专利名称：1－(2′－脱氧－2′－氟－3′－O－氨基酸酯－β－L－呋喃阿拉伯糖基)－5－甲基尿嘧 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其可药用的盐；一种制备1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基的方法，包括应用此方法制备本发明的化合物及优选实施化合物；含它们的药用组合物以及单独使用1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶、或其可药用的盐、或其前药、或它们与第二种抗病毒药物联合用于制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或EBV或HCV感染引起的疾病的药物的用途。
背景技术：
专利WO9520595公开了1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶(L-FMAU)及其5′-O衍生物具有抗HBV或EBV的活性。其后相关文献Biochem.Pharmacol.，1996，51，941-947；Antimicrob.Agents Chemother.，1996，40，280-386；Antimicrob.Agents Chemother.，1998，42，833-839等进一步报道1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶具有强的抗HBV或EBV作用，且抗EBV选择性高于DHPG。在细胞内它被dCyd激酶、dThd激酶和线粒体dPyrd激酶催化生成单磷酸酯衍生物。该单磷酸酯可进一步被催化生成二磷酸酯和三磷酸酯衍生物。1-(2′-脱氧-2′-氟-5′-O-三磷酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶可抑制HBV、EBV的DNA合成，而本身不参与HBV/EBV的DNA合成。同时该三磷酸酯不抑制细胞的DNA聚合酶α、β、δ，故在体内外实验中均表现为低毒性，不抑制骨髓祖细胞，无细胞毒性，不影响线粒体功能，且即使停药后，也未发现病毒感染有反跳现象。
遗憾的是1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶水溶性低，因此，严重影响其体内药代动力学性质。Pharm.Res.，1995，121350-1353；Biopharm.Drug Dispos.，1996，17197-207；Antimicrob.Agents Chemother.，1997，41，214-2187等有关文献报道，1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶与血浆蛋白结合率低，只有15％；口服吸收很慢，而且其半衰其较短，生物利用度只有36±13％。
通过提高化合物的水溶性，可改善其体内药代动力学性质，提高口服生物利用度，这是本领域技术人员所公知的。另外，专利WO01/90121(US Serial NO 09/864,078)、WO01/92282(US Serial NO09/863,816)公开了2′和3′分枝核苷(糖基的2′位或3′位带4个非氢取代的核苷)糖基的羟基经氨基酸酰化成酯修饰，能提高其体内稳定性和生物利用度；专利WO2004002422公开了2′位带甲基取代的分枝核苷类化合物其3′-羟基经L-缬氨酸酯化修饰后在体内的吸收、分布的研究结果，β-D-2′-C-甲基-3′-O-L-缬氨酸酯-呋喃核糖基胞嘧啶(Val-mCyd)经口服给药在胃肠道的粘液、或血液、或肝脏内水解缬氨酸酯键转变成母体化合物β-D-2′-C-甲基-呋喃核糖基胞嘧啶(MCyd)，仍然保持抗病毒活性。而Val-mCyd具有更好的体内吸收效果，主要是，β-D-2′-C-甲基-3′-O-L-缬氨酸酯-呋喃核糖基胞嘧啶能通过胃肠道粘液中的氨基酸转运子的作用以主动运输方式进入血液。而一部分Val-mCyd在被完全吸收之前，在胃肠道的粘液中就水解缬氨酸酯键转变成母体化合物MCyd，则通过核苷转运子的作用进入血液。因此，与母体化合物MCyd相比，Val-mCyd以两种方式被吸收，吸收效果更好，提高了口服生物利用度，同时对人体依赖核苷转运子的作用吸收其它核苷或核苷类似物进入血液的竞争有所缓解。
申请人发现，将1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶的3′-OH与氨基酸反应成酯后，游离的氨基与酸反应形成可药用的盐，可大大提高化合物的水溶性，改善母体化合物的药代动力学性质。另一方面，1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其可药用的盐在体内水解3′-O-氨基酸酯键后，转变成母体化合物1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶发挥抗HBV和EBV的作用。
专利WO2004052899和WO2004058792公开了由2′-C-甲基-呋喃核糖构成的核苷直接酯化制备其3′-O-缬氨酸酯的方法。申请人发明了一种1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基等核苷类化合物的制备方法，应用这种新方法制备了1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。

发明内容
本发明的目的是对1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶分子中的3′-OH进行适当修饰，改善其溶解性，特别是1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶的水溶性，进而改善其体内药代动力学性质，提高口服生物利用度。同时保持母体化合物1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶的体内抗HBV或HCV或EBV等病毒的活性。
申请人发明了一种1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基等核苷类化合物新的制备方法，由2-脱氧-2-氟-3-O-(N-保护基)氨基酸酯-5-O-硅醚-呋喃阿拉伯糖基溴与5-甲基-2，4-双-O-(三甲基硅基)嘧啶反应，制备1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其可药用的盐。发现具有下列式(I)的化合物及其可药用盐与母体化合物1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶比较，水溶性明显提高，进而可改善母体化合物的体内药代动力学性质。
因此，本发明第一个方面涉及式I化合物或其可药用盐
其中核苷母体属β-L-型异构体，式(I)化合物的核苷组成部分β-L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式β-L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的核苷部分可以是β-L-型异构体与β-D-型异构体组成的混合体。式(I)化合物中氨基酸组成部分是L-型的天然氨基酸，L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式氨基酸是L-缬氨酸，L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的氨基酸可以是L-型的天然氨基酸、或D-型氨基酸、或烷基侧链α位或β位或γ位或ω位带氨基取代的羧酸、或苯环邻位或间位或对位带氨基取代的羧酸、或3-吡啶或4-吡啶羧酸等非天然氨基酸、或L-型氨基酸与D-型氨基酸组成的混合体。因此，作为本发明优选实施方式，式(I)化合物为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。
本发明的第二个方面涉及上述式(I)化合物的可药用盐，本发明化合物的可药用盐包括无机或有机酸盐，其中包括但不限于盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫氢酸盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，乙二酸盐，丙二酸盐，藻酸盐，羟乙酸盐，乳酸盐，丙酮酸盐，α-酮戊二酸盐，乙醇酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，三氟乙酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡萄糖酸盐，α-甘油磷酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，对氨基水杨酸盐，抗坏血酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐等。作为优选实施方式式(I)化合物的可药用盐为盐酸盐。
本发明的第三个方面涉及制备上述式(I)化合物的方法，其中包括以已知的糖苷为起始原料，经硅烷化试剂选择性保护其5-OH，其游离的3-OH与侧链N-保护的氨基酸酯化，进一步转化为糖基溴，与保护的碱基缩合的同时，脱去碱基保护基，再分别脱去核苷的5′-OH保护基和氨基酸侧链氨基保护基制得目标化合物，以及与酸反应制备药学上可接受的盐等合成步骤。本方法与已公开的由核苷直接酯化法制备其3′-O-氨基酸酯类化合物的方法相比较更具优势，其创新之处在于呋喃阿拉伯糖的羟基保护过程中先引入侧链N-保护的氨基酸酯，再与保护的碱基缩合，3′-O-氨基酸酯既是目标化合物(I)分子中的关键结构单元，同时直接作为其糖基多步合成过程中3′-OH的保护基，既提高了反应选择性，又减少了已公开的合成方法中的保护/脱保护反应，缩短了反应步骤。
本发明第四个方面涉及至少一种式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药在制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或HCV或EBV感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明第五个方面涉及至少一种式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药与第二种抗病毒药物联合使用，用于制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或HCV或EBV感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明第六个方面涉及药物组合物，其中包括至少一种式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药以及药用载体或赋形剂；或至少一种式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药与第二种抗病毒药物组合以及药用载体或赋形剂。
本发明还涉及治疗和/或预防由HBV或HCV引起的慢性肝炎，肝硬化，急性肝炎，突发性肝炎，慢性持久性肝炎和疲劳，以及与EBV感染有关的疾病等病症的方法，包括给予有此需要的患者治疗有效剂量的式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药；或者治疗有效剂量的式(I)化合物或其可药用盐、或它们的前药与第二种抗病毒药物组合。
本发明中的术语“HBV或HCV或EBV感染引起的疾病”是指慢性肝炎，肝硬化，急性肝炎，突发性肝炎，慢性持久性肝炎和疲劳，以及与EBV感染有关的疾病。
根据本发明的一个实施方式，本发明化合物为具有下式I的化合物或其可药用盐 其中核苷母体属β-L-型异构体，式(I)化合物的核苷组成部分β-L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式β-L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的核苷部分可以是β-L-型异构体与β-D-型异构体组成的混合体。式(I)化合物中氨基酸组成部分是L-型的天然氨基酸，L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式氨基酸是L-缬氨酸，L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的氨基酸可以是L-型的天然氨基酸、或D-型氨基酸、或烷基侧链α位或β位或γ位或ω位带氨基取代的羧酸、或苯环邻位或间位或对位带氨基取代的羧酸、或3-吡啶或4-吡啶羧酸等非天然氨基酸、或L-型氨基酸与D-型氨基酸组成的混合体。因此，作为本发明优选实施方式，式(I)化合物为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。
本发明的第二个方面涉及上述式(I)化合物的可药用盐，本发明化合物的可药用盐包括无机或有机酸盐，其中包括但不限于盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫氢酸盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，乙二酸盐，丙二酸盐，藻酸盐，羟乙酸盐，乳酸盐，丙酮酸盐，α-酮戊二酸盐，乙醇酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，三氟乙酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡萄糖酸盐，α-甘油磷酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，对氨基水杨酸盐，抗坏血酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐等。作为优选实施方式式(I)化合物的可药用盐为盐酸盐。
本发明化合物及其可药用盐可以形成溶剂化物，例如水合物，醇合物等。本发明化合物还可以是前药或可以在体内代谢变化后释放出活性成分的形式。本发明化合物或其可药用盐的前药包括式(I)化合物或其可药用盐的5′-OH被5′-OR取代所生成的化合物，其中R是磷酸酯基(包括单磷酸酯基、双磷酸酯基、三磷酸酯基、或包含在体内代谢后形成磷酸酯基的前药)，脂肪酸或芳香酸的酰基，低分子量的烷基，磺酸酯基(包括烷基或芳香烷基磺酰基，如甲磺酰基或苄基磺酰基等)，脂基(包括磷脂基)，胆甾醇衍生的取代基，氨基酸的酰基，多肽C端构成的酰基，以及在体内代谢变化后使R为氢或磷酸酯基的其它取代基。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知的技术。
根据本发明，本发明的式(I)化合物或其可药用盐可以按照申请人发明的1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基新合成方法来制备。
具体来说，按照申请人发明的1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基新的合成方法，本发明的式(I)化合物是以已知的1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷(II)为起始原料，经硅烷化试剂选择性保护其5-OH，其游离的3-OH与侧链N-保护的氨基酸酯化，进一步转化为2-脱氧-2-氟-3-O-(N-保护基)氨基酸酯-5-O-硅醚-α-L-呋喃阿拉伯糖基溴(VII)，与保护的碱基缩合的同时，脱去碱基保护基，再分别脱去核苷的5′-OH的硅醚保护基和氨基酸侧链氨基保护基制得目标化合物(I)，以及与酸反应制备药学上可接受的盐。本方法与已公开的由核苷直接酯化法制备其3′-O-氨基酸酯类化合物的方法相比较更具优势，其创新之处在于呋喃阿拉伯糖的羟基保护过程中先引入侧链N-保护的氨基酸酯，再与保护的碱基缩合，3′-O-氨基酸酯既是目标化合物(I)分子中的关键结构单元，同时直接作为其糖基多步合成过程中3′-OH的保护基，既提高了反应选择性，又减少了已公开的合成方法中的保护/脱保护反应，缩短了反应步骤。
1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-L-呋喃阿拉伯糖苷是一个已知化合物，有多种合成方法。专利WO02/079213及相关文献Nucleosides NucleotidesNucleic Acids，2002，21(2)155-163报道了由L-阿拉伯糖经过多步反应制备1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-L-呋喃阿拉伯糖苷(α、β异构体混合物)的方法。本发明中所用起始原料是1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷(II)，可参照有关文献方法按合成路线1自行合成。将已知化合物2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖(III)在二氯甲烷溶剂中，与3.8mol.L-1HBr的醋酸溶液、或30％HBr/HOAc、或45％HBr/HOAc反应，室温反应10-24小时，转化成式(IV)表示的2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖基溴(可参考J.Org.Chem.，1988，5385-88；J.Org.Chem.，1985，503644-47等文献报道的方法；或专利WO95/20595公开的方法)。式(IV)所示的化合物在K2CO3/MeOH条件下脱去3、5位苯甲酰基保护基，同时1位形成构型转化的糖苷，即本发明中所用起始原料1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷(II)(1位糖苷键构型转化，可参考文献Synthesis，1991，1005报道的方法)。
合成路线1式(II)所示的化合物合成过程中所用关键中间体1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃核糖可按文献(L.Vargha，Chem.Ber.，1954，871351；Holy.A.，et al.，Synthetic Procedures in Nucleic AcidChemistry，VI，163-67)报道的方法，由L-木糖开始合成，收率为20％；也可由更贵的原料L-核糖开始合成(Holy.A.，et al.，SyntheticProcedures in Nucleic Acid Chemistry，VI，163-67)。由1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃核糖制备2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖(III)可参照文献方法(J.Org.Chem.，1985，503644-47)。由此，可获得本发明中所用起始原料1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷(II)。
更具体地，可以采用如下所示的合成路线2合成本发明的式(I)化合物式(II)所表示的1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷在无水四氢呋喃(THF)、或无水二氧六环、或无水乙二醇二甲醚(DME)、或干燥N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、或干燥N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、或干燥二甲基亚砜(DMSO)溶剂、或THF/DMF混合溶剂中，与咪唑混合，冷却到0℃搅拌30分钟，再滴加三异丙基氯硅烷(TIPSCl)、或叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)、或叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)等羟基硅烷化试剂，或4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)催化条件下，在室温下搅拌反应1-4小时，选择性保护其5-OH，得到式(V)表示的1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-5-O-硅醚保护基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷。式(V)所示的化合物与N-苄氧羰基(Cbz)保护的氨基酸或其活化酯在二氧六环、或DMF、或THF、或THF/DMF、或二氧六环/H2O、或DMF/H2O、或THF/H2O溶剂中混合，冷却到0℃，加入1-[3-(二甲氨基)-丙基]-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、或DIC/HOBt、或BOP/HOBt、或PyBOP/DIEA、或CDI/Et3N等交联剂，DMAP催化条件下，室温搅拌反应10-24小时，生成式(VI)表示的1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-3-O-(N-苄氧羰基)氨基酸酯-5-O-硅醚保护基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷。式(VI)所示的化合物在干燥二氯甲烷溶剂中，与3.8mol.L-1HBr的醋酸溶液、或30％HBr/HOAc、或45％HBr/HOAc室温下反应10-24小时，转化成式(VII)所表示的2-脱氧-2-氟-3-O-(N-苄氧羰基)氨基酸酯-5-O-硅醚保护基-α-L-呋喃阿拉伯糖基溴。式(VII)所示的溴基糖未经分离，与经过适当保护的碱基在干燥乙腈、或干燥氯仿溶液中回流3-8小时，生成式(VIII)所表示的1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)氨基酸酯-5-O-硅醚保护基-β-L-呋喃阿拉伯糖基]碱基等核苷类化合物。式(VIII)所示的化合物在无水THF、或无水二氧六环、或无水DME、或干燥DMF、或DMA、或DMSO溶剂、或THF/DMF混合溶剂中，与四丁基氟化铵(TBAF)、或其它裂解硅醚保护基的试剂在0℃混合，室温下搅拌10分钟至3小时，脱去核苷的′-O-硅醚保护基，得到(IX)所表示的1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]碱基等核苷类化合物。式(IX)所示的化合物在无水甲醇、或无水乙醇、或无水THF、或无水二氧六环、或无水DME、或干燥DMF、或DMA、或DMSO溶剂、或THF/DMF混合溶剂中，5％Pd-C、或10％Pd-C催化条件下吸氢4-8小时即可脱去N-苄氧羰基保护基，得到式(X)所表示的1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]碱基。
合成路线2其中R′是三异丙基硅基(TIPS)、或叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、或叔丁基二甲基硅基(TBDMS)等保护基；Cbz是苄氧羰基保护基；B是5-甲基尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、胞嘧啶、5-碘尿嘧啶等碱基。当本制备方法中式(X)化合物的碱基为5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)时，即为本发明权利要求的式(I)化合物。作为本发明优选实施方式，式(I)化合物为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。
上述合成过程中，式(II)所示化合物中5-OH进行硅醚保护、以及式(VIII)所示化合物中5′-O-硅醚保护基的脱去等保护/脱保护反应条件可参考T.W.Greene；P.G.M.Wuts.“Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley & Sons，Inc.，Third Edition，1999，P.113-148。本制备方法中所用的N-苄氧羰基-L-氨基酸或其活化酯可以从美国Advanced ChemTech公司购买；也可自行合成，制备侧链N-苄氧羰基-L-氨基酸或其活化酯的技术是本领域专业技术人员所熟知的，具体可参考J.Am.Chem.Soc.，1957，795697；J.Am.Chem.Soc.，1964，861839等文献报道的方法。
根据本发明，本发明式(I)化合物与酸反应制备药学上可接受的盐的技术是本领域专业技术人员所熟知的。作为本发明优选实施方式，式(I)化合物的可药用盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶盐酸盐，其成盐反应可按合成路线3所示方法来实施。
合成路线3作为本发明优选实施方式，式(I)化合物为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶，将其溶于无水乙醇，冰水冷却下与盐酸乙醇反应，得到本发明优选实施方式中的目标化合物的盐酸盐，即1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶盐酸盐，用式(I′)。
有可能通过合成路线4所示的方法制备1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-叔丁氧羰基)-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶，用式(XIV′)表示，将式(XIV′)所示化合物溶于无水乙醇、或无水甲醇，向其中通入干燥HCl气体可脱去N-Boc保护基，同时生成目标化合物的盐酸盐。这一方法是本领域技术人员所熟知的。
制备本发明的式(I)化合物也可参考专利WO2004052899和WO2004058792公开的由呋喃核糖构成的核苷制备其3′-O-L-缬氨酸酯的方法，有可能直接由1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶制备1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶，再与适当的酸反应转化成可药用的盐。
具体地，可参考合成路线4所示的技术方法合成本发明的式(I)化合物，这些技术方法是本领域技术人员所熟知的。
式(XI)所表示的核苷1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶与三异丙基氯硅烷(TIPSCl)、或叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)、或叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)等羟基硅烷化试剂反应，选择性保护其5′-OH，生成式(XII)所表示的1-(2′-脱氧-2′-氟-5′-O-硅醚保护基-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。在EDC、或DIC/HOBt、或BOP/HOBt、或PyBOP/DIEA或CDI/Et3N等交联剂条件以及DMAP催化条件下，式(XII)所示化合物的3′-OH与N-Cbz保护或N-Boc保护的L-缬氨酸或其活化酯反应，生成式(XIII)表示的1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-保护基)-L-缬氨酸酯-5′-O-硅醚保护基-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶。式(XIII)所示的化合物与四丁基氟化铵(TBAF)、或其它裂解硅醚保护基的试剂反应，脱去核苷的5′-O-硅醚保护基，得到式(XIV)所表示的1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-保护基)-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶。式(XIV)所示的化合物与脱N-保护基的试剂反应，脱去其3′-O-L-缬氨酸酯的侧链氨基保护基，可得到本发明的式(I)所表示的1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶，再与酸反应制备式(I)化合物的可药用盐。上述制备式(I)化合物及其可药用盐的方法是本领域技术人员所熟知的。
合成路线4其中R′是三异丙基硅基(TIPS)、或叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、或叔丁基二甲基硅基(TBDMS)等保护基；R″是苄氧羰基(Cbz)、或叔丁氧羰基(Boc))等保护基。
上述合成过程中，式(XI)所示化合物中5′-OH进行硅醚保护、以及式(XIII)所示化合物中5′-O-硅醚保护基的脱去等保护/脱保护反应条件可参考T.W.Greene；P.G.M.Wuts.“Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley & Sons，Inc.，Third Edition，1999，P.113-148。上述方法中所用的侧链N-保护基-L-缬氨酸或其活化酯可以从美国Advanced ChemTech公司购买；也可自行合成，制备侧链N-保护基-L-缬氨酸或其活化酯的技术是本领域专业技术人员所熟知的。当式(XIV)化合物中3′-O-L-缬氨酸酯的N-保护基为苄氧羰基(Cbz)时，经5％Pd-C、或10％Pd-C催化氢化可脱去N-Cbz保护基生成式(I)化合物；当式(XIV)化合物中3′-O-L-缬氨酸酯的N-保护基为叔丁氧羰基(Boc)时，将其溶于无水乙醇、或无水甲醇，向其中通入干燥HCl气体即可脱去N-Boc保护基，同时生成式(I)化合物的盐酸盐。
本发明式(I)化合物与酸反应制备药学上可接受的盐的技术是本领域专业技术人员所熟知的，可按合成路线3所示方法制备。
由于本发明的式(I)化合物或其可药用盐或它们的前药具有抗HBV或HCV或EBV活性，其可用于治疗和/或预防由HBV或HCV引起的慢性肝炎，肝硬化，急性肝炎，突发性肝炎，慢性持久性肝炎和疲劳，以及与EBV感染有关的疾病等病症。
本发明的式(I)化合物或其可药用盐与第二种抗病毒药物联合使用，用于治疗或预防由HBV或HCV引起的慢性肝炎，肝硬化，急性肝炎，突发性肝炎，慢性持久性肝炎和疲劳，以及与EBV感染有关的疾病等病症。
可用于与本发明公开的式(I)化合物或其可药用盐联合用药的抗病毒药物包括但不限于1-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶(Clevudine)、(-)-(2′R，3′S)-1-[2-(羟甲基)-1，3-氧硫杂戊烷-5-基]胞嘧啶(3TC，拉米夫定)、(1S，3R，4S)-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]鸟嘌呤(Entecavir)、阿德福韦酯、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦、干扰素、AZT、DDI(2′，3′-二脱氧肌苷)、DDC(2′，3′-二脱氧胞苷)，L-5-F-DDC和D4T等。干扰素是指干扰素α(包括干扰素α-2a、干扰素α-2b)、干扰素β(包括干扰素β-2b)、ω干扰素、干扰素γ(包括干扰素γ-1b)、以及PEG修饰的干扰素。
本发明的活性化合物可以本身形式给药，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。
可用于本发明的可药用载体包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钠，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。
本发明化合物或其药学上可接受的盐或它们的前药、或它们的水合物或醇合物可以利用各种给药途径或方式释放至患者。适合的给药途径包括但不限于口服、透皮、经粘膜、直肠、肠内和肠胃外给药，肠胃外给药包括肌内、皮下和静脉内注射。
本发明所用的术语“给药”包括所有直接与间接释放化合物到其预期作用部位的手段。
因此，根据给药途径的不同，本发明化合物可以制成任何适合于给药的形式，其包括但不限于片剂、胶囊、气雾剂、栓剂、用于食入或注射的液体剂型、眼或耳滴剂、舌下含片、营养增补剂或局部制剂。
可以口服的药物制剂包括胶囊剂和片剂等。病人吞咽有困难时，也可以采用舌下片或者其他非吞咽的方式给药。
本发明化合物也可以配制用于肠胃外给药或者透皮给药或者经粘膜给药。或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。
本领域技术人员可以理解，在本发明化合物的基础上，可以采用合适的药物释放系统(DDS)，以得到更有利的效果。
给药方式以及有效剂量的选择将根据所治疗的疾病而异。给药方式和剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
本发明化合物的单位剂型通常含有0.1至99重量％活性物质，更优选5至75重量％活性物质。对于口服给药，单位剂型可以含有1mg至1g本发明化合物或其可药用盐，更优选为10mg至500mg，更优选50mg与400mg之间，最优选为50mg至200mg。对于肠胃外给药，优选含有0.1至25mg的本发明化合物或其可药用盐。
本发明所述的化合物或其可药用盐可以单独给药或与其他一种或多种本发明化合物联合给药，还可以与其它已知的抗病毒剂联合的形式给药。
具体实施例方式
下面的实施例用来说明本发明，但对本发明不构成任何限制。
实施例1 1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶1.1 1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-5-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷的合成将8.3g(0.05mol)1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷溶于120ml无水四氢呋喃(THF)，向其中加入4.5g(0.066mol)咪唑，将反应混合物冷却到0℃搅拌30分钟，再滴加12ml(0.056mol)三异丙基氯硅烷(TIPSCl)。加料完毕，撤离冷浴，反应混合物自然恢复到室温并搅拌2.5小时，TLC检测原料转化完全。在40℃以下减压浓缩至1/3体积，向其中加入250ml饱和NH4Cl水溶液，以3×100ml乙酸乙酯提取，合并有机相，饱和食盐水溶液洗涤一次，无水Na2SO4干燥，过滤，40℃以下减压浓缩，残留物经硅胶柱层析分离(200-300目硅胶，洗脱剂正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)，得无色糖浆状物，重13.5g，收率84％。MS(FAB，M+1)323。
1.2 1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-3-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-5-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷的合成将7.8g(0.03mol)N-苄氧羰基(Cbz)-L-缬氨酸溶于15ml二氧六环，氩气保护下，冷却到0℃并搅拌。另取5.8g(0.03mol)1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于15ml蒸馏水，将EDC水溶液滴加到N-苄氧羰基-L-缬氨酸的二氧六环溶液中，0℃搅拌10分钟。另取6.5g(0.02mol)1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-5-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷溶于15ml二氧六环，再将此溶液滴加到0℃的N-苄氧羰基-L-缬氨酸与EDC的混合溶液中，滴加完毕，向其中分批加入0.3g 4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)。撤离冷浴，反应混合物自然恢复到室温并在氩气保护下搅拌8小时，TLC检测原料转化完全。40℃以下减压浓缩至1/3体积，向其中加入100ml蒸馏水，以3×50ml乙酸乙酯提取，合并有机相，饱和食盐水溶液洗涤一次，无水Na2SO4干燥，过滤，40℃以下减压浓缩，得无色糖浆状物，重8.5g，收率76％。MS(ESI，M+1)556。
1.3 1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-5′-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶的合成将8.4g(15mmol)1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-3-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-5-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖苷溶于20ml干燥二氯甲烷，冷却到0℃，向其中缓慢滴加3.8mol.L-1HBr醋酸溶液8.9ml(33.8mmol)。滴加完毕，反应混合物在室温下搅拌过夜，40℃以下减压浓缩，3×25ml干燥苯带残留溶剂，再用30ml干燥乙腈带一次残留溶剂，将所得溴基糖粗产物重新溶于25ml干燥乙腈。
另取4.2g(33mmol)胸腺嘧啶、0.38g硫酸铵和21ml(16.1g，99.5mmol)1，1，3，3-六甲基二硅氮烷溶于150ml干燥乙腈中，加热回流12小时直到反应混合物澄清，然后冷却到室温。将上述溴基糖乙腈溶液滴加到2，4-双-O-(三甲基硅基)胸腺嘧啶乙腈溶液中，然后加热回流6小时，TLC检测原料转化完全。滴加10ml甲醇终止反应，出现沉淀，将悬浮液在室温下搅拌1.5小时，通过硅藻土滤饼滤除固体，以3×20ml乙腈洗涤，合并有机相，减压浓缩至干。100ml二氯甲烷重新溶解残留物，以2×60ml蒸馏水洗涤，2×60ml饱和NaHCO3溶液洗涤，2×60ml饱和食盐水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，40℃以下减压浓缩，得类白色固体，重5.55g，收率56.6％。MS(FAB，M+1)650。
1.4 1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶的合成将4.86g(7.5mmol)1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-5′-O-三异丙基硅基-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶溶于15ml干燥THF，冷却到0℃，向其中滴加3ml 1mol·L-1四丁基氟化铵(TBAF)的THF溶液。撤离冷浴，反应混合物自然恢复到室温，搅拌30分钟，TLC检测原料转化完全。滴加15ml饱和NaHCO3水溶液终止反应，加入乙酸乙酯提取，合并有机相，饱和食盐水溶液洗涤一次，无水Na2SO4干燥，过滤，40℃以下减压浓缩，残留物经硅胶柱层析分离(200-300目硅胶，洗脱剂正己烷∶乙酸乙酯＝9∶1)，得白色固体，重3.4g，收率92％。MS(FAB，M+1)494。
1.5 1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶的合成将2.96g(6mmol)1-[2′-脱氧-2′-氟-3′-O-(N-苄氧羰基)-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基]-5-甲基尿嘧啶溶于35ml无水乙醇，向其中加入0.3g 5％的Pd-C，温度25-30℃、压力2Kg/cm2条件下吸氢4小时，滤除催化剂，40℃以下减压浓缩，得白色固体，重2.05g，收率95％。MS(FAB，M+1)360。
实施例2 1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶盐酸盐将1.5g(4.18mmol)1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶溶于8ml无水乙醇，冰水冷却下，向其中滴加盐酸乙醇溶液直到反应液呈酸性，搅拌30分钟，滤集固体，无水乙醇洗涤，P5O2真空条件下干燥，得白色粉末状固体，重1.52g，收率92％。
实施例3 1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷(II)3.1 1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖的合成将9.3g(0.02mol)2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖溶于45ml干燥二氯甲烷，冷却到0℃，向其中缓慢滴加3.8mol.L-1HBr醋酸溶液11.8ml(0.045mmol)。滴加完毕，反应混合物在室温下搅拌24小时，40℃以下减压浓缩，将残留物重新溶于200ml二氯甲烷，分别用蒸馏水、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水溶液洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，40℃以下减压浓缩，得无色糖浆状物，重8.28g，收率97.6％。溴基糖粗品未经纯化直接用于下一步反应。
3.2 1-O-甲基-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿拉伯糖苷的合成将上一步反应所得的1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖粗品溶于15ml干燥THF，向其中加入55ml无水甲醇和6.12g(44.4mmol)无水K2CO3粉末，滴加完毕，反应混合物在室温下搅拌40小时，过滤，2×10ml无水甲醇洗涤固体，40℃以下减压浓缩，残留物经硅胶柱层析分离(200-300目硅胶，洗脱剂正己烷∶乙酸乙酯＝3∶2)，得无色糖浆状物，重2.2g，收率68％。MS(ESI，M+1)167。
权利要求
1.下式I所示的1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其可药用的盐 其中核苷母体属β-L-型异构体，式(I)化合物的核苷组成部分β-L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式β-L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的核苷部分可以是β-L-型异构体与β-D-型异构体组成的混合体。式(I)化合物中氨基酸组成部分是L-型的天然氨基酸，L-型异构体的含量至少大于90％，作为优选实施方式氨基酸是L-缬氨酸，L-型异构体的含量至少大于95％。但作为选择性实施方式式(I)化合物的氨基酸可以是L-型的天然氨基酸、或D-型氨基酸、或烷基侧链α位或β位或γ位或ω位带氨基取代的羧酸、或苯环邻位或间位或对位带氨基取代的羧酸、或3-吡啶或4-吡啶羧酸等非天然氨基酸、或L-型氨基酸与D-型氨基酸组成的混合体。
2.根据权利要求1，式(I)化合物优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶。
3.根据权利要求1，式(I)化合物及其可药用的盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶盐酸盐。
4.一种制备1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-氨基酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)碱基的方法，该方法包括以下步骤(1)使式(II)所表示的化合物 与三异丙基氯硅烷(TIPSCl)、或叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)、或叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)等羟基硅烷化试剂反应，选择性保护其5′-OH，得到式(V)表示的化合物 其中R′是三异丙基硅基(TIPS)、或叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、或叔丁基二甲基硅基(TBDMS)等保护基；(2)使式(V)所示的化合物与N-苄氧羰基保护的氨基酸或其活化酯在一种或多种交联剂存在条件下反应，生成式(VI)所表示的化合物 其中Cbz是苄氧羰基，R′的定义同反应(1)中化合物(V)中的定义；(3)使式(VI)所示的化合物与氢溴酸在醋酸条件下(HBr/HOAc)反应，得到式(VII)所表示的化合物 其中Cbz和R′的定义同反应(2)中化合物(VI)中的定义；(4)使式(VII)所示的化合物与经过适当保护的碱基进行缩合反应，生成式(VIII)所表示的化合物 其中碱基B选自5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)，5-碘尿嘧啶，胞嘧啶，5-乙基尿嘧啶；Cbz和R′的定义同反应(2)中化合物(VI)中的定义；(5)使式(VIII)所示的化合物与四丁基氟化铵(TBAF)、或其它裂解硅醚保护基的试剂反应，选择性脱去核苷的5′-O-硅醚保护基得到(IX)所表示的化合物 其中碱基B同反应(4)中化合物(VIII)中的定义；Cbz同反应(2)中化合物(VI)中的定义，为苄氧羰基；(6)使式(IX)所示的化合物在5％Pd-C、或10％Pd-C等催化氢化条件下，脱去其3′-O-氨基酸酯的N-苄氧羰基保护基，得到(X)所表示的化合物。 其中碱基B同反应(4)中化合物(VIII)中的定义；(7)(X)所示的化合物在乙醇、或甲醇溶液中与药学上可接受的酸反应，制得相应的可药用盐。
5.根据权利要求4，权利要求1的化合物及其可药用的盐的制备方法。
6.根据权利要求5，权利要求1的化合物及其可药用的盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其盐酸盐。
7.权利要求1的化合物及其可药用的盐在制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或HCV或EBV感染引起的疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7，权利要求1的化合物及其可药用的盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其盐酸盐。
9.应用于制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或HCV或EBV感染引起的疾病的药物中的权利要求1的化合物及其可药用的盐与第二种抗病毒药物联合使用。
10.根据权利要求9，权利要求1的化合物及其可药用的盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其盐酸盐。
11.药物组合物，包括治疗有效剂量的一种权利要求1的化合物或其可药用的盐和可药用载体或赋形剂，或治疗有效剂量的一种权利要求1的化合物或其可药用的盐与第二种抗病毒药物组合和可药用载体或赋形剂。
12.根据权利要求11，权利要求1的化合物及其可药用的盐优选为1-(2′-脱氧-2′-氟-3′-O-L-缬氨酸酯-β-L-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿嘧啶及其盐酸盐。
全文摘要
本发明涉及式I所示的1－(2′－脱氧－2′－氟－3′－O－氨基酸酯－β－L－呋喃阿拉伯糖基)－5－甲基尿嘧啶及其可药用的盐，式中各基团的限定如说明书所述；一种制备1－(2′－脱氧－2′－氟－3′－O－氨基酸酯－β－L－呋喃阿拉伯糖基)碱基的方法，包括应用此方法制备式I所示的化合物及优选实施化合物；含有式I化合物或其可药用的盐的药物组合物，或含有式I化合物或其可药用的盐与第二种抗病毒药物联合的药物组合物；式I化合物及其可药用的盐，或I化合物及其可药用的盐与第二种抗病毒药物联合用于制备治疗和/或预防急性和慢性HBV或EBV或HCV感染引起的疾病的药物的用途。
文档编号A61P1/00GK1840538SQ20051005992
公开日2006年10月4日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者李伟章 申请人:李伟章