专利名称：一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，涉及纳米载体在生物技术领域的应用，具体公开了一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球、制备方法及其应用，装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球经静脉注射后到达病变部位，发挥药效。此发明具有潜在的临床治疗应用价值。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为严重危害全球人类健康的常见致命性疾病之一，其近年来发病率和死亡率都呈增加的趋势。据WHO统计，2002年全世界因恶性肿瘤死亡人数达710. 6万。 我国2000年癌症发病人数180 200万，死亡140 150万。由于肿瘤形成的机制还不十分清楚，因此肿瘤的早期诊断、临床治疗及预后评估等都存在着非常多的困难。目前，临床上恶性肿瘤的治疗主要是采用手术、放疗、化疗、生物治疗(包括免疫治疗)等综合治疗手段，其中化疗已经成为各种晚期恶性肿瘤有效治疗的基础。然而，临床上常用较为有效的抗肿瘤药物(如紫杉醇、喜树碱等)多为难溶性药物，给其应用带来巨大的挑战。另外，抗肿瘤药物在体内呈全身性分布，肿瘤组织内很难达到有效药物浓度，由于其对肿瘤部位的靶向性不明显，进而对其他实质性器官造成不可逆转的损害，造成全身毒性反应，常常导致化疗失败。在众多的难溶性抗肿瘤药物中，紫杉醇(PTX)是红豆杉属植物中一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的广谱抗癌药物，对肺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌等都具有良好的治疗作用，是一种非常典型的难溶性抗肿瘤药物。为了解决其难溶问题，临床使用的注射制剂是将药物溶于聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的混合溶媒中，经葡萄糖或氯化钠稀释后进行静脉注射。 这不仅会引起血管炎症，而且聚氧乙烯蓖麻油在体内降会释放组胺，从而导致严重的副反应。因此，病人在给药前不得不先注射抗过敏药物，导致整个治疗过程繁琐和不便，而且还需谨慎监测用药过程。0-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇(AGM 1470)是近年来刚开发的一种烟曲霉素的活性类似物，对新生血管具有很好的抑制作用。然而，由于其本身的难溶性， 临床上不得不加入助溶剂等以增加血液中药物浓度。II期临床试验证明，其血药清除率高， 副作用非常大，主要表现为恶心、呕吐、腹泻、神经毒性、疲乏、胃炎、皮疹等。很多患者也因此放弃治疗。尽管科学家们为此做了很多的研究，例如转向新型制剂的研究，包括将药物装载在脂质体、聚合物胶束、聚乳酸(PLA)和固体脂质体纳米球内等。如专利CN 102166189A公开了一种靶向和荧光双功能的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体。该难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，由固态脂质、液态脂质、表面活性剂和难溶性抗肿瘤药物形成内部包载药物的脂质载体，脂质载体表面经过化学修饰，共价连接上具有肿瘤靶向的配体，可以延长难溶性抗肿瘤药物的体内循环时间，提高难溶性抗肿瘤药物的生物利用度，还可通过荧光成像用于肿瘤的定位诊断。然而，脂质体在体内容易被酶类氧化，稳定性差，释放药物缓慢，突释现象严重。而聚合物胶束由于在血液中会被稀释到临界胶束浓度以下，也存在着稳定性差的问题。PLA、固体脂质体等纳米球疏水性强，虽然对难溶性药物可能有较高的包埋率，但由于材料疏水性强，造成释药速率缓慢、血内清除率高和生物利用度低等问题。另外， 这些方法还存在着规模化制备困难、产品批次间差异性大的问题。为了提高难溶性药物的水溶性、解决目前注射制剂严重毒副作用及现行研发制剂存在的问题，急需开发一种亲水性好、载药率高、稳定性好、生物利用度高的靶向给药体系。可生物降解聚合物纳米球在难溶性药物包埋和传输方面具有潜在优势，通过对纳米球制备材料筛选和制备过程控制，能够使难溶性药物以微晶或细小颗粒形式被包裹于内部，可大大改善难溶性药物溶出。纳米球可以通过EI3R效应(实体瘤组织的高通透性和滞留效应)到达肿瘤部位，实现药物的被动传输。另外，纳米球可以在表面修饰一具有隐形效果的PEG链和肿瘤靶向分子，延长药物在体内的循环周期，提高药物的靶向性，进一步提高药效。如专利CN 102083742A公开了一种制造尺寸均勻的、含难溶性药物的聚合物纳米颗粒的方法，具体地，所述方法包括第一步，将生物可降解的聚合物溶解在非挥发性的极性有机溶剂中；第二步，将难溶性药物添加到水和所述生物可降解的聚合物的溶液中以生成分散液；第三步，在低机械能水平搅拌条件下，将所述分散液批量添加到乳化剂溶液中。该发明的聚合物纳米颗粒能通过使用非挥发性的极性溶剂尤其是与水具有相似极性的溶剂作为生物可降解的聚合物与难溶物质的混合溶液的溶剂、并在乳化过程中采用低机械能条件和批量添加分散液的简便方法制造纳米尺寸的、小而均勻的聚合物纳米颗粒。该聚合物纳米颗粒的优点为包含在聚合物颗粒中的难溶性药物的溶出度得到显著提高，且所述难溶性药物逐渐且稳定地得以释放，并长期保持在恒定浓度。但到目前为止，还未成功开发出兼具隐形和靶向的应用于体内难溶性药物传输的有效纳米球载体，严重限制了难溶性抗肿瘤药物的临床应用。壳聚糖是一种天然的阳离子生物高聚物，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物可降解性等优点，是制备难溶性药物纳米载体的理想材料。CN1760213A公开了一类季铵化壳聚糖衍生物，尤其是能形成两亲性聚合物分子的季铵化壳聚糖衍生物，其能对难溶性药物具有增溶作用，并且载药后形成的胶束粒径小，约为50nm。此外，还公开了这类衍生物的制备方法、其作为难溶性药物增溶剂的作用以及含其的药物组合物。CN 1698899A公开了一类以壳聚糖或其衍生物作为药物载体的新型药物组合物，能被载体负载的药物主要包括抗肿瘤药物、难溶于水的非抗肿瘤药物和DNA，方法是通过在壳聚糖分子上接枝疏水性侧链基团，而获得水溶性的壳聚糖衍生物再以它为载体负载抗肿瘤药物或难溶于水的非抗肿瘤药物或DNA，以及直接将抗肿瘤药分子或其它药物通过化学键与壳聚糖分子相连接，制备具有新型载体的高分子药物。目前作为难溶性药物载体的壳聚糖及其衍生物存在以下难题(1)亲水性的壳聚糖纳米球无法实现对难溶性药物的直接装载，本发明采用0/W/0复乳法实现对难溶性药物的装载，复乳液进一步固化即可制得装载难溶性药物的纳米球。复乳液特别是纳米复乳液滴在制备过程中的稳定性是一个极大的挑战。( 难溶性药物如紫杉醇通常在制备过程中很容易析晶形成大的晶体颗粒而破坏乳液，造成药物泄漏甚至包埋失败。(3)纯的壳聚糖纳米球具有实心结构，释放液很难进入纳米球，导致药物释放速率缓慢。(4)壳聚糖制备的纳米球大多采用化学交联法，经化学交联固化后，壳聚糖纳米球表面的功能基团氨基由于交联时被占用，无法进一步连接PEG链或嫁接靶向分子。( 制备方法非常有限，主要采用机械搅拌法，采用这种方法在制备乳液时，由于粒径不均一，小的乳滴会被大的乳滴吸收，同时大的乳滴又会因剪切力的作用而破坏，这导致所制得的壳聚糖纳米球粒径很不均一。而且，由于乳滴的粒径不均一，在交联过程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，从而会形成很多交联凝聚物。同时，在液滴的合并和破裂过程中，内包药物容易逃逸到液滴外面，导致药物的包埋率降低。纳米球粒径的不均一还会为壳聚糖及其衍生物纳米球的实际应用带来诸多困难。(6)大多数纳米球经静脉注射给药后会被网状内皮系统识别并迅速清除，使药物无法达到治疗浓度。(7)简单的纳米球载体由于缺乏靶向性，给正常机体组织带来不可恢复的毒副作用。

发明内容
针对现有技术中装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。所述装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球粒径均一，多分散指数在0. 2以内，对难溶性药物的载药率高达10-50%。通过在纳米球基质中改变壳聚糖与羧化壳聚糖的比例，实现纳米球多孔结构的构建，孔径可控制在50纳米以内，保证药物稳定快速释放，释放速率可控。该纳米球由于偶联有隐形效果的聚乙二醇PEG链，减少血液相关蛋白与纳米球之间的相互作用，有效地延长药物在体内的循环时间长达20小时。该纳米球由于嫁接有肿瘤靶向分子，增加了其在肿瘤部位的亲和力，增加了肿瘤细胞的内吞，有良好的肿瘤靶向特性。该纳米球其相对于传统的注射制剂相比，有较低的毒副作用。目前临床上为了克服药物的难溶问题，常选用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶剂作为助溶剂，再行静脉注射给药。该注射剂型所用的助溶剂引起严重的毒副作用，如严重的致敏反应、恶心、呼吸困难等。由于壳聚糖-羧化壳聚糖天然的亲水性及纳米球本身在Era效应的作用下被动靶向肿瘤的优势，因此该纳米球无需使用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶剂。另外，传统抗肿瘤药物注射制剂给药后药物在体内呈全身性分布，肿瘤组织内很难达到有效药物浓度，由于其对肿瘤部位的靶向性不明显，进而对其他实质性器官造成不可逆转的损害，造成全身毒性反应，常常导致化疗失败。本发明所提供的难溶抗肿瘤药物注射制剂产品兼具隐形和靶向效果(如

图1所示)，延长药物在体内的循环周期，提高药物的靶向性，降低了药物对机体正常组织所产生的毒副作用，提高药物的生物利用度。难溶性药物纳米晶以原位结晶的形式均勻分布在壳聚糖及其衍生物纳米球中，极大的提高了亲水性材料载体对难溶性药物的载药率，克服了亲水性材料无法实现对难溶性药物的有效包埋等困难。避免了难溶性药物以大的晶体形式存在于载体中而导致的突释现象。该纳米球装载的难溶性药物能够稳定快速释放，还可以通过改变载体孔径控制释药速率。所述载药率按下式计算
权利要求
1.一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，具有多孔结构，含有PEG链及可以偶联肿瘤靶向配体的官能团。
2.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，所述难溶性药物纳米晶在纳米球内均勻分布；优选所述难溶性药物纳米晶的粒径在20纳米以下，进一步优选在15纳米以下，更优选在10纳米以下，特别优选为3纳米以下；优选所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、 喜树碱、0-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、0-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物。
3.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，其多孔孔径优选在 50纳米以内，进一步优选在40纳米以内，更优选在30纳米以内，特别优选在20纳米以内；优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其释药速率可控；优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其平均粒径在2000纳米以下，优选为1500纳米以下，进一步优选为20-1500纳米，更优选为50-350纳米；优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，粒径多分散指数< 0. 2，优选< 0. 15，特别优选< 0. 1。
4.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，所述PEG链的相对分子量范围优选为1000-7000，进一步优选为2000-6000，特别优选为2000-5000 ；优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团位于PEG链的末端。优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团为Arg-Gly-Asp(RGD)。
5.如权利要求1-4任一项所述的装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的用途，其特征在于，可用于治疗肿瘤的一种注射制剂、口服药剂，优选用于注射制剂。
6.一种制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的方法，包括如下步骤(1)提供溶解了难溶性药物的与水不互溶的溶液作为内油相I(O1)；(2)提供含有水相乳化剂且溶解有壳聚糖-羧化壳聚糖的酸性溶液作为水相(W)；(3)提供含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为外油相II(O11)；(4)将内油相I与水相混合得到O1Z^W型初乳液；(5)将上述制得的(VW型初乳液与外油相II混合得到(VWA)11型预复乳液；(6)将上述预复乳液过微孔膜，得到粒径均一的复乳液滴；(7)向复乳液中加入交联剂与壳聚糖和/或羧化壳聚糖上的氨基反应，使乳滴交联固化得到装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球；(8)将制备的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球悬浮于含有EDC和NHS的PBS中；(9)向上述悬浊液中加入具有异端双官能团的PEG，与壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球上的羧基偶联反应；(10)将上述制备的装载难溶性药物的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球重悬于溶解有靶向配体的水溶液中反应。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述乳滴交联优选分为以下两个阶段第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。固化温度优选为5-30°C，特别优选为 10-25°C，固化时间优选0. 5小时以上，特别优选为0. 5-3. 5小时；第二阶段缓慢加热至较高温度固化。较高温度优选为40-85°C，进一步优选为 40-75°C，特别优选为40-65°C，加热速率优选1°C /分钟以上，特别优选为1°C /分钟_5°C / 分钟，再次交联固化时间优选4小时以上，进一步优选为5小时以上，特别优选为5-12小时。
8.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，该方法适用于亲水性材料对水不溶而脂溶性药物的包埋；优选所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、 喜树碱、0-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、0-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物；优选步骤(1)中所述的溶剂为有机溶剂，进一步优选为卤代烷烃、酯类或其混合物，再一步优选为C1-C5烷烃的卤代物、酯类或其混合物，更优选为C1-C3烷烃的氯代物、酯类或其混合物，特别优选二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物；优选步骤O)中所述的壳聚糖和羧化壳聚糖的粘均分子量为1000000以下，进一步优选为 5000-980000，特别优选为 10000-100000 ；优选步骤( 中所述壳聚糖与羧化壳聚糖混合物中，羧化壳聚糖含量为5%-100%，特别优选为10% -100% ；优选步骤⑵中所述的水相乳化剂为水溶性乳化剂，为Bnf 35、吐温-20、吐温-40、吐温-60、Triton-X405及其混合物；
9.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述油性物质优选为石蜡、醚类、植物油、其他烷类碳氢化合物或其混合物，特别优选为液体石蜡、石油醚、橄榄油、 棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物或其混合物；优选步骤(3)中所述油溶性乳化剂其亲水亲油平衡值HLB在3-6之间，具体的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、亲油-亲水嵌段共聚物，P0-500、P0-310 或其混合物；优选步骤(3)中所述外油相中油溶性乳化剂的浓度，基于外油相的质量，为20wt%以下，优选为 0. 5wt% -IOwt % ；优选步骤(4)中的初乳液优选经乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到；优选步骤中内油相(O1)与水相(W)的比例范围为1:2-1: 30，特别优选为 1 3-1 20 ；优选步骤(5)中预复乳液通过乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到；优选步骤(5)中初乳液与外油相(O11)的比例范围为1:2-1: 80，特别优选为 1:3-1: 60。
10.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述预复乳液优选在压力作用下通过微孔膜；优选步骤(6)中所述微孔膜孔径均一；优选步骤(6)中所述微孔膜孔径范围为15微米以下，进一步优选为9. 0微米以下，特别优选为0. 2-9. 0微米；优选步骤(6)中乳液过膜次数1次以上(包括1次)，即通过同一微孔膜至少1次得到所述0/W/0型乳液，优选为2次以上，特别优选为2-5次；优选步骤(6)中所述过膜压力为基本恒定的压力，其与所用膜孔径、内外油相粘度和水相中壳聚糖含量有关。所述基本恒定的压力范围优选为0.5MPa以上，特别优选 0. 5-5. OMPa ；优选所述基本恒定的压力是指压力的波动不超过10 %，优选不超过5 %，更优选不超过；优选步骤(7)中所述交联剂为醛类，特别优选为戊二醛、甲醛或其混合物； 优选步骤(9)中所述具有异端双官能团的PEG的浓度范围为l-5mg/mL。 优选步骤(10)中所述靶向配体的加入量为20-500 μ g/mL。
全文摘要
本发明涉及一种装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。该纳米球具有多孔且孔径可控的结构，从而控制药物较快、稳定地释放。该纳米球表面偶联有PEG链及靶向肿瘤的特异性分子，能够有效延长药物在体内的循环周期，改善纳米球对肿瘤细胞的亲和能力，提高药物生物利用度。另外，该纳米球有较低的毒副作用和更好的抑瘤效果。本发明还提供了一种制备装载(或联合装载)难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的方法，即利用壳聚糖/羧化壳聚糖的氨基交联成球，羧化壳聚糖上的羧基偶联PEG链并嫁接靶向分子，能够控制药物以原位结晶的形式均匀分散在壳聚糖及其衍生物纳米球中，极大的提高药物的装载率，稳定药物的释放速率。
文档编号A61P35/00GK102389572SQ20111034250
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者吕丕平, 周炜清, 王连艳, 苏志国, 马光辉, 魏炜 申请人:中国科学院过程工程研究所