专利名称：免疫原粘附及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及禽蛋抗体形式的微生物粘附抑制剂，其通过抑制免疫原的粘附于动物粘膜的能力，用于充分预防呼吸性疾病综合征中引起菌落形成疾病的免疫原的粘附或附着，所述动物包括宿主食用动物、高价值非食用动物、动物学动物、伴侣动物、实验动物或人类，还涉及制备所述粘附抑制剂的方法，及所述抑制剂的用途。
背景技术：
微生物群在动物的呼吸道内形成非常复杂的相互作用。仅举几个例子，这些动物可以是奶牛、饲养牛、猪和禽类诸如鸡和火鸡。尽管所述生物体在不同的动物群之间可以变化，但它们基本上是细菌(诸如巴斯德菌属(Pasteurellae)、曼氏杆菌属(Mannhiemae)及嗜血菌属(Haemophilus))、支原体属(Mycoplasma)及呼吸道病毒组(诸如牛呼吸道合胞体 病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻(BVD)病毒、副流感(PI3)病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒、猪流感(H1NpH3N2)病毒)、真菌和寄生物及它们的组合。这些生物体被视作呼吸道条件致病病原体，可存活于健康动物的上呼吸道中。巴斯德菌属(Pasteurella)和少部分嗜血菌属和支原体属物种可因鼻咽感染之后入侵下呼吸道而造成牛的牛呼吸性疾病综合征(BRDC)。在奶牛和饲养场牛群中，多种应激情况(诸如运输、断奶、病毒感染、恶劣天气、天气变化、在饲养场中迁移、营养不良和过度拥挤等)可以削弱动物的免疫系统的反应能力和物理防御及免疫防御。这使更多的微生物从鼻咽部向下呼吸道转移，再向肺内部转移。这导致肺呼吸性疾病综合征，包括牛的航运热综合征。动物之间的传播通常通过空中传播的微滴或通过食物或水污染物进行。一旦微生物定居于鼻咽部，在吸气期间，喷雾剂可导致细菌或病毒病原体向下送入下呼吸道。这使生物体附着于支气管和肺泡细胞并繁殖，从而造成肺炎。呼吸道感染可导致无临床症状的病变，但导致更低的平均日增重。动物可停止进食，迅速病得很重，并可在数小时内死亡。发病率可以非常高，并且一旦一个动物生病，那么畜群的其它动物更容易感染。这是饲养场的一个重要忧虑。类似的爆发发生在猪群和禽类群体(如鸡和火鸡)中。当前的活疫苗在保护动物免于该综合征方面取得有限的成功。这可能部分地由于鼻咽部缺乏免疫保护。呼吸道病毒群可使动物虚弱，并降低宿主的免疫应答，细菌菌株(一般为溶血性曼氏杆菌(Mannhiema hemolytica)或多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida))会侵入下呼吸道，从而导致支气管肺炎(BRD)，后者会造成动物生病和死亡。通过阻断病毒感染，将会减少细菌感染。在牛的航运热肺炎和地方性肺炎中，两类疾病的最终共同特性是细菌因子。牛呼吸性疾病(BRD)现今是饲养场中的疾病相关损失的主要原因。归因于BRD的财务损失包括死亡、用于治疗的药物、兽医和劳动成本。一次治疗的平均成本为平均每头8. 80美元。治疗过BRD的小母牛具有下降了 37. 9%的发病率评分。从未治疗过的动物每头纯收益平均为11. 48美元以上。经治疗的和未治疗过的动物的平均日增重不同。经治疗的动物每头纯利润平均为57. 48美元以下。已经认为，BRD造成饲养场全部食用牛死亡的20. 6%。猪呼吸性疾病综合征是影响高达所有猪群中的90%的主要的及类似的疾病类型。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia)是原发病原体,通常与诸如A型和D型多杀巴斯德菌等复杂继发病原体有关，并造成高热或生长减缓的临床征象。这些生物体的组合可导致猪肺炎的严重性和持续时间增加。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)可能是猪肺炎的另一个主要原因。仅微小剂量的有毒力的PRRS菌株可导致严重的繁殖疾病。猪呼吸性疾病的常见致病因子可包括PRRS病毒、猪流感病毒(H1N1, H3N2)和猪肺炎支原体以及副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、猪嗜血杆菌(Haemophilus suis)、胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophilus planopneumonia)、溶血性巴氏(曼氏)杆菌(Pasteurella(Mannhiema)haemolytica)和多杀巴斯德菌(A型和D型)。很难估计对这些动物健康的总的经济影响。肺炎性肺损伤可能造成畜群呼吸道健康不良，并可能影响畜群中高达70%的猪。需要病毒疫苗接种与细菌药物治疗的组合，以帮助控制这些问题——接种疫苗的时机总是重要的。必须在适当的时间施用药物，以使成本和对动物的损伤最小。
性肺炎”(SEP)的重要慢性呼吸性疾病的原因。该生物体可单独地在猪中产生严重肺炎，并且仍然是养猪产业的重大威胁。胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)会造成“猪胸膜肺炎”，从而导致严重的经济损失和死亡。尽管已经研制出疫苗，但仍未证明相应的保护作用。在过去的几年中，全世界已鉴定出14种血清型和2种生物型。为了保护畜群，必须给生长猪和肥育猪都接种疫苗。呼吸性疾病对猪群的主要影响在于减少摄食量从而导致生长减缓。这会导致猪的均匀性变差、死亡率更高、平均日增重减少，并且每窝产猪减少。生产者公布称，所有畜群布置中的约14. 4%发生呼吸性疾病。注射疫苗和药物治疗的成本增加，而总效能降低。据估计，每日增重的减少和用于治疗疾病的抗生素每年造成养猪业的4. 67亿美元成本。成长-肥育猪的所有死亡中的超过39%已经归因于猪的呼吸性疾病。现有技术用于诊断或治疗特定病症的禽蛋抗体的生产是已知的。没有提示用于抑制生物体，尤其是生物体的群集，和造成疾病的免疫原在动物呼吸道中的粘附及群集的禽蛋抗体的生产。代表性的现有技术专利包括下述的Poison,美国专利号 4，550，019Stolle 等人，美国专利号 4，748，019Tokoro,美国专利号 5，080，895Carroll,美国专利号 5，196，193Lee,美国专利号 5，367，054Coleman,美国专利号 5，585，098Stolle 等人，美国专利号 5，753，268Poison,美国专利号4，550，019涉及禽蛋黄抗体的制造和用途,所述抗体用于制备用于动物(包括人类)的被动免疫接种的免疫学试剂，所述免疫学试剂用作免疫吸附法的免疫试剂，特别是用于定量分析实验，尤其是用于诊断研究、病理研究、法医研究和药代动力学研究的微量分析。
Stolle等人，美国专利号4，748，018涉及哺乳动物的被动免疫的方法，使用针对多种抗原中的任一种的禽蛋黄抗体，在多种条件下利用多种给药方法，并采用多种合并抗体的组合物，之后首先在哺乳动物体内形成针对该抗体的耐受性。Tokoro,美国专利号5，080，895涉及含有来自蛋物质的特异性抗体、其制备方法和用于治疗传染性或其它疾病的用途，及作为家畜和家禽食物、化妆品和药物中的添加剂的用途，和在血清诊断领域中的用途。尽管未明确说明，但显而易见，蛋抗体在饲料中的应用，是为了提供所述抗体的口服给药的简易方法，所述抗体用于治疗家畜或家禽的肠感染。美国专利号5，196，193和和分案美国专利号5，443，976涉及含有马抗体或禽蛋黄抗体的抗毒液组合物，其用于中和蛇、蜘蛛、蝎子或水母毒液。Lee,美国专利号5，367，054涉及大规模纯化蛋免疫球蛋白以降低泌乳反刍动物的乳汁中的体细胞数目的方法。Stolle等人，美国专利号5，753，268涉及抗胆固醇蛋疫苗及其制备方法和用作饮·食添加物的用途，所述饮食添加物用于治疗人类和其它动物的血管障碍。

发明内容
概括而言，本发明涉及一种用于制备微生物粘附抑制剂的方法，所述抑制剂用于对动物给药，诸如宿主食用动物、高价值非食用动物、动物学动物、伴侣动物或人类，以抑制或充分预防菌落形成免疫原和/或致病病毒在呼吸道中的粘附。可以如下制备微生物粘附抑制剂首先，用特定靶免疫原接种处于或将达到它们的产蛋龄的雌性禽类。然后，在足以允许禽类产生针对靶免疫原的抗体的时间段以后，收集禽类所产的蛋。从壳中分离出蛋中含有抗体内容物的蛋黄和蛋清。蛋中含有抗体的内容物可直接使用，置于增量剂上，或与载体材料混合。可将抗体掺入液体中，混合在舔食盆中，喷洒或喷射到有动物的环境中。还可以将抗体掺入鼻腔或口腔喷雾剂中，该喷雾剂可以给药入鼻咽气道中或口服给药。还可以将抗体掺到条带上，当该条带置于嘴中时溶解以将抗体释放进嘴中。所述蛋抗体粘附抑制物质可根据需要储存或运输备用。通过直接分布抗体物质或引入夹带在空气中的抗体物质，可将掺有对靶免疫原特异性的抗体的蛋内容物给药动物或人类。通过鼻内施用，可将物质引入动物的鼻咽部。可制成喷雾剂混合物，并在动物的头和鼻孔的上面作为雾给药。另一替代方案是，将物质与载体混合，并作为饲料的“顶肥”给药。通过将物质加入水中并让动物或人类饮用所得溶液，可以满足特殊需要。可将活性物质加入松散的舔食或饲料篮中来输送。使用通常的动物饲料混合物，可以制成凝胶样混合物，并将其倒入“舔食盆”(饲料添加剂散装盆)中。可采用其它递送系统将活性物质递送到呼吸道。一方面，本发明涉及一种用于预防或减少呼吸道疾病的组合物。该组合物包括雌性禽类所产蛋中产生的粘附抑制物质，其中禽类被接种了一种以上引起呼吸道疾病的病毒或病毒抗原。粘附抑制物质被配制用于分散进呼吸道以预防或减少引起呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘I吴的粘附。另一方面，本发明涉及一种预防或减少动物的由病毒引起的呼吸道疾病的发病的方法。该方法包括分配一种组合物，该组合物包含在雌性禽类所产蛋中产生的粘附抑制物质，其中禽类被接种了一种以上引起呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，该组合物被配制用于分散进呼吸道以预防或减少引起呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。在本文中提及的“粘附抑制”是指微生物的粘附的抑制，这会预防或减少呼吸道中的菌落和/或蚀斑形成。在一些实施例中，粘附抑制剂阻止或降低诸如细菌等微生物的粘附粘膜和形成菌落的能力。在另一些实施例中，粘附抑制剂阻止或降低诸如病毒等微生物的附着和进入细胞的能力，从而阻止或减少其它病毒颗粒的形成。
具体实施例方式本发明预测一种抑制菌落形成微生物粘附到动物呼吸道的粘膜和支气管及肺泡细胞上的能力从而预防所述微生物群集的方法，该微生物诸如溶血性巴氏(曼氏)杆菌、多杀巴斯德菌和睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、猪流感病毒、牛分枝杆菌(Mycoplasmabovis)或猪肺炎支原体(M. hypopneumoniae)。微生物无法群集会使动物在遭受应激诱发环境时仍具有免疫防御。结果是动物具有更少的肺呼吸性疾病，包括导致受感染动物的高死亡率的航运热。 在一些实施例中，本发明可以用于抑制人类和动物中的引起呼吸性疾病的病毒，特别是流感病毒。致病病毒可以是，例如，传染性牛鼻气管炎(疱疹病毒科)；牛腺病毒1-7 (腺病毒科)；牛呼吸道冠状病毒(冠状病毒科)；牛呼吸道合胞病毒(副粘液病毒科)；牛副流感病毒3 (副粘液病毒科)。所有哺乳动物和禽类都会提供相似类型的保护作用，这为它们的非常幼小的后代提供即时的免疫应答，直到它们也获得产生自身抗体的能力。更明确地称为被动抗体保护，这种防御机制通过胎盘、母乳或二者传递给幼小的哺乳动物。但是，幼禽通过在蛋中储存的抗体来获得它们的被动抗体保护，幼禽在蛋中从胚胎阶段发展而来。具体地，禽类在形成时具有“装载”它们的蛋的能力，蛋中具有与母体血清中相比非常大量的浓缩抗体。另外，与哺乳动物抗体相比，禽抗体更加稳定且更能抵抗消化灭活，在不利的条件下尤其如此。一旦被免疫，雌禽在蛋黄中储存IgY型免疫球蛋白，同时在蛋清中储存IgM和IgA免疫球蛋白。蛋清有助于增加全蛋制品的稳定性，并有助于保护禽抗体。蛋黄中的禽IgY免疫球蛋白紧密连结、涂敷、覆盖并清除掉将它们本身附着到其宿主上的粘附素。在蛋清中的IgM和IgA免疫球蛋白会增加呼吸道粘液组织中含有抗体的物质的连结。这可以提供含有抗体物质更长的持续效应。更大的含有抗体分子可以更有效地预防动物或人类的呼吸道中的目标免疫原的粘附。蛋清是一种保护IgY免疫球蛋白活性从而增加它们在呼吸道中的活性寿命的蛋白质。此外，雌禽保存在蛋中的大部分抗体是针对雌禽的最近抗原攻击。所有这些导致禽蛋作为用于大量经济地生产高特异性的且稳定的抗体的最理想来源。尽管通过用鸡生产禽抗体来例证本发明，也可以使用其它禽类，包括火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸸鹋、雉鸡、鸽子、鹌鹑等，或它们的组合。具体地，获得幼小母鸡的群组，通常为罗得岛红鸡(Rhode Island Reds)、白色来亨鸡(White Leghorns)、伴性杂交(sex-linked hybrid crosses)品种或其它适合大蛋尺寸、高容量蛋生产且易于操作的经过约16-19个周将达到产蛋龄的品种，根据通过所需最终产物的量和时间预先确定的计划，从而产生稳定的连续生产流。经过2-4周的隔离和适应环境的适宜时间段，每个群组将进入接种项目，其中使用所需抗体针对的特定抗原(免疫原)的专有制剂。微生物的培养物可从商业来源得到，诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),或从野生型分离物得到。该培养物可用于分离抗原。这种抗原可制备成制备好的免疫原，并可肌肉内注射，但优选皮下注射。在大约四周到五周内，所收集的普通蛋将含有大量处于易于使用且稳定形式的所需特异性抗体。在整个产蛋期间，可用靶免疫原再次接种所述鸡，以维持高抗体水平。将来自预定鸡群组中的成批蛋破裂，从壳中分离出内容物并混合，并优选地进行巴氏消毒以消除潜在的病原微生物。使用标准的试验操作，诸如ELISA、凝集反应等，监测抗体活性。然后将典型批与其它普通生产水平的鸡群组批次掺和，从而得到大量标准化的活性成分。该蛋抗体微生物抑制剂物质可以在诸如大豆油、大丸药和/或片剂的载体材料上储存和运输。根据配制者和最终消费者的需要和规范，最终的抗体产物可包括某类无害的添加剂，诸如干燥的乳清或大豆外壳、酒糟、糖蜜、大豆或稻壳等来与饲料定量调配。还可以纯化、干燥和低压冻干该抗体以贮存以便以后使用。这种方法首次提供了一种用于控制引起呼吸道疾病的生物体的经济、安全且有效的手段，该生物体存在于肉用牛和奶牛畜群、猪、鸡、火鸡、伴侣动物、高价值非食用动物、动物学动物和人类中。免疫原粘附抑制剂及其制备和产生对所列微生物物种特异性的免疫原的用途。免疫原用于免疫产蛋禽类动物。经过免疫的雌禽将产出这样的蛋在蛋清中含有IgM和IgA型的特异性抗体，且在蛋黄中含有IgY型的特异性抗体。收集所述蛋，并将来自整个破裂蛋的物质以合适的浓度与载体混合物(诸如糖蜜、大豆油、DMS0、PBS缓冲液和维生素E溶液)混合。优化该溶液，使其可喷洒、喷射、鼻内注射、成为凝胶体或用作在饲料上的顶肥和用于舔食盆中。在喂食期间，可将保护性物质喷洒到在围栏或饲养场中的动物上，通常早上一次和晚上一次。喷洒的次数通过测试确定。由于所述物质是无毒的，可以根据需要施用，并与给定围栏所需要的一样多来施用。优选方法是，通过使用每鼻孔1/2剂量的喷雾剂直接鼻内注射，或通过直接鼻喷雾与顶部加料、舔食盆、喷射涂药器的组合。所述产物是一种全天然制剂，其含有对靶免疫原特异性的禽抗体。当附着到细胞壁外表面、粘附素受体、菌毛或基柱结构和被膜或病毒衣壳时，这些抗体将不允许生物体附着到粘膜。该微生物将不能繁殖或群集。这将阻止微生物沿呼吸道向下移动，并消除在下呼吸道中引起疾病的能力。通过喷洒该物质，喷雾将覆盖鼻咽部，并防止细菌、病毒或其它微生物在水滴中被传播。该喷雾也将覆盖在所述区域中的饲料和水，进而阻断生物体的病原体在动物之间传播的能力。本发明的方法在不使用抗生素的情况下使饲养场和围栏中动物疾病和死亡大幅下降。通过减少呼吸道生物体，可以减少肺损害，减少二次感染，提高日增重，提高性能，提高进食效率，并减少成本。控制动物中的肺炎将提高生长性能和生命质量，以及降低呼吸道生物体的潜在传播。相似的实例可在伴侣动物或人类中获得。显而易见的，在不背离其精神和范围下可以做出前文所阐明的本发明的许多修改和变化。仅通过实例给出所述的具体实施方案，本发明仅由所附权利要求项限制。 最成功的群集微生物、细菌、病毒和寄生物等都已经在其表面上逐步形成出许多不同类型的称为“粘附素(adherin或intimin) ”的分子，所述表面可非常紧密地粘附到一种以上类型的特异性分子，该分子是宿主各种表面的一部分。粘附抑制剂是具有极高特异性活性的禽抗体，其可非常紧密地结合、涂敷、覆盖和清除这些粘附素，这些粘附素以锁和钥匙类型的与非常独特的化学结构的配合将自身附着到它们的宿主上。蛋黄中的禽IgY免疫球蛋白会紧密地结合、涂敷、覆盖和消除将其自身附着到宿主上的粘附素。蛋清的IgM和IgA免疫球蛋白会增加在含有抗体的物质的呼吸道粘液组织中的结合，这会提供含有抗体物质更长的持续效应。更大的含有抗体的分子可更有效地预防动物或人类的呼吸道中的靶免疫原的粘附。蛋清是一种保护IgY免疫球蛋白活性从而增加它们在呼吸道中的活性寿命的蛋白质。除了该直接攻击以外，在大部分生物流体(诸如血液、淋巴液、唾液、眼泪和某种程度上的肠分泌物)中所包含的补体系统的组分会将抗体附着识别为它们的许多类型的防御活动的触发剂。因此，与许多其它细胞防御系统的极有可能的动员相组合的特异性抗体附着和包被，会快速达到化学灭活，并最终破坏靶微生物。在一些实施例中，免疫原粘附抑制剂可以针对流感病毒和可能在动物和/或人类中弓I起呼吸性疾病的其它微生物的抗原。所述病毒可以是，例如，正粘病毒科，特别是流感病毒、H1NpH5NpH3N2或其组合,或通常通过H数目和N数目鉴别的其它类型的血凝素⑶和神经氨酸酶(N)组合，和它们的突变株；疱疹病毒科，特别是传染性牛鼻气管炎病毒I和5 ;副粘液病毒科，特别是BRSV和PI3 ;动脉病毒科，特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)，和腺病毒科，特别是牛腺病毒1、3、5、6、7。免疫原粘附抑制剂可以包括蛋衍生的抗体以及药学上适当的载体和粘膜生物粘附剂。免疫原粘附抑制剂可以作为鼻腔喷雾剂每天递送几次(取决于预期的暴露)，以·提供更长期或更强烈的保护。例如，在流感季节中，可以由预期会暴露于病毒的个体携带含有免疫原粘附抑制剂的涂药器。例如，在飞机(特别是长途飞机航班)上飞行的个体可以携带鼻腔喷雾剂，并在飞行期间多次给药喷雾剂，以减少感染一种以上病毒的机会。在预期的暴露之前，通过简单的鼻腔喷雾的方法，个体可以容易地施用特异性的抗体(即免疫原粘附抑制剂)到他们的上气道。这些抗体将充当粘膜保护剂，以防止人类或动物宿主中靶病毒或其它微生物的粘附、群集和复制。鼻腔喷雾剂可以以多种微滴大小递送含有免疫原粘附抑制剂的药物组合物。在鼻腔喷雾剂中的特定药物组合物的微滴大小可以取决于呼吸道中靶微生物预期群集的位置。例如，与更典型的季节性H3N2流感病毒相比，流感病毒H5N1通常群集在呼吸道的更深处。因而，在优选的实施例中，可以以更小的微滴大小来递送针对H5N1的免疫原粘附抑制剂，以确保递送在呼吸道更深处的保护。用于递送免疫原粘附抑制剂的替代方法也可以包括口腔清洗剂或漱口剂。设计成在嘴中溶解以释放抗体的用免疫原粘附抑制剂浸溃的条带，可以用于用含有所述免疫原粘附抑制剂的组合物包被上气道。可以每年或在流感季节以前的其它定期时间范围内制备针对流感病毒的免疫原粘附抑制剂。给药的免疫原粘附抑制剂可以基于循环中的病毒株。随着循环株发生变化或新的流行性病毒的威胁出现，可以通过简单地用最新的目标株免疫新鸡更新产品。禽类可能在免疫接种后少至2周就开始将对最新株特异性的抗体保存在它们的蛋中。相比而言，现有技术方法需要远远更长的时间范围来生产、测试和得到对新疫苗的管理批准。以下实施例进一步例证本发明实施例I :产蛋雌禽的选择产蛋雌禽的品种可以随需要和用途而变化。任何产蛋雌禽都可被免疫，包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、鸵鸟、鸸鹋或任何其它禽类。普通品种的产蛋鸡是优选的，而且通常根据每年产蛋的数目、蛋的大小和舍饲容易性进行选择。罗得岛红鸡、白色来亨鸡和红伴性混种(Red Sex Linked hybrids)是基于蛋大小(大到超大，50_65克)选择的动物,并且用于免疫接种计划。观察处理所述动物的容易度及蛋的大小和一致性，以及每只鸡每年的产蛋数目。尽管可使用任何禽类产蛋雌禽，由于成本和易于使用，这些鸡被证明具有最好的表现。白色来亨鸡、W98混种具有最好的一致性，且每只动物产生更大数目的蛋。这些动物产生大到超大级的蛋(50-65克)，且每只母鸡年产蛋高达300个。实施例2 :用于免疫原的PM抗原的制备将多杀巴斯德菌(ATCC 15743)用作模型细菌。从牛分离该生物体。用于再水化储备物的ATCC方法如下。在I. OmL TSB中再水化细菌。使用脑心浸液(BHI，Acumedia)刺激细菌上的PM抗原。将储备物TSB接种进BHI肉汤中，并在37°C孵育18-24小时。这会刺激细菌上的体浆和附着抗原形成。用BHI肉汤培养物接种含有BHI肉汤的烧瓶。在缓慢搅拌的同时，在37°C孵育烧瓶。将血液琼脂平板划线以分离菌落确认形态。在22小时之 后看到良好的生长。合并烧瓶，并使用无菌盐水(0.9%)在大约3000rpm离心30分钟收集所得物质。将收获物收集在试管中。使用分光光度计计数和McFarland比浊计标准品检查 密度。将物质稀释至大约lX109/mL。加入与O. 9%无菌盐水中的培养液成1:1比例的百分之四(4%)脱氧胆酸钠(Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室温(22。。到24°C )搅拌大约18小时。将物质离心以除去完整细胞。上清液用作PM抗原的储备物。测定干重为大约14. 9mg/mL。将产物在无菌PBS (pH 7. 4)中稀释至lmg/mL，用于PM免疫原。实施例3 :用于免疫原的PH抗原的制备将溶血性巴氏杆菌储备物(ATCC 14000)用于PH抗原。从牛分离所述生物体。遵循用于再水化储备物的ATCC方法。在I. OmL的TSB中再水化细菌。将脑心浸液(BHI，Acumedia)用于刺激细菌上的PM抗原。将储备物TSB接种进BHI肉汤中，并在37°C孵育18-24小时。这会刺激细菌上的体浆和附着抗原形成。用BHI肉汤培养物接种含有BHI肉汤的烧瓶。在缓慢搅拌的同时，在37°C孵育烧瓶。在22小时之后看到良好的生长。将血液琼脂平板划线以分离菌落确认形态。合并烧瓶，并使用无菌盐水(0.9%)在大约3000rpm离心30分钟收集所得物质。将收获物收集在试管中。使用分光光度计计数和McFarland比浊计标准品检查密度。将物质稀释至大约lX109/mL。加入与O. 9%无菌盐水中的培养液成1:1比例的百分之四(4%)脱氧胆酸钠(Difco)溶液(Herzberg，1972)，并在室温(22°C到24°C )搅拌大约18小时。将物质离心以除去完整细胞。上清液用作PH抗原的储备物。测定干重。将产物在无菌PBS(pH 7.4)中稀释至lmg/mL，用于PH免疫原。实施例4 :用于免疫原的HS抗原的制备将睡眠嗜血杆菌储备物(ATCC 43626)用作HS抗原的细菌培养物储备物。从牛分离所述生物体。遵循用于再水化储备物的ATCC方法。在I. OmL TSB中再水化细菌。ATCC培养基814GC培养基用于刺激细菌上的HS抗原。将储备物TSB接种进814GC培养基中，并在37°C和5%C02孵育18-24小时。这会刺激细菌上的体浆和附着抗原形成。在22-48小时之后看到良好的生长。将血液琼脂平板划线以分离菌落确认形态。合并烧瓶，并使用无菌盐水(O. 9%)在大约3000rpm离心30分钟收集所得物质。将收获物收集在试管中。使用分光光度计计数和McFarland比浊计标准品检查密度。将物质稀释至大约lX109/mL。加入与O. 9%无菌盐水中的培养液成1:1比例的百分之四(4%)脱氧胆酸钠(Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室温(22°C到24°C )搅拌大约18小时。将物质离心以除去完整细胞。上清液用作HS抗原的储备物。测定干重。将产物在无菌PBS(pH 7.4)中稀释至lmg/mL，用于HS免疫原。实施例5 :用于免疫原的HSa抗原的制备将猪嗜血杆菌储备物(ATCC 19417，H. parasuis)用作HSa抗原的储备物。从猪分离所述生物体。遵循用于再水化储备物的ATCC方法。在I. OmL TSB中再水化细菌。ATCC培养基5129 :嗜血杆菌实验培养基用于刺激细菌上的HSa抗原。将储备物TSB接种进#5129肉汤中，并在37°C孵育24-48小时。这会刺激细菌上的体浆和附着抗原形成。用肉汤培养物储备物接种含有#5129肉汤的烧瓶或含有#814培养基的平板。在37°C和5%C02孵育烧瓶。在48小时之后看到良好的生长。将血液琼脂平板划线以分离菌落确认形态。合并烧瓶，并使用无菌盐水(O. 9%)在大约3000rpm离心30分钟收集所得物质。将收获物收集在试管中。使用分光光度计计数和McFarland比浊计标准品检查密度。将物质稀释至大约lX109/mL。加入与O. 9%无菌盐水中的培养液成1:1比例的百分之四(4%)脱氧胆酸钠 (Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室温(22。。到24°C )搅拌大约18小时。将物质离心以除去完整细胞。上清液用作HSa抗原的储备物。测定干重。将产物在无菌PBS(pH 7.4)中稀释至lmg/mL,用于HSa免疫原。实施例6 :使用PH、PM、HS和HSa抗原制备ELISA平板，用于监测蛋鸡和饲料中的抗体PH、PM、HS和HSa ELISA :使用100 μ L/mL的在碳酸盐缓冲液(pH 9. 6)中的不同浓度的抗原(10 μ g-200 μ g/ml)包被96孔试验板(平底Costar)。将板在22°C到37°C之间孵育最多18小时。抽吸孔以防止交叉污染。用390 μ L/孔的O. 5%BSA封闭板，并在37°C孵育I小时。使用替代性的阳性或阴性行包被板以供对照。将板用含有吐温20的洗涤缓冲液冲洗一次。向一式两份孔中添加每孔100微升的稀释样品，并在37°C孵育I小时。添加山羊抗-鸡IgG与辣根过氧化物酶的缀合物(Kirkegard and Perry Laboratories ；1:1000到1:3000)。孵育I小时之后，根据生产商的说明书加入底物(TMB，KPL)，并在10分钟之后用O. IM磷酸终止反应。用Dynatech ELISA读数器在450nm测定孔的光密度，并记录信息以供进一步数据分析。实施例7 :随时间分析个别蛋和血清在免疫接种期间的不同时期选择蛋用于监测对特定抗原的抗体应答。在第O天监测所选择的鸡，并在第4个月之后，每月继续监测。从蛋壳中收集完整的蛋，然后取出ImL样品。然后用缓冲液萃取该样品以分析抗体内容物。使用PH、PM、HS和HSa免疫原的标准ELISA进行分析。从OD读数中减去负读数。实施例8 :用PH免疫原免疫接种鸡给所选择的大约19周龄产蛋母白色来亨鸡注射PH免疫原储备物。一周分四次注射(500 ygUOOy g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清样品。如果需要加强剂量，则在每个加强剂量中施用IOOyg(每6个月)。在四周内，所有母鸡所产蛋中都产生优良的抗体。ELISA PH读数均值为I. 000D(对于1:300稀释度)和O. 2650D(对于1:1，200稀释度)。实施例9 :用PM免疫原免疫接种鸡
给所选择的大约19周龄产蛋母白色来亨鸡注射PM免疫原储备物。一周分四次注射(500 μ g、100 μ g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清样品。如果需要加强剂量，则在每个加强剂量中施用IOOyg(每6个月)。在四周内，所有母鸡所产蛋中都产生优良的抗体。ELISA PM读数均值为I. 420D (对于1:300稀释度)和O. 680D (对于1:1，200稀释度)。实施例10 :用HS免疫原免疫接种鸡给所选择的大约19周龄产蛋母白色来亨鸡注射HS免疫原储备物。一周分四次注射(500 ygUOOy g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清样品。如果需要加强剂量，则在每个加强剂量中施用IOOyg(每6个月)。在四周内，所有母鸡所产蛋中都产生优良的抗体。ELISA HS读数均值为O. 950D (对于1:300稀释度)和O. 2500D (对于1:1，200稀释度)。实施例11 :用HSa免疫原免疫接种鸡给所选择的大约19周龄产蛋母白色来亨鸡注射HSa免疫原储备物。一周分四次注·射(500 μ g、100 μ g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清样品。如果需要加强剂量，则在每个加强剂量中施用IOOyg(每6个月)。在四周内，所有母鸡所产蛋中都产生优良的抗体。ELISA HSa读数均值为I. 400D (对于1:300稀释度)和O. 5760D (对于1:1，200稀释度)。实施例12 :储备物生产全蛋试剂的制备从所有四个免疫原群组中组合所选择的母鸡，用于生产全蛋试剂的批量生产。Sterling(美国专利号5，753，228)就蛋的选择和其贮存的用途进行了精彩评述。将所述蛋随机化，并除去壳。将全蛋混合均匀，并使用标准条件(60°C (140° F)，3. 5分钟)进行巴氏消毒(Charley, H.和 C. Weaver,第 3版，Foods: a scientific approach, Merril-PrenticeHall,第350页，1998年)。巴氏消毒后，测试样品的活性并在4°C下储存直到干燥，或喷洒到载体上。分析250 μ L样品。ELISA的结果实施例如下经过巴氏消毒的全蛋ΡΜ、PH、HS、HSa混合物
免疫原稀释度O.D.
"PM5000.532
PM25000.113
PH5000.466PH25000.115
HS5000.338
HS25000.128
HSa5000.588
HSa25000.155实施例13 :分析饲料添加剂的抗体活性从三批收集所述物质的样品。使用ELISA系统分析样品的PH、PM、HS和HSa免疫原以监测巴氏消毒和储存后的活性。全蛋批次加工之后记录良好的抗体应答。来自实施例20生产方法的三批的数据见下表

权利要求
1.一种用于预防或减少呼吸道疾病的组合物，所述组合物包括在雌性禽类所产的蛋中生产的粘附抑制物质，其中所述禽类被接种了一种以上造成所述呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，所述粘附抑制物质被配制用于分散进呼吸道中从而预防或/和减少造成所述呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。
2.根据权利要求I所述的组合物，其中在从蛋壳分离以后，所述蛋的内容物包含所述粘附抑制物质，所述蛋内容物被配制在所述组合物中。
3.根据权利要求I所述的组合物，其中所述粘附抑制物质是抗体。
根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鼻腔喷雾剂。
4.根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物被配制用于口腔喷雾剂。
5.根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物另外包含粘膜生物粘附剂。
6.根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物另外包含药用载体。
7.根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物被配制用于分散进呼吸道的鼻咽部中。
8.根据权利要求I所述的组合物，其中所述组合物被配制用于安置在口腔条带上，其中当所述口腔条带被置于动物嘴中时，会释放所述粘附抑制物质。
9.一种口腔喷雾剂，其包含根据权利要求I所述的组合物。
10.一种鼻腔喷雾剂，其包含根据权利要求I所述的组合物。
11.一种口腔条带，其包含根据权利要求I所述的组合物。
12.—种口腔清洗剂，其包含根据权利要求I所述的组合物。
13.根据权利要求I所述的组合物，其中所述呼吸道疾病包括流感或其它病毒诱发的呼吸性疾病。
14.根据权利要求I所述的组合物，其中所述病毒或病毒抗原包括H1NpH5N1, H3N2、传染性牛鼻气管炎病毒I和5、BRSV和PI3、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)、牛腺病毒1、3、5、6、7和它们的组合。
15.根据权利要求I所述的组合物，其中所述呼吸道疾病是在人类中。
16.根据权利要求I所述的组合物，其中所述呼吸道疾病是在食用动物中。
17.一种预防或减少由动物中病毒造成的呼吸道疾病的发病率的方法，所述方法包括 分散组合物，所述组合物包含在雌性禽类所产的蛋中生产的粘附抑制物质，其中所述禽类被接种了一种以上造成所述呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，所述组合物被配制用于分散进呼吸道中，以预防或减少造成所述呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物被配制为鼻腔喷雾剂，且所述分散包括将鼻腔喷雾剂的内容物喷洒进呼吸道中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物被配制为口喷雾剂，且所述分散包括将口喷雾剂的内容物喷洒进动物的嘴中。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物被安置在口腔条带上，且所述分散包括将所述口腔条带放入动物的嘴中。
21.根据权利要求18所述的方法，其中口腔清洗剂包括所述组合物，且所述分散是通过用口腔清洗剂漱口。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述分散包括包被呼吸道的鼻咽部。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病包括流感或其它病毒诱发的呼吸性疾病。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒或病毒抗原包括E1NpH5NpH3N2、传染性牛鼻气管炎病毒I和5、BRSV和PI3、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)、牛腺病毒1、3、5、6、7和它们的组合。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病是在人类中。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病是在食用动物中。
全文摘要
本发明公开了禽蛋抗体形式的微生物粘附抑制剂、以及制备它的方法和使用它的方法。所述抑制剂通过充分预防菌落形成免疫原在宿主动物和人类的呼吸道中的附着或粘附而起作用。如下制备所述抑制剂用免疫原接种雌性禽类，收获含有针对所述免疫原的抗体的蛋，并从所述蛋的壳中分离出蛋黄和蛋清。通过直接分配所述内容物，或引入夹带在空气中的所述内容物，将所述蛋黄和蛋清内容物施用给动物或人类。可以将所述粘附抑制物质配制成以多种方式使用，诸如口喷雾剂或鼻喷雾剂。这些制剂可以有效地预防或减少动物和人类的呼吸道疾病。
文档编号A61K9/12GK102933232SQ201180023053
公开日2013年2月13日 申请日期2011年5月9日 优先权日2010年5月7日
发明者布拉德利·M·米特内斯, 康妮·菲利浦斯 申请人:卡马斯股份有限公司