专利名称：葡萄花色素苷组分及药理活性研究的制作方法
技术领域：
本发明涉及从葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中获得的花色素苷组分，及该组分在降脂、抗氧化、调节血管内皮细胞分泌功能、治疗动脉粥样硬化方面的药理活性研究。
背景技术：
葡萄中的花色素苷是一类重要的天然色素，是赋予葡萄与葡萄酒红色的主要物质，对其质量有着重要的影响。葡萄花色素苷分布于果皮、果肉、葡萄籽、芽鳞片等，主要分布于果皮。葡萄花色素苷主要包括9种成分:1、花翠素3-0-葡萄糖苷，2、花青素3-0-葡萄糖苷，3、甲花翠素3-0-葡萄糖苷，4、甲基花青素3-0-葡萄糖苷，5、二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，6、甲基花青素3-0-￠-0-乙酰)葡萄糖苷，7、二甲花翠素3-0-￠-0-乙酰)葡萄糖苷，
8、甲基花青素3-0-￠-0-对香豆酰)葡萄糖苷，9、二甲花翠素3-0-￠-0-对香豆酰)葡萄糖苷。植物中蕴涵着丰富的花色素苷，花色素苷最突出的作用是使植物呈现五彩缤纷的颜色，同时花色素苷也是植 物中具有生理活性功能的成分。花色素苷具有很强的抗氧化作用，可以清除体内的自由基；降低氧化酶的活性；可以降低高血脂的甘油脂水平；改善高甘油脂脂蛋白胆固醇含量；抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜等多种功能。自由基的连锁氧化反应，可导致生物细胞膜有害物质的形成和膜结构的改性，如酶等蛋白质、DNA等的改变，并引发各种疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、心血管疾病和神经性疾病等。花色素苷是清除自由基能力最强的抗氧化剂和脂质过氧化抑制剂，能够防治多种因自由基引起的疾病，包括心脏病、癌症及关节炎等病症。葡萄原产于欧洲、西亚和北非一带，伊朗是最早酿造葡萄酒的国家，欧洲最早开始种植葡萄并进行葡萄酒酿造的国家是希腊。葡萄品种很多，全世界约有上千种，总体上可以分为酿酒葡萄和食用葡萄两大类。中国葡萄产于长江流域以北各地，主产于新疆、甘肃、宁夏、山西、河北、山东等地。中国酿酒葡萄主要有赤霞珠、黑比诺、梅尔诺、瑞引、品丽珠、西拉和马贝克等，食用葡萄主要有巨峰、玫瑰香、红提等。适合葡萄生长的地区和环境才有可能生产出理想的葡萄美酒。目前我国有4个原产地保护地区，分别是河北昌黎、沙城、山东烟台和宁夏贺兰山。而在国际上，各国也都有自己原产地保护区域。葡萄皮中的有效成分花色素苷在酿制葡萄酒过程中大部分转移到了葡萄酒中，是葡萄酒中能检测到的有效成分。酿制葡萄酒所产生的葡萄皮和籽的残渣中却含有许多没有提取出去的有效成分，如葡萄籽中的原花青素和葡萄皮中的花色素苷。葡萄籽中的有效成分原花青素已经有商品上市销售，而葡萄皮中的花色素苷却没有见到上市销售的商品。如将葡萄皮残渣中的花色素苷提取出来加以利用，是对废弃葡萄残渣的再利用，是葡萄产业链的延伸，将产生巨大的经济效益和社会效益。从葡萄皮残渣中提取的花色素苷有效组分水溶液又酸又涩，无法以液体形式食用。
本专利的创新之处及新颖性在于:经过我们设计的提取分离精制工艺，可去掉花色素苷水溶液的酸涩味道，使花色素苷水溶液没有什么怪味，可调制成任何味道而食用，可制成饮料、口服液、保健酒等；制定了花色素苷有效组分的质量标准，使专利保护成为可能；进行了花色素苷有效组分的药理活性研究，证明花色素苷有效组分能降脂、抗氧化、调节血管内皮细胞分泌功能、治疗动脉粥样硬化。

发明内容
赤霞珠的皮和籽混合物，经过提取分离精制，获得有效组分A2，A2可以是水溶液，也可以是固体。A2中主要有三种花色素苷，即:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷，其中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量远大于其他两种花色素苷。归一化法结果显示，A2中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量大于66%，三种成分的含量总合大于85% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。外标法结果显示，A2(固体)中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为A2 = 25.29%。经药理学研究证实，A2具有降脂、抗氧化、调节血管内皮细胞分泌功能、治疗动脉粥样硬化的药理作用。为了研究有效组分中二 甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量变化是否影响有效组分的药理活性，我们又制备了两种有效组分Al和A3。A1、A3固体粉末中，二甲花翠素3_0_葡萄糖苷的含量分别为Al = 21.43%, A3 = 33.56%。归一化法结果显示，Al、A3中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量大于66%,三种成分的含量总合大于85% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。经药理学研究证实，三种有效组分Al = 21.43%,A2 = 25.29%, A3 = 33.56%在药理活性上没有差异。根据12批样品HPLC分析，我们制定了葡萄花色素苷有效组分外标法含量标准，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为20 35% ;归一化法含量标准，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为66 88%，三种成分的含量总合为85 100% (二甲花翠素3_0_葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。中国酿酒葡萄主要有赤霞珠、黑比诺、梅尔诺、瑞引、品丽珠、西拉和马贝克等，食用葡萄主要有巨峰、玫瑰香、红提等。根据资料记载及我们的分析结果，花色素苷主要存在于葡萄皮中，不同品种葡萄中花色素苷成分种类近似，只是含量上有差异；我们关注的三种花色素苷成分，即:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷在不同品种葡萄中普遍存在。虽然葡萄品种不同，但经过我们的提取分离精制工艺，可以将其他成分最大限度地祛除，获得有效组分，该有效组分的质量符合我们制定的质量标准。所以本专利适用于不同葡萄品种，提取有效组分时可以用葡萄、葡萄皮或葡萄皮和籽的混合物。实验例I有效组分中花色素苷的HPLC分析1.1标准品和试剂二甲花翠素3-0-葡萄糖苷标准品(HPLC，纯度98.23%，本公司实验室自制)，甲醇(HPLC)，乙腈(HPLC)，超纯水(0.22um)，甲酸(AR)。1.2 仪器高效液相色谱仪:岛津Essentia LC-15C ;送液单元:LC_15C ;柱温箱:CT0_15C ；检测器:紫外检测器SPD-15C ；自动进样器:SIL-10AF。分析天平:sartorius,BT25S01.3色谱条件1.3.1 色谱柱:Zorbax SB C-18250X4.6mm 1.d.，保护柱:ZorbaxSBC-1812.5X4.6mm 1.d.。1.3.2测定波长535nm,流速lml/min,柱温30°C,进样体积20ul。1.3.3 流动相:7jC / 乙腈 / 甲酸(A = 80/10/7 ；B = 40/50/7)，1.3.4梯度:0min，0% B ；15min,30% B ；25min,50% B ；30min,0% B ；35min,0% B。1.4样品处理和含量分析葡萄花色素苷有效组分12批，标准品和有效组分样品用水溶解，用0.45um滤膜过
滤，直接进样分析，重复三次。1.4.1归一化法:主要测定二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷的相 对百分含量。归一化时选择最小峰面积为lOOOcounts。1.4.2外标法:用标准品作对照，测定二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量。1.5分析结果1.5.1归一化法结果:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为66 88%，三种成分的含量总合为85 100% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-匍萄糖苷)。1.5.2外标法结果:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为20 35%。实验例2样品Al、A2、A3对高脂血症大鼠降脂抗氧化作用的影响试验动物SD大鼠,雄性；体重:160土30g ；由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供，合格证号:SCXK (京)2009-0017。饲料:由北京科澳协力饲料有限公司提供，经6tlCo照射灭菌。产品许可证号:SCXK-(京)2009-0012。试验材料1.受试药物:样品Al溶液,干品中有效成分含量21.43样品A2溶液,干品中有效成分含量25.29% ;样品A3溶液，干品中有效成分含量33.56%。样品溶液浓度:187.5g生药/ml提取物。存储于冰箱内，临用前摇匀。阳性对照:血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司(批号20110203)。2.试剂:总胆固醇(CHO)测试盒(批号20110620)，甘油三酯(TG)测试盒(批号20110431)，以上均由北京北化康泰临床试剂有限公司提供；丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号20110830)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号20110831)，均由南京建成生物工
程研究所提供。3.仪器:GF_D800型半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司。4.剂量:将样品原药液分别稀释4倍，8倍，16倍，作为大、中、小剂量，相当于468、234、117g生药/kg ;血脂康0.6g/kg。给药容积lml/100g体重。试验方法1.实验分组:155只大鼠，首先分为空白对照组和高脂组，空白组12只，给予普通饲料喂养，其余143只为高脂组，给予高脂饲料(I %胆固醇，10%猪油，0.2%猪胆盐，10%蛋黄粉，78.8%基础饲料，由北京科澳协力有限公司提供)喂养15天，第15天动物眼眶静脉丛采血lmL，测定血清总胆固醇(TC)，根据胆固醇水平，剔除未出现高脂血症的高脂大鼠，其余随机分组:模型组，阳性药组，样品Al大、中、小剂量组，样品A2大、中、小剂量组，样品A3大、中、小剂量组，每组12只，分组当天开始给药，空白组和高脂模型组给予同体积的蒸懼水，除空白对照组外其余继续给予高脂饲料喂养，连续给药14天。2.取血:末次给药后禁食12h，股动脉取血处死。3.指标测定:TC和TG的测定均为酶法，MDA的测定为TBA法，SOD的测定为黄嘌呤氧化酶法，均在半自动生化分析仪上进行检测。4.数据分析:结果以均值土标准差形式表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，统计学显著性设定P < 0.05。试验结果1.高脂饮食15天对各组大鼠总胆固醇(TC)水平的影响模型组大鼠给予高脂饮食15天后，与空白组比较，总胆固醇明显升高(P<0.001)，说明高脂血症大鼠模型建立成功。根据TC水平第二次随机分组后，各组大鼠TC水平没有明显差异。见表I。表I闻脂饮食第15天大鼠血清总胆固醇(TC)水平(X±SD , n = 12)
权利要求
1.一种从葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中获得的花色素苷组分，该组分的特征在于，外标法显示，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为20 35% ;归一化法显示，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量为66 88 %，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲花翠素3_0_葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷的含量总合为85 100% ;药理学研究表明，该组分具有降月旨、抗氧化、调节血管内皮细胞分泌功能、治疗动脉粥样硬化的药理作用。
2.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗由于血脂增高导致的疾病。
3.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗由于自由基增多导致的疾病。
4.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗由于血管内皮细胞分泌功能紊乱导致的疾病。
5.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗由于冠状动脉粥样硬化导致的疾病。
6.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗由于脑动脉粥样硬化导致的疾病。
7.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，该组分用于治疗除了冠状动脉和脑动脉之外其他脏器、器官及组织由于动脉粥样硬化导致的疾病。
8.根据权利要求1所述的组分，其特征在于，将该组分制成碳酸饮料、功能性饮料、口服液、保健酒、水针剂、粉 针剂、片剂、胶囊、滴丸。
全文摘要
本发明公开了一种从葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中获得的花色素苷组分，制定了该组分的质量标准，进行了药理学研究；药理学研究表明，该组分具有降脂、抗氧化、调节血管内皮细胞分泌功能、治疗动脉粥样硬化的药理作用。
文档编号A61P3/06GK103222979SQ20131010892
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者房寒冰, 魏峰 申请人:房寒冰