专利名称：一种狐狸脑炎活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种狐狸脑炎活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术：
狐狸脑炎是由犬腺病毒-I型病毒引起的以狐狸食欲减退或废绝、饮欲增加、精神沉郁、反应迟钝、体温升高、呕吐、体虚无力、眼球震颤、阵发性抽搐、麻痹等特征的急性、接触性传染疾病。早在1925年Green就报道了狐狸脑炎，并在1930年Greent和Dewey等人发表了其病原体为病毒的证据(参考文献胡体拉家畜传染病学.北京科学出版社， 1963. )。1989年，狐狸脑炎首次在我国山东省爆发，其后在全国范围内广泛流行并导致狐狸出现较高的死亡，给我国养狐业造成了较大的经济损失。1962年，Dithfield在一次爆发犬传染性喉气管炎期间从犬呼吸道中分离(参考文献:Darai G, Rosen A,DepI-Hs H, Flugel RM. Characterization of the DNA of canine adenovirus byrestriction enzyme analysis [J]. Intervirology, 1985, 23 (1) :23-8.) ^jt 得单纯引起呼吸道病变(喉气管炎)而不引起肝炎的犬腺病毒-II型病毒，即A^株(多伦多A26/61)。后来将犬传染性肝炎病毒称为1型腺病毒(CAV-I)，将似6株病毒称为犬传染性喉气管炎病毒，即2型腺病毒(CAV-2)。犬腺病毒-II型毒株在毒力、可溶性抗原结构、 细胞感染范围以及红细胞凝集范围方面都与标准株犬传染性肝炎病毒有些差别。但是应用犬腺病毒-II型毒株免疫的犬与狐狸，却能对犬传染性肝炎病毒产生有效的免疫力(参考文献殷震.动物病毒学.第2版.北京科学出版社，1997，1104-1130)。1978年，第一个商业性犬腺病毒-II型弱毒疫苗株作为犬腺病毒-I型弱毒疫苗株的替代品上市后，目前世界上所用的狐狸脑炎疫苗都以犬腺病毒-II型病毒代替犬腺病毒-I型病毒疫苗。

发明内容
本发明的目的是利用本发明人自行分离、鉴定、致弱、保存的一株犬腺病毒-II型弱毒CAV-2RZ株作为生产疫苗的病毒株，接种MDCK细胞进行病毒繁殖，经过收获、配苗、冻干等步骤，制备出安全、有效的狐狸脑炎活疫苗。
具体实施例方式为了有效地控制狐狸脑炎疫情，本发明人于2003年利用自行分离、鉴定、致弱的犬腺病毒II型(Canine adenovirus type幻CAV-2RZ株进行了狐狸脑炎活疫苗的研究。疫苗安全试验和效力试验结果表明，我们研制的狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)安全可靠，无不良反应，免疫狐狸后能产生坚强免疫力，可有效预防狐狸脑炎的发生。1.疫苗生产用毒株(1)病毒来源疫苗制造及检验用毒种为犬腺病毒II型(Canine adenovirus type 2)CAV-2RZ 株细胞毒，由本发明人分离、鉴定、致弱、保管和供应。2011年11月17日该株病毒已送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. M75。(2)病毒株特性1)病毒含量将毒种用含2%新生牛血清的细胞营养液(MEM)作10倍系列稀释，取10_4、10_5、 10_6、10_74个稀释度，分别接种已长成单层的MDCK细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100 μ 1，同时设不接毒对照组，置37°C、5% CO2培养箱中培养观察96 120 小时，记录细胞病变(CPE)的孔数。按Reed-Muench法计算TCID5tl (中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二 0 — 0年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称《中国兽药典》)，每毫升病毒含量应> IO6-5TCID5002)安全性将毒种经肌肉注射接种2 10月龄健康易感狐狸(犬腺病毒中和抗体效价不高于1 4) 5只，IOml/只，观察14日，应无异常反应。3)免疫原性用2 10月龄健康易感狐狸(犬腺病毒中和抗体效价不高于1 4)5只，每只肌肉注射接种毒种Iml (含IO4 5TCID5tl),同时设不接种对照狐狸5只。免疫后21日采血，分离血清，测定犬腺病毒中和抗体效价，免疫狐狸犬腺病毒中和抗体效价均应不低于1 30，对照狐狸犬腺病毒中和抗体效价均应不高于1 4。5)特异性将毒种作1000倍稀释，与等量10倍稀释的犬腺病毒-II型特异性抗血清混合，不中和对照加等体积MEMJS 37°C中和60分钟，接种已长成单层的MDCK细胞M孔细胞培养板，中和组接种12孔，不中和对照和细胞对照各6孔，每孔0. 5ml。将细胞培养板置37°C、 5% CO2培养箱中培养观察96 120小时。中和组和细胞对照组应不出现CPE，不中和对照组应全部出现CPE。6)毒种保存_15°C以下保存，保存期为M个月；-70°C以下保存，保存期为60个月。2.狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)的生产(1)将生长良好的MDCK细胞按常规方法传代，待细胞长成单层后，倾去生长液，换以含2%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置37°C继续培养，转瓶转速为8 IOr/ h。(2)接种后，每日观察1 2次细胞病变(CPE)，当CPE达80%左右时即可收获，冻融1次，置_15°C以下冻结保存，检验备用。C3)将检验合格的病毒液，按1 1的比例加入5%蔗糖-脱脂乳作稳定剂，充分混合，定量分装。(4)分装后迅速进行冷冻真空干燥。3.狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)的检验(1)性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加入稀释液后迅速溶解。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无菌生长。(3)支原体检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无支原体生长。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》规定的方法行检验，应无外源病毒污染。并参照现行《中国兽药典》规定的方法，用Vero、F81、MDCK、BTC细胞进行外源性犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒检验，应符合规定。(5)鉴别检验将疫苗稀释至1头份/ml，然后作100倍稀释，与等量10倍稀释的犬腺病毒-II型特异性抗血清混合，不中和对照加等体积MEM，经37°C中和60分钟，接种已长成单层的MDCK细胞M孔细胞培养板，中和组接种12孔，不中和对照和细胞对照各6孔，每孔0. 5ml。将细胞培养板置37°C、5% CO2培养箱中培养观察96 120小时。中和组和细胞对照组应不出现CPE，不中和对照组应全部出现CPE。(6)安全检验按瓶签注明头份将疫苗稀释成每毫升含5头份，肌肉注射接种2 10月龄健康易感狐狸(犬腺病毒中和抗体效价不高于1 4)5只，2ml/只，观察14日，应全部健活。(7)病毒含量测定将疫苗稀释至1头份/ml，再作10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6、个稀释度，分别接种已长成单层的MDCK细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100 μ 1， 同时设不接毒对照孔，置37°C、5% CO2培养箱中培养观察96 120小时，记录CPE孔数，按 Reed-Muench法计算TCID5tl，每头份疫苗病毒含量应彡IO4-5TCID500(8)剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。(9)真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应符合规定。本发明涉及的微生物信息本发明所涉及的微生物菌种为犬腺病毒II型(Canine adenovirus type 2) CAV-2RZ株，该株病毒已于2011年11月17日该株病毒已送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. M75。本发明的优点本发明是利用本发明人自行分离、鉴定、致弱、保存的一株拥有优良免疫原性的犬腺病毒CAV-2RZ株作为生产毒株，经过收获、配苗等步骤，制备出安全、有效的狐狸脑炎活疫苗。本发明采用的生产毒株能够针对目前疾病流行情况，有效预防狐狸脑炎的发生，为毛皮动物疾病的控制创造条件。实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株安全试验为验证制苗用毒株犬腺病毒-II型弱毒CAV-2RZ株对狐狸的安全性，本发明人用犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株Cl代病毒液经肌肉途径大剂量(IOml)接种狐狸，通过临床观察、病理组织学检查，接种狐狸均未出现喉气管炎临床症状和病理变化，表明传代致弱的犬腺病毒-II型CAV-2RZ株毒种对狐狸是安全的。实施例2犬腺病毒-II型CAV-2RZ株的免疫原性试验
毒株是否具有良好的免疫原性是筛选疫苗株的重要依据，因此，本发明人对犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株免疫原性进行了研究，并比较了疫苗免疫狐狸后中和抗体效价与攻毒保护相关性，确定抗体保护的临界值，为制定疫苗的效力检验方法和标准提供依据。试验结果如下表1CAV-2RZ株免疫原性试验结果
权利要求
1.一种狐狸脑炎活疫苗，其特征是本疫苗含有保藏号为CGMCC No. M75的犬腺病毒II 型(Canine adenovirus type 2)，该株病毒已于2011年11月17日该株病毒已送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. M75。
2.一种狐狸脑炎活疫苗的制备方法，其特征是将保藏号为CGMCC No. 5475的犬腺病毒 II型接种MDCK细胞37°C培养，当接毒细胞有80%出现病变时，收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，经冷冻干燥制成冻干活疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种狐狸脑炎活疫苗及其制备方法。本发明利用自行分离、鉴定、致弱、保存的一株犬腺病毒II型CAV-2RZ株作为生产疫苗的病毒株，通过在MDCK细胞上进行繁殖，经过收获、冻干等步骤，制备出安全、有效的狐狸脑炎活疫苗。本发明能够有效预防狐狸脑炎的发生，为毛皮动物疫病的控制创造条件。
文档编号A61P31/20GK102488894SQ201110455840
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者刘健, 孙培录, 宋晓飞, 李营, 王蕾, 秦绪伟, 鲍海忠 申请人:齐鲁动物保健品有限公司