专利名称：神经酰胺在制备抗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物研究技术领域，涉及神经酰胺在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术：
神经酰胺(ceramide，cer.)作为细胞膜脂质成分，是细胞内重要的第二信使。神经酰胺具有调节细胞周期、诱导细胞凋亡等作用，不同种类的神经酰胺作用差别甚大。目前多数实验结果基于神经酰胺诱导细胞凋亡的作用，而把它视为一个不利的成分，与脑损伤、心血管病变有关，如神经细胞凋亡等。其对肝脏的影响研究很少。本研究提出神经酰胺具有抗肝纤维化作用的假设，并通过体内、外研究予以证实。结果表明神经酰胺具有抗肝纤维化的作用，在药物临床应用上具有重要的意义。

发明内容
本发明公开了一种神经酰胺在制备抗肝纤维化药物中的作用。神经酰胺的来源:神经酰胺:C2和C6皆为Sigma公司产 品。本发明进一步公开了含有的神经酰胺的药物组合物，主要为固体制剂或液体制剂。它是由神经酰胺(C2或C6)及药学上可接受的药用载体组成。可制成口服制剂或注射剂。例如将药物组合物可以按照常规药物配制技术，将神经酰胺(C2或C6)与可药用载体紧密混合来制备本发明的药物组合物，通常是以药物组合物的形式服用的，可口服或非口服给药，或者以和药学上可接受的载体、赋形剂及其它添加剂形成的化合物(如片剂、缓释制剂、胶囊剂、注射剂、脂质体、溶液剂)安全的口服或非口服给药。当口服给药时，组合物可配制成片剂、糖衣剂或胶囊。为制备口服药物组合物可采用乳糖或淀粉做载体，壳聚糖，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，微晶纤维素，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。本发明的化合物可以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。实际服用的神经酰胺(C2 cer和C6 cer)化合物的剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态，给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等。优选这些组合物在单元剂量形式中，用于口服、肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药、或者用于吸入或喷射给药，该单元剂量形式例如片齐 、丸剂、口服液、胶囊齐 、散齐 、颗粒齐 、无菌注射液或液体喷雾剂、滴剂、针剂、自动注射器装置或栓剂。或者，组合物可以将主要的活性成份与可药用载体例如普通压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、以及其他药用稀释剂例如水混合，以形成包含本发明设计的组合物。液体形式中的新颖的本发明组合物为注射给药等。优选组合物的日剂量在宽范围每成人每天0.01 1，000 mg变化。口服给药，药物组合物优选以片剂形式给药，其包含 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,25.0、50.0、100、150、200、250和500 mg的有效成分，用于所治疗患者症状的剂量调整。药物有效量通常以每天约0.001 mg/kg 约5 mg/kg体重的剂量水平供给,优选的范围为每天约
0.01 约I mg/kg体重。组合物也可以按每天I 4次的方案给药。本领域的技术人员可以容易地确定理想给药剂量，并且这些给药剂量将随着具体使用的提取物、给药模式、制剂的浓度、给药模式以及疾病病症的进展而改变。另外与所治疗的具体患者相关的因素，包括患者年龄、体重、饮食和给药时间会导致需要调整剂量。本发明公开的神经酰胺C2或C6在制备抗肝纤维化药物中的应用，其实验结果表明:Cer在体外具有抗肝纤维化作用:C2 cer和C6 cer皆能抑制HSC增殖，作用呈量效关系和时效关系，而C6 cer的抑制作用较强。C2 cer和C6 cer均能抑制HSC分泌/产生胶原蛋白(以轻脯氨酸反映胶原蛋白)。外源性给予C6 cer可使HSC表达Cer增加,却抑制a SMA表达。C2 cer和C6 cer抑制肝纤维发生与其增加Cer表达及抑制a SMA表达有关。C2 cer预防用药每周I次连续8次,对Con A (20 mg/kg)诱导的Balb/c小鼠肝纤维化模型具有抗肝纤维化作用，包括降低肝组织胶原蛋白含量，减轻肝脏病理变化，减低肝纤维化程度计分和肝纤维化分期，降低肝损伤早期的小鼠死亡率，抑制肝组织a SMA表达，却增加Cer表达且使Cer表达呈增强的膜型分布。结论:神经酰胺(C2 cer和C6 cer)具有抗肝纤维化的作用，可制成神经酰胺C2或神经酰胺C6固体化脂质体、胶囊剂或注射剂等剂型应用于抗肝纤维化。本发明更加详细的试验情况及结果如下: 一、材料和方法
1、神经酸胺:Dihydroceramide C2 (D-erythro-N-Acetylsphinganine, C2 cer)和Dihydroceramide C6 (N-Hexanoyl-D-sphingosine, C6 cer)皆为美国 Sigma公司产品，产品号分别为 C7980-5MG，C8230-5MG。2、肝星状细胞(h印atic stellate cell，HSC)分离培养:参考文献，结合我们的经验，进行HSC原代分离培养。采用第3代的HSC接种于96孔板，至HSC处于对数生长期，以MTT法评价Cer对HSC增殖的影响。C2 cer和C6 cer分别以0.22 μ m微孔滤膜过滤的分析纯无水乙醇溶解，皆配成工作浓度的100X浓度，用时添加1/100体积，均为单次添加Cer至培养的HSC上清液中，乙醇终浓度1%或不足1%，并分别设加无水乙醇的HSC对照(这里的乙醇与加Cer中的乙醇等浓度)和不加无水乙醇的HSC对照组、单纯培养液对照组。观察期末，每孔加入10 μ L的MTT 5 mg/mL，继续培养4 h，然后吸弃上清，每孔加入100 μ L DMS0，振荡 10 min，在 BIO-RAD Model 680 酶标仪上以 570 nm/630 nm 读取吸光度。计算抑制率(IR) =(细胞对照组吸光度-用药组吸光度)/细胞对照组吸光度。3、HSC产生/分泌羟脯氨酸:分离培养HSC，第3代HSC，于其对数生长期，以C6或C2作用48 h，按试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A030-1)说明书上的消化法测定羟脯氨酸含量。4、外源性C6 cer对细胞爬片上的HSC表达Cer和a SMA的影响:原代分离培养HSC，将处理过的盖玻片(经硫酸-重铬酸钾清洁液浸泡过夜，洗净；无水乙醇浸泡，绸布擦净；高压灭菌)放入6孔细胞培养板的孔底，将第2代HSC接种于该盖玻片上，于HSC处于对数生长期时，加入C6 cer (以无水乙醇溶解，乙醇终浓度1%)终浓度0.625，1.25，2.5 μΜ，作用48 h，取出细胞爬片，入PBS (0.01 M，pH 7.2)中上下提插3次，4°C预冷甲醇室温固定20 min;PBS洗2 minX3次，正常山羊血清室温封闭20 min，不洗；加一抗:IgM型小鼠抗ceramide抗体(美国Sigma公司，产品号C8140) 1:10稀释,兔抗大鼠a smooth muscle actin ( a SMA)抗体(武汉博士德生物工程有限公司，产品号ΒΑ2358)1:25稀释，4°C湿盒中孵育过夜，PBS洗2 minX3次；加二抗:羊抗小鼠IgG+IgM-H &L-FITC (Abeam公司，产品号ab47830) 1:1000稀释，羊抗兔IgG-TRITC (武汉博士德生物工程有限公司，产品号BA1090) 1:10稀释，室温孵育2 h，PBS洗2 minX3次。洁净载玻片上滴加DAPI (北京中杉金桥生物技术有限公司，产品号ZL1-9057) 10 yL，将爬片的细胞面对着DAPI液轻轻贴上，勿产生气泡。避光_20°C放置，尽快用Leica TCS SP5II激光共聚焦扫描显微镜观察、拍照。5、小鼠肝纤维化模型制备与用药:Balb/c小鼠，SPF级，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号SCXK-(军)2007-004)。饲养于天津医科大学实验动物中心，I周内适应环境，12 h明暗交替，自由进食水。随机分为正常对照组、模型对照组、高剂量(C2 cer 0.5 mg/kg)组、低剂量(C2 cer 0.25 mg/kg)组，C2 cer溶解于无水乙醇中并稀释至所需浓度，预防用药，给药体积0.05 mL/10 g体重，皮下注射(sc)，模型对照组和正常对照组sc无水乙醇0.05 mL/10 g体重。每周I次sc C2 cer后次日，以刀豆球蛋白A (伴刀豆球蛋白A, concanavalin A, con A)诱导Balb/c小鼠肝纤维化，Con A溶解于医用(无菌无热源)生理盐水中，配成2 mg/mL，以0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，尾静脉注射2 mg/mL的Con A 0.1 mL/10 g体重,每周注射I次Con A (20 mg/kg),连续8次。记录各组造模过程中的死亡情况。25%乌拉坦麻醉后，腹腔静脉取血，按方法要求留取肝组织等，用于RNA分析、蛋白印迹、羟脯氨酸测定，取肝右叶相应部位组织3 ±夹，2块用于中性10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；1块用OCT包埋，冰冻切片。6、肝组织冰冻切片:切片厚8 ym，4°C预冷丙酮固定30 min，取出晾干，入PBS(0.01 M, pH 7.2)中10 min，正常山羊血清封闭，自此以后操作步骤同上述4项下，但兔抗a SMA抗体为Abcam公司产 品(产品号ab66133)，每个样本各作a SMA+Cer双标记和Cer标记(但模型对照组Cer标记的样本不慎揩掉)，均以DAPI染细胞核。7、其它试剂:为市售分析纯试剂或满足方法要求的生物试剂。8、统计分析:采用SPSS 8.0统计分析软件。计量资料用元±芯表示，采用GLMMultivariate方差分析(HSC增殖)、 检验(HSC上清液Hyp)、单因素方差分析(肝组织胶原蛋白)、非参数检验(肝纤维化程度计分)、Ridit分析(肝纤维化分期)、四格表精确检验法(查表法)(死亡率)。二、结果
1、对HSC增殖的抑制作用:C6 cer对HSC的抑制作用持续时间长，且抑制率较高，所需浓度较低；C2 cer对HSC的抑制作用持续时间短，且抑制率较低，所需浓度较高。C2 cer或C6 cer能呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制HSC增殖(C6 cer单次用药在72 h内随作用时间延长而增强，C2 cer单次用药在24 h作用较强，而后随时间延长而减弱)，C6 cer的抑制作用更强。细胞对照中，通常含终浓度不超过1%乙醇者较不含乙醇者HSC增殖更好。见表I和表2。表1.C2 cer对HSC增殖的影响
权利要求
1.神经酰胺在制备抗肝纤维化药物中的应用；所述的神经酰胺为C2或C6。
2.一种药物组合物，其特征在于它是由神经酰胺与药学上可接受的药用载体组成。
3.权利要求2所述 的药物组合物，其中的组合物为固体制剂或液体制剂。
全文摘要
本发明公开了神经酰胺在制备抗肝纤维化药物中的应用；所述的神经酰胺为C2cer或C6cer。结果表明C2cer和C6cer均能抑制HSC增殖，作用呈量效关系和时效关系，且C6cer的作用较强；皆抑制HSC分泌/产生胶原蛋白。C6cer使HSC表达Cer增加，却抑制αSMA表达。C2cer预防用药能抗ConA诱导的小鼠肝纤维化，减低肝胶原蛋白含量和肝纤维化程度计分及其分期，降低肝损伤早期的小鼠死亡率，抑制肝组织αSMA表达，却增加Cer表达尤其膜型表达。结论神经酰胺(C2cer和C6cer)具有抗肝纤维化的作用，可制成脂质体包埋剂、胶囊剂或注射剂等剂型用于临床防治肝纤维化。
文档编号A61P1/16GK103191090SQ20131012771
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者方步武 申请人:天津医科大学