专利名称：靶向纳米递释系统及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种DR5mAb (monoclonal antibody against DR5，抗DR5单克隆抗体)介导的靶向纳米递释系统及其制备方法和应用。
背景技术：
目前，全世界每年约600万人死于恶性肿瘤。中国现有癌症患者约450万人，死亡率逾30%，造成了严重的社会问题。临床上治疗恶性肿瘤的主要手段仍然是在术后予以全身辅助的化学治疗，但因传统化疗药物普通剂型缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生毒性，常使患者不能耐受。以治疗难度大、死亡率高的恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)为例，达卡巴嗪 (DTIC)是一种治疗恶性黑色素瘤最有效的药物，化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸橼酸盐，在体内分解能放出甲基正离子(CH3) +，为嘌呤生物合成的前体，能干扰嘌呤的生物合成，具有直接细胞毒作用，但是剂型单一，只有普通注射粉针剂，存在毒副作用大、靶向性差、用药顺应性差、稳定性差等缺点，临床用于恶性黑色素瘤的有效率也仅为20%。死亡受体DR5与目前已知的其他死亡受体⑶95、TNFRl、DR3、DR4 一样，都属于肿瘤坏死因子受体(TNRF)超家族，都是I型跨膜蛋白，然而死亡受体DR5的独特之处就在于当外来的配体与之结合时，它仅选择性的杀伤肿瘤细胞或者转化细胞，而对机体的正常细胞不具有明显的毒性，极大地降低了其副作用。研究表明，DR5受体高水平地广泛表达于许多肿瘤组织，如肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌、咽喉癌、前列腺癌等；而不表达或较少表达于正常的组织细胞中。DR5的激动型抗体(比如DR5mAb)，能特异性地结合DR5，通过细胞内凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡， 而对正常组织细胞毒性很小。因此，可以利用抗DR5单克隆抗体(DR5mAb)对肿瘤进行免疫治疗。目前，这些抗体在临床前期研究已显示出较TRAIL更有效的诱导多种肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞凋亡的活性，并能使部分小鼠移植瘤模型的肿瘤消退，部分临床试验研究已取得了可喜的成果。但是，单独使用DR5mAb，容易在体内被清除，影响治疗效果。经检索国内外数据库和专利数据库，以与DR5具有高亲和性、高特异性、可高效诱导瘤细胞凋亡且对正常细胞无毒副作用的DR5单抗为靶头，偶联载药纳米粒制备具有主动靶向性且可将化疗和免疫治疗有效结合的多功能靶向纳米给药系统尚未见相关文献报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种以本身具有促肿瘤细胞凋亡活性的单抗为靶头的靶向纳米递释系统，该系统是将靶头DR5mAb与载药纳米粒连接而制成的靶向纳米递释系统，是一种有效的药物缓释及靶向治疗系统，其将化疗和免疫治疗有效结合，既提高了药效和特异性，又降低了药物的毒副作用。此外，还需要提供一种靶向纳米递释系统的制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种靶向纳米递释系统，该系统主要由靶头DR5mAb 和载药纳米粒连接组成。优选的，所述载药纳米粒的载体材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸。聚乳酸是具有优良生物相容性和生物降解性的聚合物，在人体内代谢的最终产物是水和二氧化碳，中间产物乳酸是体内糖代谢的产物，所以不会在体内积聚，无毒副作用。本发明采用聚乙二醇修饰的聚乳酸，不仅具有前述聚乳酸的优点，还具有长循环的特性，能更有效地将药物输送至肿瘤细胞。优选的，所述载药纳米粒装载的药物为治疗肿瘤的药物。所述肿瘤包括恶性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、甲状腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。在本发明的优选实施例中，载药纳米粒以治疗恶性黑素瘤的达卡巴嗪 (DTIC)为模型药物。所述靶向纳米递释系统的粒径为100-200纳米。在本发明的另一方面，提供了一种上述靶向纳米递释系统的制备方法，包括以下步骤将适量药物溶于水，制成内水相；将适量聚乙二醇修饰的聚乳酸溶于有机溶剂，制成油相；将适量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；把内水相加入到油相经超声形成初乳，并将该初乳加入到外水相中超声形成复乳，待有机溶剂挥发后，得到载药纳米粒；将靶头DR5mAb以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到靶向纳米递释系统。优选的，所述内水相与油相的体积比为1 10，初乳与外水相的体积比为1 4。优选的，所述有机溶剂是二氯甲烷和丙酮组成的二元混合溶剂，二氯甲烷和丙酮的体积比为3 2，可使载药纳米粒平均粒径控制在100-200纳米之间。在本发明的另一方面，还提供了上述靶向纳米递释系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明靶向纳米递释系统，其靶头抗DR5单克隆抗体(DR5mAb)本身具有抗肿瘤活性，该DR5mAb与纳米递释系统中的药物可分别从外源性和内源性两条途径促使肿瘤细胞凋亡，使药物在体内具有主动靶向性的同时，还可将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，从而大大提高药效，又可降低药物毒副作用。本发明靶向纳米递释系统，既将药物靶向输送至肿瘤细胞，延长药物在体内的作用时间，又增加DR5mAb的稳定性，使其不易被清除。经实验验证，本发明靶向纳米递释系统，能明显抑制肿瘤生长，效果显著优于原药和DR5mAb联合用药组。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例3的DTIC-NPs及DTIC-NPs_DR5mAb体外释药曲线图；图2是本发明实施例4双荧光标记的DTIC-NPs-DR5mAb对表面高表达DR5的A375 细胞的特异性识别和结合功能的流式细胞仪检测图3是本发明实施例5双荧光标记的PE-NPs-DR5mAb-FITC与靶细胞A375结合和内吞过程的激光共聚焦显微镜图；图4是本发明实施例6各治疗组荷瘤裸鼠最终肿瘤平均体积的柱状图；图5是本发明实施例6的DTIC-NPs_DR5mAb体内靶抗肿瘤曲线图。
具体实施例方式本发明靶向纳米递释系统，以具有长循环特性的聚乙二醇修饰的聚乳酸 (MPEG-PLA)为载体材料，以治疗肿瘤的药物为模型药物，以自身具有抗肿瘤活性并具有高特异性的DR5mAb为靶头，先采用超声复乳法制备载药纳米粒，然后将DR5mAb以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到具有多重功能的靶向纳米递释系统。本发明采用的靶头DR5mAb具有双重功能，一方面，可选择性地与表面高表达DR5的肿瘤细胞结合，将载药纳米粒装载的药物特异性地导向肿瘤细胞，使该缓释药物以内源性途径促使肿瘤细胞凋亡； 另一方面，DR5mAb本身具有抗肿瘤活性，以主动免疫治疗的方式从外源性途径诱导肿瘤细胞凋亡。因此，本发明的靶向纳米递释系统，将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，大大提高药效，又降低了药物毒副作用。在下面优选实施例中，以治疗恶性黑色素瘤的有效药物达卡巴嗪(DTIC)为模型药物制备靶向纳米递释系统。实施例lDR5mAb介导的靶向纳米递释系统的制备以具有长循环特性的聚乙二醇修饰的聚乳酸(MPEG-PLA)为载体材料，DTIC为模型药物，以自身具有抗肿瘤活性并具有高特异性的DR5mAb为靶头，先采用超声复乳法制备 DTIC-NPs缓释递药系统，然后将DR5mAb以化学键偶联的方式连接到DTlC-NPs表面，得到具有多重功能的靶向纳米递释系统DTIC-NPs-DR5mAb，具体步骤如下。(1)载达卡巴嗪的DTlC-NPs递释系统的制备①电子天平精密称取适量DTIC，以去离子水作溶剂，配制成浓度为:3mg/ml的水溶液，所得溶液作为内水相备用。②用电子天平精密称取MPEG-PLA适量溶于有机溶剂 Vra= 3 2) 中，配制成浓度为10mg/ml的溶液，所得溶液作为油相备用，精密称取适量人血清白蛋白 (HSA)，以去离子水作溶剂，配制成浓度为(W/V)的水溶液，所得溶液作为外水相兼乳化剂备用，该外水相兼乳化剂使下面步骤③制得的载药纳米粒表面包裹着生物相容性良好的可降解材料HSA。③将100 μ 1去离子水或药物溶液(内水相)加入Iml浓度为10mg/ml的MPEG-PLA 溶液(油相)，100W、60s连续超声制备w/o初乳。然后，将初乳滴加入細1的1 % HSA水溶液(外水相)中，100W、30s间断超声2次制备w/o/w复乳，再加入30ml去离子水使复乳分散。磁力搅拌4h，挥去有机溶剂，纳米粒固化。14000r/min离心30min后弃去上清液即得， 洗涤3次，冷冻干燥，保存备用。2靶向纳米递释系统DTIC-NPs_DR5mAb的制备采用碳二亚胺法制备靶向纳米递释系统，即将抗DR5单克隆抗体与DTlC-NPs表面包裹的HSA以化学键偶联的方式连接，得到具有靶向功能的DTIC-NPs-DR5mAb。简易反应式如下
权利要求
1.一种靶向纳米递释系统，其特征在于，所述靶向纳米递释系统主要由靶头DR5mAb和载药纳米粒连接组成。
2.根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述载药纳米粒的载体材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸。
3.根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述载药纳米粒装载的药物为治疗肿瘤的药物。
4.根据权利要求3所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述肿瘤包括恶性黑素瘤、 肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、甲状腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。
5.根据权利要求4所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述治疗恶性黑素瘤的药物为达卡巴嗪。
6.根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述靶向纳米递释系统的粒径为100-200纳米。
7.权利要求1所述靶向纳米递释系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将适量药物溶于水，制成内水相；将适量聚乙二醇修饰的聚乳酸溶于有机溶剂，制成油相；将适量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；把内水相加入到油相经超声形成初乳，并将该初乳加入到外水相中超声形成复乳，待有机溶剂挥发后，得到载药纳米粒；将靶头DR5mAb以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到靶向纳米递释系统。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述内水相与油相的体积比为 1 10，初乳与外水相的体积比为1 4。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂是二氯甲烷和丙酮组成的二元混合溶剂，二氯甲烷和丙酮的体积比为3 2。
10.权利要求1所述靶向纳米递释系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向纳米递释系统，该系统主要由靶头DR5mAb和载药纳米粒连接组成。本发明还公开了靶向纳米递释系统的制备方法和应用。本发明靶向纳米递释系统，是一种有效的药物缓释及靶向治疗系统，靶头DR5mAb与纳米递释系统中的药物可分别从外源性和内源性两条途径促使肿瘤细胞凋亡，使药物在体内具有主动靶向性的同时，还可将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，大大提高药效，又降低了药物毒副作用。
文档编号A61K47/48GK102335428SQ20111029661
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年5月13日
发明者丁宝月, 丁雪鹰, 刘继勇, 吴兆勇, 寇有利, 张玮, 朱全刚, 武鑫, 王学贤, 王翔, 范伟, 马露露, 高申, 高静 申请人:中国人民解放军第二军医大学