专利名称：赤芝孢子的抗突变效果的制作方法
技术领域：
本发明涉及萌发活化(germination activated)的赤芝(Ganoderma lucidum)孢子的粉末在胎儿保护中的用途。具体地，本发明涉及通过给怀孕的哺乳动物给药萌发活化的赤芝孢子的粉末以防止胎儿损伤的方法。
尤其，GASP已被用于、或被推荐用于免疫疾病、肝炎、AIDS、癌症、糖尿病、防止自由基氧化、抑制肝毒性的活性、以及用于治疗心血管疾病、细菌或病毒感染等等。但是，到目前为止还没有GASP在怀孕中或对发育的胎儿的效果的报道。
因此，本发明的目的在于提供一种保护胎儿的方法，其包括对怀孕的哺乳动物给药有效保护量的GASP。在优选的实施方案中，对怀孕的人给药GASP。
但是，该方法一般对哺乳动物都有效，包括大鼠、小鼠、犬、猫、兔、牛、羊等，包括更高级的非人灵长类。尤其是，本发明的目的在于提供一种保护胎儿不发生突变的方法，该突变包括染色体畸变，其可能是由于环境中的有毒的物质引起，或由于紫外或电离辐射引起。
“致畸”是指增加先天性的或发育的畸形的发生率。致畸剂可以是化学化合物，胎儿或怀孕妇女的遗传基因座(genetic locus)(参见美国专利6,210,950，其在本文中引用作为参考)，或环境中的物理力，如紫外或电离辐射，电磁辐射等等。
尽管GASP活性的确切机理还未知，但本发明的发明者已证明对怀孕的雌性哺乳动物给药GASP能减少由任何来源引起的发育畸形、胎儿死亡和先天缺陷的发生率。
“突变”是指引起染色体或基因的结构改变。
本发明的一个目的在于提供一种保护胎儿免受怀孕妇女可能接触的致突变化合物，以及保护胎儿免受这些化合物的致畸作用的方法。这些致突变化合物的实例包括，但不限于环磷酰胺、砷、黄曲霉毒素B1、氯乙烯、乙酰氨基芴、黄樟素、二甲亚硝胺、苯甲酸安替比林(benzo(a)pyrine)、二苯蒽、氮芥、β-丙酸内酯、乙基甲磺酸酯(ethylmethane sulfonate)、甲基亚硝基脲、和硫酸二甲酯。很多致突变化合物是本领域普通技术人员所熟悉的，并且可以通过本领域普通技术人员已知的检测方法鉴别。尽管怀孕的哺乳动物，尤其是人，通常不是故意暴露于这些化合物，但是在环境中可能存在可以影响胎儿的少量的这些或其它的化合物。
本发明的另一个目的在于提供减少哺乳动物，尤其是人的发育和先天缺陷的方法。
通过对怀孕的雌性哺乳动物，尤其是人给药GASP，能实现本发明的这些和其它目的。
对于人，GASP的优选给药剂量是每人0.5g/天至50g/天，更优选在每人1至25g/天，通常推荐的剂量是4.8g/天。认为为了最佳的益处，GASP应该在整个怀孕期间使用。
对于诸如兽医目的的对其它哺乳动物给药，预期有效剂量按照接受动物的单位体重的给药量是大致相等的，并且本领域普通技术人员可以通过常规实验测定该有效剂量。
按照本发明的方法给药GASP能预防或减少胎儿中的胎儿死亡、突变损伤和发育或先天缺陷的发生率或可能性。
发明详述在本发明优选实施方案的描述中，为清楚起见使用了具体的术语。但是，本发明不限制于所选择的具体术语。应理解，每个具体的要素包括按照类似方式完成类似目的的所有技术等价物。
使用的测试为改进的小鼠骨髓细胞小核测试，其在中国卫生部的一份文件，“关于‘健康食品功能评价程序和测试方法’的修订的项目的发布的公告”中具体说明，其在本文引用作为参考。
批号No.2000118的萌发活化的赤芝孢子的粉末从中山大学生命科学学院的广州绿色食品工程公司和瑞典和香港的绿色能源健康产品国际有限公司商业购买。
90只NIH小鼠，雌雄各半，体重18-20g，从广东省医学实验动物中心获得，其合格证书编号为200A025。
GASP的推荐临床剂量为4.8g/天/人，其按照人和小鼠的各自体重换算。其等价于小鼠的剂量为0.61g/kg(4.8g÷7.9＝0.61g/kg)。GASP的推荐临床剂量的大约10倍量不会引起人和小鼠的副作用。如果高剂量组给药每日剂量的10倍量，则三个小鼠剂量组分别给药6.10g/kg、3.10g/kg和0.61g/kg，其等同于人临床剂量的10、5、和1倍量。
将小鼠按体重随机分为9组，每组分别雄性5只和雌性5只。每组动物进行下列治疗第1组接受6.1g/kg GASP和50mg/kg环磷酰胺(“CP”)。
第2组接受3.1g/kg GASP和50mg/kg CP。
第3组接受0.6g/kg GASP和50mg/kg CP。
第4组接受0g/kg GASP和50mg/kg CP。
第5组接受6.1g/kg GASP和40mg/kg CP。
第6组接受3.1g/kg GASP和40mg/kg CP。
第7组接受0.6g/kg GASP和40mg/kg CP。
第8组接受0g/kg GASP和40mg/kg CP。
第9组接受0g/kg GASP和0mg/kg CP。
将每组的雄性和雌性分别在不同的笼中喂养。进行实验的时间为30天。在这段时间，严密监控动物的食物消耗和异常表现，每3-7天纪录动物的体重变化。
将药物制备成在蒸馏水中的所需浓度的混悬液，以0.2mL/10g体重的单个剂量通过管口服给药。阴性对照组每天一次，连续30天通过管施用等体积的蒸馏水。在该测试的第30天，受试药物组和阳性对照组分别口服给药CP40和50mg/kg一次。给药CP后1小时，受试药物组和阴性对照组再给药受试药物和蒸馏水一次，最后一次给药后24小时处死小鼠。在处死小鼠4小时前，给其施用秋水仙碱，按照常规方法提取骨髓以制备染色体样品。
观察每组的样品。观察每个小鼠100个分裂中期细胞，纪录染色体结构和畸变数量。应用Windows8.0的SPSS(t-检验)，对各个剂量组和阳性组的实验数据进行比较分析，检验以发现各组内的雄性和雌性间是否存在显著性差异。
在30天的测试期中各组小鼠的重量如表1所示。数据表明各测试组和阴性对照组动物的体重没有显著性差异(p＞0.05)。该结果表明GASP的各个剂量对小鼠的体重增加没有影响。表1.在给药萌发活化的赤芝孢子的粉末期间小鼠体重的变化(X±S，g)组 测试药CP 动 性别 0天 4天 8天 15天 22天 29天 净体重增物剂量 剂量物 加(g/kg) (mg/kg) 数1 6.1 50 5 M 20.5±0.7 20.0±1.8 25.0±1.4 25.0±2.9 26.3±2.628.1±3.17.6±2.86.1 50 5 F 18.1±0.1 19.9±1.3 22.3±1.7 22.5±1.7 23.6±1.225.5±1.07.4±1.02 3.1 50 5 M 20.2±1.2 22.1±1.3 24.2±1.7 26.2±2.6 29.6±3.831.0±3.610.8±4.13.1 50 5 F 18.4±0.5 19.9±1.1 22.3±1.5 23.6±2.3 24.7±2.026.2±1.27.8±1.13 0.6 50 5 M 18.7±1.6 21.1±0.5 24.1±2.7 26.1±3328.9±3.029.6±2.510.4±3.40.6 50 5 F 18.3±0.4 19.3±0.9 20.9±1.3 22.0±0.5 22.9±0.725.2±0.46.9±0.54 0 50 5 M 19.8±1.5 21.0±1.7 24.8±3.2 25.1±4.6 26.3±1.627.9±1.68.1±1.80 50 5 F 18.2±0.4 19.3±2.0 21.8±1.9 23.2±1.8 24.3±2.125.9±1.07.6±0.95 6.1 40 5 M 19.4±1.2 21.8±1.1 24.4±0.5 24.5±2.1 28.2±3.128.9±2.28.8±2.96.1 40 5 F 18.1±0.9 19.8±1.8 21.9±2.1 23.6±2.1 24.6±2.425.9±1.37.9±1.36 3.1 40 5 M 20.5±1.0 21.3±1.3 23.3±3.4 25.4±3.2 27.5±2.829.3±3.08.7±2.43.1 40 5 F 18.4±0.3 19.7±0.8 20.9±0.9 22.2±0.8 23.7±1.425.7±1.67.2±1.87 0.6 40 5 M 20.3±1.0 23.0±1.2 25.7±1.2 27.7±1.9 31.3±3.333.2±3.812.8±3.90.6 40 5 F 18.3±0.3 21.1±0.7 23.6±0.6 25.0±0.4 26.8±1.426.8±0.48.4±0.48 0 40 5 M 19.4±1.3 22.8±1.3 26.0±1.3 28.1±1.3 32.4±1.833.2±2.013.7±1.80 40 5 F 18.2±0.2 19.6±1.2 22.9±1.0 24.8±0.6 27.1±2.327.5±2.19.3±1.89 0 0 5 M 19.7±1.3 22.8±0.9 25.4±1.1 26.6±1.4 29.0±3.830.1±3.610.4±4.50 0 5 F 18.0±0.2 20.6±0.5 22.8±0.4 24.2±1.5 25.7±0.526.3±1.08.3±1.0各个GASP剂量组(第1，2和3组)中的被50mg/kg CP诱导的骨髓细胞染色体畸变率显著低于阳性对照组，如表2所示。各个剂量组和阳性对照组间的差异是显著的(p＜0.01)。GASP对CP诱导的小鼠染色体畸变的抑制率平均超过50％。结果还表明GASP剂量增加与染色体畸变抑制效果增加之间的剂量依赖关系。表2.萌发活化的赤芝孢子的粉末对50mg/kg CP诱导的小鼠骨髓细胞染色体畸变的抑制效果
1ctg染色单体间隙2csg染色体间隙3ctb染色单体断裂4csb染色体断裂5f染色体断片(fragment)6tr三相交换体(triradial)7r环状染色体8dmin二微体(dimicrobody)9del缺对染色体抑制率＝(阳性组细胞畸变率-GASP组细胞畸变率)/阳性组细胞畸变率*p＜0.05与阳性组相比**p＜0.013与阳性组相比如表3所示，各个GASP剂量组(即用GASP治疗)被40mg/kg CP诱导的骨髓细胞染色体畸变率显著低于阳性对照组。各个剂量组和阳性对照组间的差异是显著的(p＜0.01)。各个GASP剂量组对CP诱导的小鼠染色体畸变的抑制率超过30％，但是没有明显的剂量-效果依赖关系。结果表明GASP对CP诱导的小鼠骨髓细胞染色体损伤有抑制效果。表3.萌发活化的赤芝孢子的粉末对40mg/kg CP诱导的小鼠骨髓细胞染色体畸变的抑制效果
1ctg染色单体间隙2csg染色体间隙3ctb染色单体断裂4csb染色体断裂5f染色体断片6tr三相交换体7r环状染色体8dmin二微体(dimicrobody)9del缺对染色体抑制率＝(阳性组细胞畸变率-GASP组细胞畸变率)/阳性组细胞畸变率*p＜0.05与阳性组相比**p＜0.013与阳性组相比结果表明小鼠给药6.1、3.1和0.61g/kg GASP(相当于推荐临床剂量的10，5，和1倍)后30天，对40或50mg/kg CP诱导的小鼠骨髓细胞染色体畸变有抑制效果，其中最高剂量组(6.1g/kg)对50mg/kg CP诱导的小鼠骨髓细胞染色体畸变的抑制率可以达到67.8％。这表明GASP对环磷酰胺诱导的小鼠染色体损伤有保护作用。
给大鼠喂食广东省医用动物中心提供的标准小球状食物。选择体重在200-250g间的健康SD大鼠，以雌雄2∶1的比例一起喂养过夜。第二天开始，每天早晨检查阴道涂片，当发现精液的那天被认为是怀孕的0天。
将怀孕的大鼠随机分为5组，每组18只大鼠。按照急性毒性测试，SD大鼠的LD50大于21.5g/kg。人的临床剂量为每剂量4个胶囊(每胶囊含有0.3g GSAP)，每天4次。设计实验使低剂量组为428.6mg/kg，中剂量组为2143mg/kg，高剂量组为4286mg/kg(当按照大鼠和人各自的体表面积计算时，分别相当于人临床剂量的1，5，和10倍)。在怀孕的第6-15天，通过管饲法以1.5ml/100g的体积对各剂量组大鼠口服给药GASP。阳性对照组在怀孕的第10-12天通过胃管以1.0ml/100g的体积口服给药阿司匹林(250mg/kg)，而阴性对照组通过管饲法口服给予等量的蒸馏水。
所有怀孕的大鼠每3天称重一次，以调节剂量。在怀孕的第20天，通过脊椎脱臼处死动物，进行剖腹产术得到胎儿大鼠，以检测多种指标，进行统计分析。对怀孕大鼠体重增加的影响怀孕大鼠在20天测试期中的体重增加如表4所示。结果表明给药阿司匹林的动物组的净体重增加明显低于阴性对照组(p＜0.05)。各个GASP剂量组与阴性对照组的统计比较显示净体重增加无显著性差异(p＞0.05)，表明本实验中的GASP剂量对怀孕大鼠的体重增加没有影响。表4.通过萌发活化的赤芝孢子的粉末对怀孕大鼠体重增加的影响(g，x±s)
*p＜0.05.对早期胚胎发育的影响表5显示了三个GASP剂量组与阴性对照组进行对比的研究。结果显示GASP治疗组和阴性对照组间在每同窝仔(litter)的胎儿存活率、吸收率(absorption rate)和胎儿死亡率上没有显著性差异(p＞0.05)。这明显不同于阿司匹林组(阳性对照组)和阴性对照组间的研究，其显示出统计学上显著的差异(p＜0.01)。结果表明GASP对早期胚胎发育没有任何显著的影响。表5.赤芝孢子的粉末对早期胚胎发育的影响
*p＜0.05与阴性对照组相比**p＜0.01与阴性对照组相比对胎儿大鼠发育水平的影响表6显示了各个GASP剂量组与阴性对照组在胎儿大鼠各个指标上的比较。结果显示在GASP组和阴性对照组间没有显著性差异(p＞0.05)。但是，当阿司匹林阳性对照组与阴性对照组进行比较时，观察到在胎儿大鼠的外观上有显著性差别，阿司匹林阳性对照组的外观异常率为42.9％。阿司匹林阳性对照组的胎儿大鼠外观较小，具有短的肢体和尾部，以及脐疝等。表6.通过萌发活化的赤芝孢子的粉末对胎儿大鼠发育水平的影响(x±s)
*p＜0.05与阴性对照组相比**p＜0.01与阴性对照组相比对胎儿大鼠骨骼发育的影响用茜素红染色后，在显微镜下观察胎儿大鼠，结果表明各个GASP剂量组与阴性对照组在骨骼发育上没有显著性差异(p＞0.05)，而阿司匹林阳性对照组显示出变形如骨骼发育不全、肋骨融合、二头肋和脊椎变形。结果显示GASP在当前剂量下不会影响胎儿大鼠的骨骼发育(结果如表7所示)。表7.赤芝孢子的粉末对胎儿大鼠骨骼发育水平的影响
*p＜0.05与阴性对照组相比**p＜0.01与阴性对照组相比对胎儿大鼠器官形成的影响将每同窝仔大约1/3的胎儿大鼠取出，用Bouins溶液固定，手工切片各个内脏器官，然后在解剖显微镜下观察。结果显示阿司匹林阳性组检测的17个胎儿大鼠中，2个为脑积水。但是在阴性对照组(40个)、低剂量组(39个)、中剂量组(53个)和高剂量组(56个)检测的胎儿大鼠中，没有发现大脑、颌、舌、唇、眼、脊髓、心、肺、肾、肝、膀胱和生殖器发育的任何异常。
这些结果表明GASP的测试剂量对各种指标，诸如怀孕大鼠的体重增加、早期胚胎形成、胎儿生长和发育、胎儿大鼠的骨骼发育和内脏发育没有任何显著的影响。因此可得出结论在目前测试条件下，根据“中药和新药研究指南(Guide to Researches on Traditional Chinese Medicines和New Drugs)”中的毒理测试方法，GASP对大鼠没有致畸作用。
使用广东省医学实验动物中心提供的重量22-25g的雄性NIH小鼠。使用的剂量根据小鼠的百分之五十致死量(LD50)，其大于21.5g/kg(数据由暨南大学医学院(Medical College of Jinan University)提供)。在该测试中，选择1/2 LD50、1/10 LD50和1/50 LD50作为实验剂量，即10000mg/kg、2000mg/kg和400mg/kg。还使用了阴性对照组和阳性对照组(40mg/kg环磷酰胺)。每组包括5个小鼠。各个剂量都是连续三天每天通过管饲法口服给药一次。
称重GASP，加入适量的蒸馏水，在研钵内研磨。然后加入蒸馏水调节混悬液至所需浓度。通过管饲法以0.4ml/10g体重的剂量口服给药该化合物。阴性对照组给予等量的蒸馏水，而阳性对照组通过管饲法以40mg/kg(单次给药)的剂量口服给药环磷酰胺(“CP”)。末次给药24小时后，通过颈椎骨脱臼处死动物。取出股骨，剥离肌肉，应用磷酸盐缓冲液冲洗骨髓，离心，hyponotically固定，应用本领域常规方法制备染色体样品。然后应用10％Giemsa染料(pH6.8)染色10分钟。
选择充分分散的分裂中期细胞在油浸镜头下观察。每个动物观察100个分裂中期细胞，记录染色体畸变细胞数，并计算染色体畸变率。应用Windows8.0的SPSS统计学计算分析得到的结果(t-检验)。
各个GASP剂量组(应用GASP胶囊)和阴性对照组间的染色体畸变率间的比较没有显著性差异(p＞0.05)，而CP组的染色体畸变率显著高于阴性对照组(p＜0.01)。(结果如表8所示)表8.通过萌发活化的赤芝孢子的粉末对小鼠骨髓细胞的染色体畸变率的影响
b表示染色体断裂(chromosomal breakage)I表示染色体断片(chromosomal fragmentation)f表示染色体融台(chromosal fusion)*p＜0.01上述结果表明当GASP以最高剂量(10000mg/kg)给药时，不会引起小鼠骨髓细胞的染色体畸变率的增加。这又证明当以最高剂量给药时不会引起突变率的增加。
在本说明书中举例说明和讨论的实施方案只是为了教导本领域普通技术人员据发明人所知的制备和应用本发明的最佳方式。这些说明书中的内容不应被认为是限制本发明的范围。本领域普通技术人员根据上述教导可以理解对本发明的上述实施方案进行修改或改变，要素添加或删减，而不偏离本发明的范围。因此，可以理解本发明除上面具体描述外，在权利要求及其等同物的范围内可以以其它的方式实施。
权利要求
1.一种预防或减少哺乳动物胎儿突变损伤的方法，所述方法包括对怀孕的雌性给药有效量的萌发活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
2.按照权利要求1的方法，其中所述突变损伤包括染色体畸变。
3.按照权利要求1的方法，其中所述的突变损伤是通过暴露于毒性物质而引起。
4.按照权利要求1的方法，其中所述突变损伤是通过紫外或电离辐射而引起。
5.按照权利要求1的方法，其中所述怀孕的雌性是人。
6.按照权利要求5的方法，其中所述有效保护量在每天0.5至50g之间。
7.按照权利要求6的方法，其中所述有效保护量在每天1至25g之间。
8.一种预防哺乳动物胎儿死亡的方法，所述方法包括对怀孕的雌性给药有效保护量的萌发活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
9.按照权利要求8的方法，其中所述怀孕的雌生是人。
10.按照权利要求9的方法，其中所述有效保护量在每天0.5至50g之间。
11.按照权利要求10的方法，其中所述有效保护量在每天1至25g之间。
12.一种预防或减少哺乳动物发育或先天缺陷的方法，所述方法包括对怀孕的雌性给药有效保护量的萌发活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
13.按照权利要求12的方法，其中所述怀孕的雌性是人。
14.按照权利要求13的方法，其中所述有效保护量在每天0.5至50g之间。
15.按照权利要求15的方法，其中所述有效保护量在每天1至25g之间。
全文摘要
本发明提供了一种通过给怀孕的哺乳动物口服给药萌发活化的赤芝孢子粉末(“GASP”)用于胎儿保护的方法。证明GASP对怀孕的哺乳动物，尤其是人的胎儿损伤有预防作用。
文档编号A61P43/00GK1466991SQ0214250
公开日2004年1月14日 申请日期2002年9月23日 优先权日2002年7月5日
发明者钟志强, 唐筱勤 申请人:钟志强, 唐筱勤