细胞株A431和FaDu是得自ATCC，并且在含有10％胎牛血清和补充物的RPMI 1640培养基中培养。
把小鼠任意编入以下的处理组中(处理/最初的平均肿瘤体积/肿瘤体积范围/小鼠的数目)A431第1组对照组(PBS)/185±217mm3/19-424mm3/5只小鼠第2组BIWA4(21mg/kg/每日)/133±115mm3/42-302mm3/5只小鼠第3组BIWI1(2.1mg/kg/每日)/107±63mm3/42-205mm3/5只小鼠第4组BIWI1(7mg/kg/每日)/132±73mm3/42-205mm3/5只小鼠第5组BIWI1(21mg/kg/每日)/107±63mm3/42-205mm3/5只小鼠FaDu第1组对照组(PBS)/142±82mm3/134-268mm3/8只小鼠第2组BIWA4(21mg/kg/每日)/134±86mm3/42-268mm3/6只小鼠第3组BIWI1(2.1mg/kg/每日)/149±96mm3/50-268mm3/6只小鼠第4组BIWI1(7mg/kg/每日)/132±97mm3/42-268mm3/6只小鼠第5组BIWI1(21mg/kg/每日)/129±74mm3/50-231mm3/6只小鼠将1×106个肿瘤细胞皮下移植到6周大的雌性NMRI-nu/nu小鼠的右侧。当肿瘤达到107至185mm3的平均大小时，开始进行治疗。治疗包括i.v.内注射BIWI1，连续5天施予，从第1天开始。对以下3种不同的BIWI1剂量进行平行的试验2.1mg/kg/每日BIWI1，相当于30微克/kg/每日DM1；7mg/kg/每日BIWI1，相当于100微克/kg/每日DM1；和21mg/kg/每日BIWI1，相当于300微克/kg/每日DM1。对照组动物则未予治疗(PBS)或以未偶联的抗体治疗(对照抗体，21mg/kg/每日)。藉由测量肿瘤大小来监测肿瘤的生长。将肿瘤应答评定等级为完全应答，即当该肿瘤在开始治疗后的任何时间完全消失。将肿瘤应答评定等级为部分应答，即当治疗后肿瘤积体减少，但随后又开始再生长。对该治疗的耐受性是在整个观察期间藉由测量小鼠的体重来监测。
2.结果与讨论2.1.BIWI1的体外细胞毒性BIWI 1的体外细胞毒性是利用抗原阳性细胞株A431和FaDu，以及抗原阴性细胞株A459进行评估的。将细胞暴露于不同浓度的BIWI 14天，然后用MTS/PMS染色，并且在ELISA平板读取机上进行测定。然后利用GraphPad Prism软件套装计算细胞中存活的细胞比例。结果显示于

图1。BIWI1能有效杀死抗原阳性的A431细胞，其IC50约为7.6×10-8M；并且能有效杀死第二种抗原阳性的细胞株FaDu，其IC50约为2.4×10-8M。抗原阴性的细胞株A549则会受偶联物作用影响，其IC50约为1.3×10-7M，在所试验的最高BIWI 1浓度下(5×10-7M)有50％的存活比例。这些结果显示BIWI 1在体外对于抗原阳性细胞的细胞毒性仅比对抗原阴性细胞者略强。为了进行比较，另一种DM1-抗体偶联物对抗原阳性细胞的毒性比对抗原阴性细胞的毒性至少高1000倍(Chari et al.，1992)。
2.2.在A431异种移植裸鼠中的效力将包含5只小鼠的各组分别用2.1mg/kg/每日BIWI1，7mg/kg/每日BIWI1，21mg/kg/每日BIWI1和21mg/kg/每日对照抗体治疗。开始治疗时肿瘤的平均大小分别为185+/-217mm3(PBS)，133+/-115mm3(对照抗体)，107+/-63mm3(21mg/kg/每日BIWI1)，132+/-73mm3(7mg/kg/每日BIWI1)和107+/-63mm3(2.1mg/kg/每日BIWI1)。观察期间，每一组的平均肿瘤体积显示于图2中。以对照抗体治疗的肿瘤显示与未经治疗的肿瘤有相似的生长情形，肿瘤体积的倍增时间大约为五日。以7mg/kg/每日BIWI1或21mg/kg/每日BIWI1治疗的动物中，所有肿瘤均完全应答，并且在第17天左右消失。未有任何肿瘤再生被观察到，直至观察期末(第134天)。在3/5的情形中，以2.1mg/kg/每日治疗的肿瘤完全有应答，直到第134天都没有肿瘤再生。余下的两个肿瘤显示部分应答，但最终有再生现象。该结果显示BIWI1会在A431异种移植裸鼠体内诱发视剂量而定的抗肿瘤应答，而其完全与长久持续应答的使用剂量为2.1mg/kg/每日BIWI1至21mg/kg/每日BIWI1。未偶联的对照抗体则显示没有抗肿瘤的效果。
请参考图2。
2.3.在FaDu异种移植的裸鼠身上的效力包含在6只小鼠的各组分别用2.1mg/kg/每日BIWI1，7mg/kg/每日BIWI1，21mg/kg/每日BIWI1和21mg/kg/每日对照抗体治疗。一开始治疗时肿瘤的平均大小分别为142+/-82mm3(PBS)，134+/-86mm3(对照抗体)，129+/-74mm3(21mg/kg/每日BIWI1)，132+/-97mm3(7mg/kg/每日BIWI1)和149+/-96mm3(2.1mg/kg/每日BIWI1)。观察期间，每组的肿瘤平均体积显示于图3。用对照组抗体和2.1mg/kg/每日BIWI1治疗的肿瘤显示与未经治疗的肿瘤相似的生长情形，肿瘤体积倍增时间大约为5天。在以21mg/kg/每日BIWI1治疗的动物中，所有的肿瘤均完全应答且在第24天左右完全消失。直到观察期末(第107天)未有任何肿瘤再生被发现。有1/6肿瘤以7mg/kg/每日BIWI1治疗者完全应答，而有3/6显示其部分应答。余下的两个肿瘤显示其与未经治疗的对照肿瘤有相似的生长情形。这些结果显示BIWI1会在FaDu异种移植的裸鼠身上诱发出视剂量而定的抗肿瘤反应，而其完全且长久持续应答的使用剂量为7mg/kg/每日BIWI1至21mg/kg/每日BIWI1。未偶联的对照抗体则显示没有抗肿瘤的效果。
请参考图3。
2.4.在裸鼠体内的耐受性以BIWI1治疗的耐受性是藉由在2个模型进行实验的全部期间监测小鼠的体重来判定。所观察到每组的平均体重减少的最大值是5％。在以21mg/kg/每日BIWI1治疗的FaDu异种移植小鼠身上(图4)。重量减轻是从治疗第3天左右开始，并持续到第10天，其后动物重量再回复并且表现相似于对照组的动物。在所有其他的剂量组群中，重量减轻的情形相似于赋形剂对照组(PBS)。在所有治疗组中5％或少于此的平均重量减轻指出裸鼠体内对于所给剂量的BIWI1治疗有良好的耐受性。因为BIWI1不会与小鼠的CD44v6有交叉反应，所以只有独立于抗原的效果，比如由游离的DM1所引起的毒性能在此项实验中被监测到。
3.在MDA-MB 453中的体内抗肿瘤效力
3.1材料与方法BIWI1的体内抗肿瘤效力在裸小鼠异种移植模型中，应用抗原阳性人肿瘤MDA-MB 453(ATCC#HTB-131；乳腺癌)检测。所述细胞得自ATCC，在包含10％胎牛血清和添加剂的RPMI1640培养基中培养。将1×106个肿瘤细胞移植到6周龄的雌性NMR-nu/nu小鼠右侧腹皮下。为进行治疗试验，通过使肿瘤碎片传代来培养肿瘤。在肿瘤达到平均大小188mm3至245mm3时，开始治疗。每周i.v.注射BIMI1，共4周。3个不同剂量的BIMI1平行测试6.25mg/Kg BIMI1相当于100μg/Kg DM1，12.5mg/Kg BIMI1相当于200μg/KgDM1和25mg/Kg BIMI1相当于400μg/Kg DM1。用PBS处理动物作为肿瘤生长对照。肿瘤的生长通过测定肿瘤的大小来监测。处理开始后任何时间肿瘤完全消失时，肿瘤的应答被定义为完全应答。
3.2结果和讨论6只小鼠的各组分别用6.25mg/Kg BIMI1，12.5mg/Kg BIMI1和25mg/KgBIMI1处理，一周一次，共4周。开始处理时的平均肿瘤大小分别是246+/-79mm3(PBS)，216+/-85mm3(6.25mg/Kg BIMI1)，188+/-79mm3(12.5mg/Kg BIMI1)和207+/-96mm3(25mg/Kg BIMI1)。观察期间每组肿瘤的平均体积如图5所示。起初对照肿瘤体积增加一倍的时间大约5天。用25mg/Kg BIMI1治疗的动物中，所有肿瘤完全应答，在开始治疗后的22天左右消失了。直到观察期结束时(64天)仍然没有观察到肿瘤生长。用12.5mg/Kg BIMI1或6.25mg/Kg BIMI1治疗的肿瘤，每一剂量组中5/6完全应答，每组4只动物直到试验结束时仍然没发现肿瘤。这些结果显示，当每周给药BIMI1一次，给药4周时，其可在MDA-MB 453异种移植裸鼠中诱导出极好的抗肿瘤应答，即BIMI1从6.25mg/Kg至25mg/Kg时可产生完全且持续长时间的应答。
附图简述图1BIWI1的体外细胞毒性。其中使用抗原阳性的细胞株A431和FaDu以及抗原阴性的细胞株A549。
图2BIWI1在经A431肿瘤异种移植裸鼠身上的治疗效果。每组的平均肿瘤体积与标准差均显示在图中，且治疗组别亦经指出。箭头指出治疗的开始(第1天)。
图3BIWI1在经FaDu肿瘤异种移植裸鼠身上的治疗效果。每组的平均肿瘤体积与标准差均显示在图中，且治疗组别亦经指出。箭头指出治疗的开始(第1天)。
图4BIWI1治疗的耐受性。其中显示在两个研究的模型中所有治疗组别的平均体重变化。第1天治疗的开始。
图5BIWI1在用MDA-MB453肿瘤异种移植裸鼠中的治疗效力。每组的平均肿瘤体积与标准差均显示在图中，且治疗组别亦经指出。箭头指示治疗的天数。
序列表<110>贝林格尔.英格海姆国际有限公司(Boehringer Ingelheim International GmbH)<120>细胞毒性CD44抗体免疫偶联物<130>BIWI1<140>
<141>
<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg20 25 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala35 40<210>2<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Trp Phe Gly Ash Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg1 5 10<210>4<211>213<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体<400>4Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>5<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体<400>5atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 180caggctccta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga702<210>6<211>444<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gln Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val100 105 110Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser115 120 125Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys130 135 140Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu145 150 155 160Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu165 170 175Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr180 185 190Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ash His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val195 200 205Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro210 215 220Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe225 230 235 240Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe260 265 270Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala325 330 335Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 360 365Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440<210>7<211>1392<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体<400>7atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct aagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcta 240gacagtataa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cctgtacctg 300caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag acaggggttg 360gactactggg gtcgaggaac cttagtcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 420gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggtcaaagg cttcratccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380ccgggtaaat ga 1392<210>8<211>213<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体BIWA8轻链SEQ ID NO8<400>8Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile20 25 30Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr35 40 45Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>9<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人源化的小鼠抗体BIWA8轻链SEQ ID NO9<400>9atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggctccagca gaagccagga 180caggctccta gaatcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300
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1.一种式A(LB)n的化合物，其中A是对CD44具特异性的抗体分子；L是一种连接体分子部分；B是对细胞具有毒性的化合物；且n是十进位数字，n＝1至10。
2.根据权利要求1的化合物，其中该连接体分子部分具有能在细胞内部被切断的化学键。
3.根据权利要求2的化合物，其中该化学键是二硫键。
4.根据权利要求1至3的化合物，其中该抗体分子对人类CD44的外显子v6有特异性。
5.根据权利要求1至4的化合物，其中该抗体分子对氨基酸序列SEQID NO3中的表位有特异性。
6.根据权利要求1至5的化合物，其中该抗体分子是VFF-18单克隆抗体(DSMACC2174)或具有VFF-18的互补决定区(CDRs)的重组抗体。
7.根据权利要求1至6的化合物，其中该抗体分子包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。
8.根据权利要求1至7的化合物，其中该毒性化合物B是美登木素生物碱。
9.根据权利要求8的化合物，其中所述美登木素生物碱具有下式(式(II)) 其中R1代表H或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直链烷基、分支的烷基、环烷基、简单的或经取代的芳基或杂环基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
10.根据权利要求9的化合物，其中R1是H或CH3，R2是Cl，R3是CH3且m＝2。
11.根据权利要求1至10的化合物，其式为(式(III)) 其中A是对CD44具有特异性的抗体分子，(L′)是一种视需要而用的连接体分子部分，p是十进位数字，p＝1至10。
12.根据权利要求1至11的化合物，其中p是3至4。
13.一种对CD44v6具特异性的抗体分子与美登木素生物碱的偶联物。
14.根据权利要求13的偶联物，且其中所述抗体分子对氨基酸序列SEQ ID NO3中的表位是特异性的。
15.根据权利要求14的偶联物，其中所述抗体分子是VFF-18单克隆抗体(DSM ACC2174)或具有VFF-18的互补决定区(CDRs)的重组抗体。
16.根据权利要求13至15任一项的偶联物，其中所述抗体分子包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链。
17.根据权利要求13或16任一项的偶联物，其中所述美登木素生物碱是以二硫化物分子部分连接至所述抗体分子。
18.根据权利要求13至17任一项的偶联物，其中所述美登木素生物碱具有下式(式(IV))
19.对CD44v6具特异性的抗体分子和美登木素生物碱的偶联物，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4的轻链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO6的重链，其中所述的美登木素生物碱具有下式(式(IV)) 并且该美登木素生物碱通过二硫键与所述抗体连接。
20.权利要求13至19任一项的偶联物，其中所述一个或多个美登木素生物碱残基与抗体分子连接。
21.根据权利要求20的偶联物，其中3至4个美登木素生物碱残基与抗体分子连接。
22.权利要求13至21任一项的偶联物，其中所述美登木素生物碱通过-S-CH2CH2-CO-，-S-CH2CH2CH2CH2-CO-，或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO-基团与抗体分子连接。
23.制备根据权利要求1至12的化合物A(LB)n，或根据权利要求13至22的偶联物的方法，其包括以下步骤(a)把一个或更多个游离的或经保护的硫醇基引入对CD44具特异性的抗体分子；(b)使步骤(a)的抗体分子与对细胞有毒的化合物反应，所述化合物具有一个或更多个二硫化物或硫醇基团；并且(c)回收所产生的偶联物。
24.权利要求23的方法，其中所述抗体分子是对CD44v6特异性的。
25.权利要求24的方法，其中所述抗体分子是对SEQ ID NO3中的表位特异性的。
26.权利要求23至25任一项的方法，其中所述有毒的化合物是美登木素生物碱。
27.权利要求26的方法，其中所述美登木素生物碱具有下式(式(II)) 其中R1代表H或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直链烷基、分支的烷基、环烷基、简单的或经取代的芳基或杂环基；R2代表Cl或H；R3代表H或CH3；且m代表1，2或3。
28.权利要求27的方法，其中R1是H或CH3，R2是Cl，R3是CH3且m＝2。
29.权利要求23至28任一项的方法，其中(2-吡啶基)-3-二硫代丙酸N-羟基琥珀酰亚氨酯，(2-吡啶基)-4-二硫代戊酸N-羟基琥珀酰亚氨酯，或(2-吡啶基)-5-二硫代戊酸N-羟基琥珀酰亚氨酯用于将游离的或经保护的硫醇基引入到抗体分子。
30.根据权利要求23至29任一项的方法获得的化合物。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根据权利要求13至22的偶联物和药学上可接受的载体，稀释剂或附形剂。
32.根据权利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根据权利要求13至22的偶联物，在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。
33.权利要求32的用途，其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌，食管鳞状细胞癌，肺鳞状细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，子宫颈(cervix)鳞状细胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，结肠腺癌或胃腺癌。
34.根据权利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根据权利要求13至22的偶联物，或根据权利要求31的药物组合物治疗癌症的用途。
35.根据权利要求34的用途，其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌，食管鳞状细胞癌，肺鳞状细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，子宫颈鳞状细胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，结肠腺癌或胃腺癌。
36.一种治疗癌症患者的方法，其包括给药所述患者治疗有效量的根据权利要求1至12或30的化合物A(LB)n，或根据权利要求13至22的偶联物，或根据权利要求31的药物组合物。
37.权利要求36的方法，其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌，食管鳞状细胞癌，肺鳞状细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，子宫颈鳞状细胞癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌，结肠腺癌或胃腺癌。
全文摘要
本发明是关于细胞毒性化合物与抗体的新偶联物，包含该偶联物的药物组合物，及它们在癌症疗法中的用途。具体而言，本发明是关于美登木素生物碱与CD44特异性抗体的偶联物，所述美登木素生物碱优选是N
文档编号A61K31/5386GK1509187SQ02810163
公开日2004年6月30日 申请日期2002年5月16日 优先权日2001年5月18日
发明者冈瑟·阿道夫, 卡尔-海因茨·海德, 埃里克·帕特泽尔特, 马利斯·斯普罗尔, 帕特泽尔特, 斯普罗尔, Ｒ虼摹ず５, 冈瑟 阿道夫 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司, 贝林格尔 英格海姆国际有限公司