专利名称：N-(3,4-二羟基苯甲酰)-3,4-二羟基苯甲酰胺及其制备方法和用途的制作方法
专利说明N-(3，4_ 二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺为白色细小晶体，其分子式为 C14H11NO6，分子量为289克/摩尔。熔点为298-3100C ο我们首次从普洱荼中分离得到的此新化合物，N- (3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二轻 基苯甲酰胺，并经过药理实验证明，此化合物具有显著的神经保护作用与抑制肿瘤细胞生 长与存活的作用，因此其具有较高的临床应用价值和开发前景，基于上述研究成果，本发明
N-(3, 4-二羟基苯甲酰)-3, 4-二羟基苯甲酰胺及其制备方
法和用途技术领域。C本发明涉及一种具有神经保护活性和抑制肿瘤细胞生长与存活的化合物的制备 方法和用途，具体涉及N- (3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺的制备方法与用途。
背景技术：
神经元损伤会导致多种疾病，目前尚无任何有效的神经保护药物能够治疗这些疾 病，仅有一些药物可以通过提高剩余神经元的功能来缓解这些疾病，而有些药物还会产生 不良的副作用。因此，开发具有神经元保护作用的新型药物具有十分重大的意义。另外，抑制肿瘤细胞的过度增值与存活是抗肿瘤治疗的主要手段之一。近来研 究证明，细胞的部分蛋白激酶(kinase)的活性对于肿瘤细胞的增殖与存活具有至关重要 的影响作用。一些选择性的蛋白激酶抑制剂(selective kinase inhibitors)，例如，癌
(BCR, breakpoint cluster region-ABLl fusion protein) (inhibitor of tyrosine kinase)可显著抑制慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukaemia, CML)的发生与发展。因此，开发具有选择性的与肿瘤有关的蛋白激酶抑制剂， 对于研发抗肿瘤的新型药物具有重要的意义。

发明内容
因此，本发明的目的是提供一种适用于由于神经损伤导致的神经退行性疾病(如 Alzheimer' s病)与癌症的治疗作用的化合物，可以用于有效地预防和/或治疗神经元损 伤及其相关的疾病。也可用于癌症的有效预防和/或治疗。用于实现上述目的的技术方案如下式I所示化合物结构式如下还提供了式I所示化合物在制备预防和/或治疗神经元损伤及其相关疾病以及癌症的药物 中的用途。本发明的另一目的是提供一种简便且适合于大量合成式I所示化合物(N-(3， 4-二羟基苯甲酰)-3，4_二羟基苯甲酰胺)的方法。并且提供了一种简便易行的合成途径。
N- (3,4- 二羟基苯甲酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺的制备和合成方法。本发明的技术方案如下一种N- (3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺的制备和合成方法，从普洱茶 中分离此化合物的主要制备途径如下所示1.该分离纯化方法包括以下步骤(1)普洱茶(生茶和熟茶)用90°C水提取；(2)水提取液浓缩成1.3g/cm3，通过大孔吸附树脂，按照顺序用水，20%，40%， 95%乙醇洗脱。(3)收集20%部分洗脱液，减压蒸干，通过ODS (反相)柱色谱，用10%，20%，30% 甲醇分别洗脱，每个比例5倍柱体积。(4)收集20%部分的洗脱液，并且通过S印hadex LH-20柱色谱，获得含N-(3，4_二 羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺的部分。2.另外，我们还研究了使用3，4- 二羟基苯甲酸作为原料合成N- (3，4- 二羟基苯甲 酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺的途径。本发明的合成路线如下所示
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稀盐酸其中，合成包括以下步骤(a)将反应产物置于冰水中，通过SOCl2和氨气。(b)将a反应产物，在锌汞齐催化下进行还原反应。(c)将b反应产物与3，4- 二羟基苯甲酸加热反应，反应后，通入甲醛，保护邻二酚羟基。(d)将c反应产物通入氯气，并且加入碳酸氢钠水解，反应产物通过Oppenauer氧 化。(e)将d反应产物，通过稀盐酸水解脱保护基，生成最终产物N-(3，4- 二羟基苯甲 酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺。本发明以3，4_ 二羟基苯甲酸为原料，采用相对简便的合成路线实现了 N_(3， 4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺的工业化生产，产率较高，为N-(3，4- 二羟基苯甲 酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的药物制剂生产和临床应用提供了有力的保障。


以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中
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图1 :N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺对谷氨酸(Glutamate)诱 导的大鼠原代培养小脑颗粒神经元死亡的抑制作用；其中，Control 对照组；Glu_50 μ M 谷氨酸，终浓度为50 μ M ；ZMT-OO1-1 μ M =N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺， 终浓度为1 μ M ；ZMT-OO1-5 μ M =N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为 5 μ M ；ZMT-OO1-10 μ M :Ν-(3，4- 二羟基苯甲酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为10 μ Μ。图2 :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺对6羟基多巴胺(6-0HDA) 诱导的大鼠原代培养中脑多巴胺神经元死亡的抑制作用；Control 空白对照组；6-0HDA 6-羟基多巴胺，终浓度为50 μ M ；ZMT-OO1-1 μ M =N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3,4- 二羟基苯 甲酰胺，终浓度为1 μ M ；ΖΜΤ-001-5μΜ =N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺，终 浓度为5 μ M ；ZMT-OO1-10 μ M =N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3,4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为 10 μ Μ。图3 :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺诱导离体培养人肝癌 细胞死亡的作用；其中，DMS0:为离体培养人肝癌细胞培养中加入等量的二甲基亚 枫。ΖΜΤ-001-1 μ M :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺，终浓度为ΙμΜ; ZMT-OO1-5 μ M :Ν-(3,4- 二羟基苯甲酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为5 μ M ； ΖΜΤ-001-10 μ M :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺，终浓度为10μΜο其IC50 约为 3. 37 μ M0图4 :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_二羟基苯甲酰胺对人体微动脉血管内皮细胞 增殖的抑制作用；其中，DMSO 为离体培养人微动脉内皮细胞培养中加入等量的二甲基亚 枫。Β9-0. 1 :Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_二羟基苯甲酰胺，终浓度为0. 1μΜ;Β9-1 =N-(3, 4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为1. 0μ M ；Β9-10 =N-(3,4- 二羟基苯甲 酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺，终浓度为10 μ Μ。其IC5tl约为5. 98 μ Μ。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的制备将反应底物3，4_ 二羟基苯甲酸溶于吡啶溶液，并且置于反应瓶中，缓慢加入 SOCl2，随后缓慢地通入氨气，置于冰浴上，控制反应温度。得到的反应产物为3，4_ 二羟基 苯甲酰胺。回收反应产物3，4-二羟基苯甲酰胺，通过锌汞齐还原催化剂(5g锌粉(或锌粒)、 5g氯化汞、5ml浓盐酸和100ml水混合搅拌5min，静置。倾去水液，用50ml水和250ml浓盐 酸混合液浸泡处理，并应立即使用)进行酮基的还原，生产了 3，4_ 二羟基苯甲胺。将3，4_ 二羟基苯甲胺与3，4_ 二羟基苯甲酸以(1 1)的摩尔比例进行混合，并 且缓慢加热，进行酰胺化反应，得到了初步的酰胺反应物。将反应产物继续溶于丙酮，加入 甲醛进行缩合反应，保护3，4_邻二酚羟基。将缩合后的产物溶于稀碳酸氢钠中，并且通入 氯气，加热得到了仲醇反应产物，从而进一步进行Oppenauer氧化，也即是将反应物溶于丙 酮，并且加入异丙醇铝作为催化剂，得到仲醇成为酮基的反应产物，通入稀盐酸后既得到最终产物N- (3，4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺。结构表征熔点298-310°C表IN-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的核磁数据 MS (ESI+) :[M+H]+m/z 290IR(KBr)vmax(cm-l) :3413，1676，1606，1517，1444，1277，1106，971，765实施例2N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺对谷氨酸(Glutamate)诱导的大鼠 原代培养小脑颗粒神经元死亡的抑制作用方法与步骤首先进行小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons, CGN)的原代培养。培 养7天后，在细胞培养液中分别加入不同浓度的N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基 苯甲酰胺(终浓度分别为1、5与10 μ M)，然后，再在细胞培养液中加入神经毒素谷氨酸 (Glutamate,终浓度为50 μ Μ),将细胞置于CO2 (37°C, 5 % CO2)孵箱中继续培养24小时， 最后用FDA/PI double staine法检测细胞存活率。结果显示(见图1)，50 μ M的谷氨酸 (Glutamate)可诱发CGN神经细胞显著的死亡，而N-(3，4_ 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯 甲酰胺(终浓度为5与10 μ Μ)可以显著抑制神经元的死亡，显著保护神经细胞。实施例3
N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺对6羟基多巴胺 (6-hydroxydopamine,6-0H-DA)诱导的大鼠原代培养中脑多巴胺神经元死亡的抑制作用首先进行中脑多巴胺神经元的原代培养。培养3天后，在细胞培养液中分别加 入N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺(终浓度分别为1、5与ΙΟμΜ)，然后， 再在细胞培养液中加入神经毒素6-羟基多巴胺(6-0H-DA，终浓度为50 μ Μ)，将细胞置于 CO2(375% CO2)孵箱中继续培养24小时，最后用MTT法检测细胞存活率。结果显示(见 图2)，50 μ M的6-羟基多巴胺可诱发中脑多巴胺神经元显著的死亡，而N- (3,4- 二羟基苯 甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺(终浓度为ΙΟμΜ时)可以显著抑制神经元的死亡，显著保护 神经细胞。实施例4N-(3,4- 二羟基苯甲酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺对离体培养人肝癌细胞系增殖存 活的抑制作用首先进行人类肝癌细胞系的离体培养。待细胞进入对数增殖期后，在细胞培养液 中分别加入N- (3,4- 二羟基苯甲酰)_3，4- 二羟基苯甲酰胺(终浓度分别为1、5与10 μ Μ)， 然后，将细胞置于C02(37°C，5% CO2)孵箱中继续培养24小时，最后用MTT法检测细胞存活 率。结果显示(见图3)，N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺(终浓度为1、5与 10 μ M时)均可以显著促进肝癌细胞的死亡，抑制肝癌细胞的增殖。实施例5N-(3,4- 二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺对离体培养人微动脉内皮细胞系 增殖存活的抑制作用。首先进行人类微动脉内皮细胞系的离体培养。待细胞进入对数增殖期后，在细胞 培养液中分别加入Ν-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺(终浓度分别为0. 1、1 与ΙΟμΜ)，然后，将细胞置于C02(37°C，5% CO2)孵箱中继续培养24小时，最后用MTT法检 测细胞存活率。结果显示(见图4)，N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4_ 二羟基苯甲酰胺(终浓 度为0. 1、1与10 μ M时)均可以显著抑制微动脉内皮细胞的增殖。
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权利要求
一种N (3，4 二羟基苯甲酰) 3，4 二羟基苯甲酰胺的制备方法，该制备方法包括式I所示化合物存在下，通过合成形成的N (3，4 二羟基苯甲酰) 3，4 二羟基苯甲酰胺II。FSA00000221704300011.tif
2.根据权利要求1所述的分离和合成方法，其特征在于，所述合成步骤。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化和合成方法，其特征在于，1所要求的分离纯化 途径以及2所要求的合成步骤。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的分离和合成方法，其特征在于，所述分离和合成 方法包括以下步骤(1)依次将式I所示化合物通过多步氧化还原反应。(2)11分离过程中使用的20%大孔吸附树脂洗脱液，20%甲醇洗脱液的分离方法。(3)分离反应产物，得到N-(3，4- 二羟基苯甲酰)-3，4- 二羟基苯甲酰胺。
5.根据权利要求1所述的式II所示化合物在制备预防和/或治疗神经元损伤及其相 关疾病的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述神经元损伤或其相关疾病选自神经 退行性疾病，例如老年性痴呆；帕金森病；肌萎缩性侧索硬化；脑中风，血管性痴呆以及糖 尿病的脑血管并发症中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的式II所示化合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
全文摘要
一种N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的制备方法，该制备方法包括式I所示化合物存在下，通过合成形成的N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺II。本发明以咖3，4-二羟基苯甲酸为原料，采用相对简便的合成路线实现了N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的工业化生产，产率较高，为N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺的药物制剂生产和临床应用提供了有力的保障。本发明同时提供了式II所示化合物N-(3，4-二羟基苯甲酰)-3，4-二羟基苯甲酰胺在制备预防和/或治疗神经元损伤及其相关疾病，癌症等恶性肿瘤疾病中的药物中的用途。
文档编号A61P9/00GK101906054SQ201010248349
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者屠鹏飞, 张梁, 马治中 申请人:张梁;马治中;屠鹏飞