专利名称：在可生物降解的微球体中含有抗原、基因载体和佐剂的免疫组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产药物组合物的方法，在免疫接种了抗原或编码目的抗原的基因载体的宿主体内，该药物组合物能够刺激特异性细胞和/或体液免疫应答。这种组合物包含基于得自聚酯的共聚物的可生物降解的微球体，该微球体能够对抗原、基因载体和刺激免疫应答递质的佐剂进行包封和控释。
已知包括6-单酯和6，6双酯α，α-D-海藻糖(其中含30至90个碳原子的酯基被称作海藻糖单霉菌酸酯和海藻糖双霉菌酸酯)在内的一类化合物能够刺激抗原呈递细胞的募集和细胞因子的诱导产生，因而成为疫苗和免疫疗法中的潜在候选对象。在本发明中，术语“佐剂”是指不与目的抗原本身共有免疫表位，却能刺激针对目的抗原的免疫应答。
专利US4340588记载了海藻糖双霉菌酸酯在含有流产布鲁氏菌(BA，45/20株)抗原的疫苗组合物中作为佐剂的用途。在该组合物中，海藻糖双霉菌酸酯的天然混合物得自于几个来源并且被命名为“索状因子”。利用色谱技术进行适当纯化后，这些因子通常含有90％的双霉菌酸酯和10％的单霉菌酸酯以及含有95-90％海藻糖双霉菌酸酯的少量外源物质与仅仅基于BA45/20株的可溶性抗原的组合物相比，施用含有抗原和海藻糖双霉菌酸酯的水包油乳剂形式的疫苗后明显减少了感染。在该研究中，将提取物与作为乳剂的油混合。尽管已知油相的存在提高了几种不希望在用药位点发生反应的几率而且可能导致肉芽瘤的产生，但是该油相的内含物可根据其作为提取物载体的重要程度来进行调节从而刺激适当的免疫应答，其中所述提取物得自分枝杆菌的细胞壁。
在克服具有免疫原活性的制剂中由于有油的存在而导致问题出现的尝试中，提出了使用含分枝杆菌细胞壁的不溶性成分的含水悬浮液的建议(US5759554)。含水悬浮液通过以下步骤来制备(i)裂解细菌以及随后进行离心；(ii)采用蛋白水解酶从胞壁基的成分中去除蛋白(得自离心步骤的细胞碎片)；(iii)用去污剂进行处理并冲洗得自步骤(ii)的级分；(iv)冻干和(v)将冻干的级分悬浮在水溶液如盐水溶液中。在该发明中，采用基于分枝杆菌成分的悬浮液对免疫系统进行刺激从而激发了人体或动物体对传染病原体的中和作用并且延缓了癌细胞的生长。然而，该方法不能实现佐剂的可控释放，而可控释放可以使免疫应答最佳化。
针对抗原、基因载体和/或佐剂的方法也被记载在如US5643605专利文献中。在该发明中，佐剂和/或微囊包封抗原的用途被记载用于治疗或预防目的。
专利US5643605提供的组合物含有平均直径为20至100μm的包封了这种免疫佐剂的PLGA(D-L-丙交酯-共-乙交酯)微球体。所使用的佐剂是皂甙(QS21)或胞壁酰二肽(MDP)，该佐剂能够刺激以下条件的免疫应答(i)结合到聚合物中的含水佐剂的体积相对3克的聚合物为1mL或小于1mL；(ii)乳酸和乙醇酸单体间的摩尔比范围为100∶0至0∶100；(iii)PLGA聚合物的固有粘度范围为0.1至1.2dL/g；(iv)微球体的直径范围为20至100μm，和(v)所述佐剂按照三阶段模式从微球体中释放出来，其中在第一阶段中，一天内释放出少于30％的佐剂；在第二阶段中，约30至200天内，其在一天后释放出少于10％的佐剂；以及其中在第三阶段中，释放出前两阶段所剩余的佐剂。
然而，重要地是应当指出本发明提供的微球体的直径范围是20至100μm，当以用药途径如经口或经肺途径进行使用时阻止免疫应答的诱导。用于这些途径的理想直径应当是在1至10μm的范围内，据文献记载，该直径范围也是皮下施用免疫原性组合物的理想直径范围。在该发明中，将皂甙溶解在乙醇溶液中并加入到聚合物相中，并且在另一种制剂中，将MDP溶解在含水相中后再加入到聚合物相中。在两种制剂中，含有佐剂的相相当于制备方法的内部含水相。然而，该方法不允许加入可溶于非极性溶剂的佐剂。
几种疫苗制剂采用了目的在于当主要以亚单位疫苗的形式施用抗原时能够优化免疫应答的佐剂。最近十年来，在疫苗研制中取得的进展使得引进用于获得和生产抗原的新策略以及施用并将这些抗原呈递给免疫系统的新途径成为可能。这些策略实现了改进，尤其是在研制安全、有效和通用疫苗的过程中实现了改进。在本文中，DNA疫苗，尤其是在需要细胞免疫应答的时候，作为引发保护反应所需的有吸引力的替代物。
专利US6048551记载了一种制备微球体的方法，该微球体含有被用于肿瘤治疗的基因载体。在本发明中，采用了多种乳化方法。将基因载体溶解在含水相中并进行包封，选择性地与也被溶解在含水相中的抗病毒药物进行结合。所述颗粒的直径范围是1至200μm。
专利US6309569要求保护将DNA包封在聚合物微粒当中的方法，其中通过将(油包水)水包乳浊液加到含水相来萃取过量的有机溶剂，从而在含水溶液中形成粒径达到10μm的含DNA的聚合物微粒。
迄今为止，将抗原或基因载体和免疫佐剂包封在得自PLGA的可生物降解的微球体的同一制剂中的方法还有待于得到描述。因此，尽管在提供含有或不含共-佐剂分子的可控递送制剂方面已经做出了努力，其中所述制剂能够增强免疫应答，但是所述技术状况仍然缺少基于微球体的被动吞噬细胞定向系统，所述微球体具有适当的粒径因而能够通过不同的途径来进行施用并且仍然能够定向于特定的细胞群。
研制这种系统的一个重要原因是由于需要抗肺结核的有效疫苗。
本发明提供了一种免疫原性组合物，该组合物包含至少一种佐剂和/或蛋白质；和/或含有蛋白-表达基因的质粒，该质粒被包埋在平均直径小于20μm，优选地在1至10μm之间的高分子微球体中。因此，除了佐剂，所述组合物还含有一种抗原或编码该抗原的基因载体(优选来源于寄生虫和病原体)，所述抗原包括胞外和胞内细菌、真核生物如真菌和原生动物等的抗原。所述佐剂优选地是那些刺激细胞因子产生的佐剂。理想地是，携带分枝杆菌蛋白基因，例如hsp65基因(源自麻风分枝杆菌的65kDa的热休克蛋白)的质粒，或者甚至是纯化的或重组的蛋白可以被包封在得自乳酸和乳酸与乙醇酸的共聚物(单体比例变化范围是100∶0至0∶100)的聚合物微球体中。而且，海藻糖双霉菌酸酯可以被包封在PLGA的微球体中。当人或动物宿主已经患上了肺结核病时，包含海藻糖双霉菌酸酯和/或含有hsp65蛋白基因的质粒，或者甚至是所述蛋白本身的系统也可以被用于预防和治疗肺结核。
本发明的基因载体、抗原和/或佐剂的微囊包封可以通过以下方法来实现方法A(i)将由乳酸和乙醇酸产生的聚合物(以重量百分比表示的比例范围是100∶0至0∶100)以0.2至10％的浓度溶解在有机溶剂，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等中，所述有机溶剂与水不相溶或部分相溶；(ii)将亲脂抗原和/或佐剂溶解在含有所述聚合物的溶液(i)中；(iii)将在步骤(ii)中得到的溶液加到多元醇，例如聚乙烯醇(1至10％)中，从而形成水包油乳浊液；(iv)以适当的速率(200至1000rpm)搅拌该乳浊液，以便得到平均直径小于10μm，优选地在1至5μm之间的微球体，以及(v)在搅拌条件下，通过利用共溶剂、通过真空蒸发或其它去除溶剂的技术来实现溶剂的去除而不破坏系统的稳定性。或者可以通过离心或过滤、用含水溶剂冲洗、然后冻干来收集所获得的微球体悬浮体。
方法B(i)将由乳酸和乙醇酸(以重量百分比表示的比例范围是100∶0至0∶100)产生的聚合物以0.2至10％的浓度溶解在有机溶剂，例如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等中，所述有机溶剂含有或不含亲脂佐剂如海藻糖双霉菌酸酯；(ii)将亲脂性的基因载体、抗原和/或佐剂溶解在0.1至1mL的水相当中；(iii)将在步骤(ii)中得到的溶液加到在步骤(i)中获得的聚合物溶液中，然后在500至15000rpm的速度下进行搅拌，结果形成油包水乳浊液(或分散体)；(iv)充分搅拌一段时间(1至10分钟)后，将该初级乳浊液(或分散体)加到通常含有多元醇溶液，例如聚乙烯醇(1至10％)的乳化水相中，以便形成水包油-油包水的乳浊液；(v)在适当的速度(100至1000rpm)下搅拌在步骤(iv)中获得的多相乳浊液以便除去有机溶剂，结果产生平均直径小于10μm，优选地1至5μm的微球体，所述微球体可以通过过滤或离心、用含水溶剂冲洗并且最终冻干来进行收集。
值得提及的是本技术领域的其它已知方法可以被用来获得载有抗原和/或佐剂的微球体。这就是本发明的目标，其不受本文所提供的技术的限制。
本发明通过下列实施例而得到详细描述实施例1-海藻糖双霉菌酸酯的制备在氯仿-甲醇混合物(1∶1体积/体积)中将100克的肺结核分枝杆菌H37Rv株匀化几次。按照以前记载的纯化海藻糖双霉菌酸酯的方法对被提取的物质(18g)进行分级分离(Silva，C.L.，S.M.Ekizlerian，和R.A.Fazioli.1985.Role of cord factor in the modulation of infectioncaused by Mycobacteria.Am.J.Pathol.118238-247)。经纯化的糖脂(0.530g)在进行薄层层析的过程中通过迁移而形成一条单带，与商品(SIGMA，St.Louis，USA)类似。
实施例2-含有海藻糖双霉菌酸酯的微球体的制备和定性微球体按照乳浊液和溶剂蒸发技术来制备(Lewis，D.H.1990.Controlled release of bioactive agents from lactide/glicolide polymers.In Chasin M & Langer R.Biodegradable polymers as drug deliverysystems.Marcel Dekker，New York，1-43)。用30mL的二氯甲烷稀释5mg的海藻糖双霉菌酸酯(SIGMA)和125mg的可生物降解的PLGA(50∶50)(Resomer RG 505，MW 78,000，Boehringer Ingelheim，Germany)。将该有机相与100mL的含3％的聚乙烯醇(Mowiol40-88，SIGMA Aldrich Chemicals)表面活性剂的含水相混合，以便形成水包油的稳定乳浊液。为了使有机溶剂蒸发，在室温下进行6个小时的机械搅拌(800rpm)。通过在10.000xg下进行离心来收集微球体，用蒸馏水或盐水冲洗3遍，冻干并贮存在4℃下。将微粒溶解在二氯甲烷中后通过薄层层析测定微球体中的海藻糖双霉菌酸酯含量。通过CILAS 1064液相设备(Cilas，France)中的激光衍射测定微粒直径，结果表明平均直径范围是1至5μm。结果被表示为直径测定值下的累积值的百分比。不含PLGA的微球体或含海藻糖双霉菌酸酯的微球体(Sigma，St.Louis，USA)或作为非相关对照的对照脂类(一种甘油酯混合物，Sigma，St.Louis，USA)通过相同方法进行制备并被作为实验对照。
实施例3-质粒的制备将被基因载体pCDNA3或被修饰的pCDNA3(pCDNA3m)和含hsp65基因的质粒(PCDNA3-hsp65或pCDNA3修饰的-hsp65)转化的E.coli，DH5α菌株在含100g/mL的氨苄青霉素(SIGMA)的LB肉汤基培养基(GIBCO BRL，Scotland)中进行培养。构建体pCDNA3修饰的-hsp65得自预先被Bam HI和Not I(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)消化的pCDNA3载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，然后将对应于麻风分枝杆菌hsp65基因的3.3kb片段和CMV内含子A(citomegalovirus)插到所述载体中。将不含hsp65基因的载体用作对照。通过阴离子交换树酯纯化质粒(Concert High Purity MaxiprepSystem，GIBCO BRL)。利用Gene Quant II仪器(Pharmacia Biotech)通过λ＝260和280nm的分光光度测定法对质粒浓度进行评估。
实施例4-重组蛋白的制备于37℃下、在振荡速率为200rpm的振荡培养箱中，采用含100μg/mL氨苄青霉素(SIGMA)和0.1M IPTG(异丙硫-β-D-半乳糖苷，GIBCO BRL)的500mL的LB肉汤基液体培养基(GIBCO BRL，Scotland)将经含麻风分枝杆菌hsp65基因的pIL-161质粒转化的E.coli，BL21菌株培养18小时。培养后，通过采用J2HS离心机(Beckman，rotor JS-7.5)以7500rpm离心15分钟来收集细胞，将收集的细胞重悬浮在10mL的CE缓冲液中(30mM柠檬酸钠，10mM EDTA，pH6.1)并利用Vibra CellTM超声波探头(Sonics & Materials，USA)在冰浴条件下进行3次脉冲冲击，每次脉冲冲击持续1分钟并且强度为100W从而将细胞裂解。以16500rpm离心20分钟后，弃去上清液并将沉淀重悬浮在30mL的UPE缓冲液中(6M尿素，20mM EDTA，50mM磷酸二氢钾，pH7.0)并涡旋3分钟。在室温下通过轻轻搅拌将悬浮液保持15分钟并以16500rpm离心20分钟。将硫酸铵加到上清液中直至终浓度达到1M并在冰浴中温育30分钟。以16500rpm离心20分钟后，将沉淀重悬在3mL的PBS中并对着PBS彻底透析。
实施例5-质粒或载有重组蛋白的微球体的制备进行多级乳化后通过以下溶剂蒸发法来获得微球体利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德国)，在30mL含400mg PLGA 50∶50(来源于Boehringer Ingelheim的Resomer RG 505)的二氯甲烷中通过强烈搅拌(8000rpm)来乳化仅含不编码hsp65蛋白的质粒载体(pCDNA3或PcDNA3修饰的)；或含有编码hsp65蛋白(pCDNA3-hsp65，pCDNA3修饰的-hsp65)的基因的载体；或仅仅是重组sp65蛋白的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初级乳化液。为了制备含质粒的微球体，将4mg的质粒溶解在0.3mL的含水相中，针对重组hsp65，将1mg的蛋白溶解在0.3mL的含水相中。将该乳浊液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性剂的外部含水相(100mL)中，并进行均化从而形成多级水包油-油包水乳浊液。通过在室温下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德国)搅拌(300至800rpm)6小时至10小时进行蒸发来去除有机溶剂。利用Himac CR21离心机(Hitachi，转头R20A2)以10000xg的条件进行离心来收集微球体，用无菌水冲洗三次，冻干后贮存在4℃下。利用CILAS 1064流体设备(Cilas，法国)通过激光衍射学测定粒径。平均粒径应当在1至5μm之间。
实施例6-载有二霉菌酸酯和质粒或二霉菌酸酯和蛋白的微球体的制备通过多级乳化和溶剂蒸发法获得微球体利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德国)，在30mL含0.5mg海藻糖双霉菌酸酯和400mg PLGA 50∶50(Resomer RG 505 da Boehringer Ingelheim)的二氯甲烷中通过强烈搅拌(8000rpm)来乳化含pCDNA3，PcDNA3修饰的、pCDNA3-hsp65、PcDNA3修饰的-hsp65或重组hsp65(对于质粒来说需要4mg，对于蛋白来说需要1mg)的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初级乳化液。将该乳浊液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性剂的外部含水相(100mL)中，并进行均化从而形成多级水包油-油包水乳浊液。通过在室温下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德国)搅拌(300至800rpm)6小时进行蒸发来去除有机溶剂。利用Himac CR21离心机(Hitachi，转头R20A2)以10000xg的条件进行离心来收集微球体，用无菌水冲洗三次，冻干后贮存在4℃下。利用CILAS 1064流体设备(Cilas，法国)通过激光衍射学测定粒径。平均粒径应当在1至5μm之间。
实施例7-在被载有质粒的微球体转染化的真核细胞中对hsp65的表达进行评估于37℃下，在5％CO2的环境中，在添加了2％热灭活的胎牛血清的1640 RPMI培养基(SIGMA)中培养J774细胞(来源于BALB/c小鼠的肿瘤谱系细胞)和J774-hsp65(经携带麻风麻风分枝杆菌的hsp65基因的逆转录病毒载体[pZIPNeoSV(x)]转染的J774细胞)。将100μL的细胞悬液(5×105个细胞)放置在24孔平板中的无菌盖玻片上并温育3小时从而使细胞粘着。温育后，将1mL的RPMI培养基加到每个样品中并按照下述方法进行处理A)J774细胞接受1mL的RPMI培养基并被用作hsp65表达的阴性对照；B)J774-hsp65细胞加上1mL的RPMI培养基并被用作hsp65表达的阳性对照；C)J774细胞接受1mL含载有pCDNA3修饰的-hsp65的微球体(10个微球体/细胞)的RPMI培养基。将微粒重悬在培养基中并将该悬液的浓度调节到5×106个微粒/mL，在Neubauer小室中对微粒进行计数；D)J774细胞加上1mL含有结合了Lipofectin(GIBCO BRL)的pCDNA3修饰的-hsp65的RPMI培养基。
培养24小时后，除去培养上清液并重新加入1mL的RPMI培养基。每48小时更换一次培养基。试验开始后的第10天和第20天进行免疫细胞化学分析。
为了进行免疫细胞化学评估，用含1％牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA)的PBS溶液将细胞冲洗3遍。在室温下用4％的低聚甲醛将细胞固定30分钟后再次进行冲洗。所有冲洗都进行3次冲洗。然后，通过在室温下利用含3％H2O2的PBS进行温育来封闭内源性过氧化物酶。冲洗后，在室温下用封闭缓冲液(3％的兔血清，1％of BSA和0.01％的Triton X 100)将细胞温育1小时，以便阻断非特异性结合。然后，加入抗-hsp65抗体并在潮湿的4℃室内将细胞温育过夜。用封闭缓冲液稀释单克隆抗体(1∶100)，温育并冲洗后，在室温下，将样品与生物素化的抗-小鼠IgG抗体(B-7022，Sigma)一起温育，然后用封闭缓冲液稀释(1∶200)1小时。冲洗后，在室温下将样品与链霉抗生物素生物素-过氧化物酶复合物(链霉抗生物素蛋白-Dako Corporation，CA-USA)再温育30分钟。然后进行冲洗并用3-3′二氨基联苯胺底物(SIGMA)(10ml的PBS中含5mg)来显色，同时加入180μL的H2O2(20个体积)。用蒸馏水终止反应并在室温下用Mayer苏木精将细胞染色5至10分钟。用蒸馏水冲洗后，用0.5％的氢氧化铵溶液对其进行处理。然后再次进行冲洗，室温干燥并放置在涂有加拿大香脂的载玻片上。通过将初次抗体替换成PBS或同型非相关抗体来获得阴性对照。观测细胞并利用配置了MC80DX摄像系统的Aristoplan显微镜(Leitz)拍摄照片。结果表明包封加工过程不影响DNA的功能，这是因为经历了上述过程的巨噬细胞能够表达hsp65蛋白。
实施例8-免疫和攻击感染从 Paulo大学的 Preto医科学校的动物机构获得6至8周龄的BALB/c小鼠并在标准实验条件下进行饲养。所有过程都是按照伦理委员会的建议进行的。
通过肌内或气管内途径施用不同的微球体制剂来免疫小鼠。
微球体的用量范围是100至500mg/kg并且方案是气管内途径单次施用而肌内途径施用1或3次。施用微球体后的第30天或第60天，攻击或杀死小鼠，以便对免疫应答进行评估。
当进行攻击感染时，在用200μl 2.5％三溴甲醇(Sigma)的PBS溶液进行麻醉的情况下，通过气管内途径给小鼠施用105个菌落形成单位(CFU)的结核分枝杆菌H37Rv株。将被感染的动物保存在适当的生物安全条件下。在不同的时间间隔杀死被感染的动物以便对肺部的炎症反应进行定性和对防护能力进行评估。
实施例9-细胞因子的测定通过ELISA测定由经微球体免疫的小鼠的肺和脾细胞产生的细胞因子的浓度。在4℃下，利用Ultraturrax T 25 IKA(Labortechnik，德国)将整个肺部组织均化5分钟。以10000xg将被均化的组织离心15分钟并通过0.22μm的膜滤出上清液，然后将该上清液用来测定细胞因子的产量。在37℃下，于5％CO2的环境中培养脾细胞并利用作为非特异性刺激物的伴刀豆凝集素A或利用作为特异性刺激物的重组hsp65对脾细胞进行体外刺激。
48小时后，收集用于进行细胞因子分析的培养上清液。特异于TNF-α(MP6-XT22，MP6 XT3)，IL-10(JES5-2A5，JES5-16E3)，IL-6(MP5-20F3，MP532cll)，IL-4(BVD4-1D11，BVD6-24G2)，IFN-γ(R4-6A2，XMG1.2)和IL-12(C15.6，C17.8)的捕获物和生物素化单克隆抗体以及重组细胞因子可以购自Pharmingen(San Diego，CA)。利用上述ELISA技术(Haagmans，B.L.，A.J.van den Eertwegh，E.Claassen，M.C.Horzinek，和V.E.Schijns.1994.Tumor necrosisfactor-alpha production during cytomegalovirus infection inimmunosuppressed rats.J.Gen.Virol.75779-787)并按照厂商提供的说明书(Pharmingen，San Diego，CA)测定上清液中的TNF-α，IL-10，IL-6，IL-4，IFN-y和IL-12浓度。每次测定试验都绘制一条重组小鼠rTNF-α，rIL-10，rIL-6，rIL-4，rIFN-γ或rIL-12的标准曲线。所有评估的细胞因子的测定极限都是15pg/Ml。
实施例10-氧化氮的测定在含10％胎牛血清(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)、10mMHepes、20mM碳酸氢钠、100μg/ml(GIBCO-BRL)青霉素和链霉素的RPMI培养基中培养从注射了含海藻糖双霉菌酸酯的微球体的小鼠体内支气管肺泡灌洗液中回收细胞。通过采用Greiss方法(Stuehr，D.J.和C.F.Nathan.1989.Nitric oxide.A macrophage productresponsible for cystostasis and respiratory inhibition in tumor targetcells.J.Exp.Med.1691543-1555)测定细胞培养上清液中的亚硝酸盐(NO2-)产量来评估氧化氮的产量。通过将200μM亚硝酸钠溶液稀释成系列稀释度来绘制标准曲线。检测极限是3μM/105个细胞。
实施例11-对抵抗攻击感染的防护作用的评估为了评估各种制剂所赋予的抵抗结核分枝杆菌H37Rv株进行攻击感染的保护作用，杀死预先经过免疫和攻击(如实施例8中所记载的)的动物。取出这些动物的肺，称重并进行均化。将系列稀释度的匀浆平铺在7H11培养基上。在37℃下培养21天后对每只平板上的CFU数目进行计数。
在所有实验中，本发明的制剂具有适当的特性，诸如平均直径小于10μm(更精确地是在1至5μm之间)，因而容易被吞噬细胞摄取，使得囊化物质进行被动定向。囊化过程不影响DNA功能，这是由于经载有pCDNA3修饰的-hsp65的微球体处理的巨噬细胞能够表达蛋白。
本发明通过附加的表格得到进一步的说明。表I和表II表示气管内施用载有重组hsp65的微球体能够引发局部和全身水平的特异性免疫应答。该应答通过测定得自被免疫的BALB/c小鼠的脾细胞培养上清液中的γ干扰素(表I)和肺匀浆中的IL-12水平(表II)来进行评估。利用重组hsp65进行体外刺激后，经载有重组hsp65的微球体免疫的小鼠体内的γ干扰素(IFN-γ)水平很高。经重组hsp65(r-hsp65)的PBS或空载微球体免疫的小鼠不产生高水平的IFN-γ。将经伴刀豆凝集素A(ConA)体外刺激后产生的IFN-γ浓度用作阳性对照。施用了r-hsp65的PBS或载有r-hsp65的微球体的小鼠体内的白介素12(IL-12)水平很高。该结果证实了通过非肠道途径以外的其它途径施用本发明提供的制剂的可能性。
表I免疫后第30天的BALB/c小鼠的脾细胞培养上清液中的IFN-γ产量(pg/mL)

表II免疫第30天的BALB/c小鼠的肺匀浆中的IL-12产量(pg/g)

然而，经胃肠外施用后，本发明的制剂还能引发特异性免疫应答。每只BALB/c小鼠通过肌内注射单次剂量为5mg的含质粒微球体来进行免疫。免疫60天后，在脾细胞的培养上清中产生了IFN-γ、IL-12和IL-6，由此表明产生了特异性免疫应答。如表III，IV和V所示，通过采用低于传统疫苗接种方案的剂量的质粒就能产生该应答，其中如同发明专利WO95/31216和Silva及其同事(Lowrie等，Nature 400269-271，1999)的研究论文中所记载的那样，DNA以溶液的形式分三次进行施用。单次剂量为5mg的微球体(含30g的质粒)能够引发与肌内注射三次剂量为100μg的裸质粒相类似的免疫应答。该结果说明本发明的进步性在于降低了产生明显免疫应答所需的DNA用量，因而减少了需要注射的次数表III通过肌内注射质粒或被包封在微球体中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60后天，其脾细胞培养上清中的IFN-γ产量(ng/mL)

表IV通过肌内注射质粒和被包封在微球体中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾细胞培养上清中的IL-12产量(pg/g)

表V通过肌内注射质粒和被包封在微球体中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾细胞培养上清中的IL-6产量(pg/g)

关于载有TDM的微球体的免疫刺激特性，表VI和VII表明，本发明获得的制剂通过气管内用药后能够引起肺细胞产生数种细胞因子以及激活肺泡巨噬细胞，所述肺泡巨噬细胞的激活通过一氧化氮的产生来确定。表VI显示了由注射了含TDM的微球体的小鼠和注射了对照物(PBS，对照脂质CtLip和海藻糖双霉菌酸酯DBT)的小鼠的肺细胞产生细胞因子的结果。所述动物通过气管内途径进行注射。60天后，将肺取出并进行匀浆以便利用ELISA测定上清中的细胞因子。数据代表一次实验，重复3次。
表VI通过气管内途径处理的BALB/c小鼠在注射后第60天，其肺匀浆中的细胞因子的产量

表VII显示了由注射了含TDM的微球体的小鼠和注射了对照物(PBS，对照脂质和海藻糖双霉菌酸酯)的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的细胞产生一氧化氮的结果。每次实验获得了约105个支气管肺泡灌洗液中的细胞并于37℃下，在5％CO2的环境中培养24小时。接着，收集培养上清液并通过Greiss法测定亚硝酸盐浓度。通过多重比较Dunnett’s检验进行统计学分析，结果表明与注射了PBS的小鼠相比，采用TDM(*p＜0.01)和采用DBT(*p＜0.01)进行的处理之间存在着显著差异。
表VII经气管内途径处理的BALB/c小鼠的支气管肺泡灌洗液细胞培养上清中的一氧化氮的评估

表VIII阐述了在得自被含有质粒和TDM的微球体和对照免疫的BALB/c小鼠的脾细胞培养上清液中产生IFN-γ的水平。
表VIII在免疫30天后的BALB/c小鼠的脾细胞培养上清液中的IFN-γ产量(pg/ml)

表IX阐述了在得自被含有质粒和TDM的微球体和对照免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清液中产生抗体的水平。
表IX通过肌内注射含有质粒和TDM微球体而被免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清中抗体产量的评估。

表X，XI和XII阐述了在得自注射了含有质粒和TDM的微球体和对照后又经肺结核分枝杆菌H37Rv株攻击后的BALB/c小鼠的肺匀浆中产生细胞因子的水平。
表X得自被免疫并受肺结核分枝杆菌攻击的BALB/c小鼠的肺匀浆中的IL-10产量(pg/mL)

表XI得自被免疫并受肺结核分枝杆菌攻击的BALB/c小鼠的肺匀浆中的IL-12产量(pg/mL)


表XII得自被免疫并受肺结核分枝杆菌攻击的BALB/c小鼠的肺匀浆中的IFN-γ产量(pg/mL)

表XIII阐述了含有DNA或蛋白与TDM的不同微球体赋予BALB/c小鼠以抵抗肺结核分枝杆菌毒株攻击的防御功能的能力

如表XIII所示，只有含有载入了pCDNA3m-hsp65与TDM的微球体的制剂能够保护小鼠免受感染。重要的是需要单独施用剂量低于10倍的质粒就能诱导产生类似于由裸DNA方法获得的保护作用。蛋白的最佳包封率达到了95％；而质粒的包封率为60至70％。佐剂/聚合物的最佳比例是6μg的佐剂∶1mg的聚合物。
权利要求
1.一种获得免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物含有被共同包埋在可生物降解的微球体中的抗原或基因载体和免疫佐剂从而在被单次或多次施用后能够引发包括细胞和体液应答在内的特异性免疫应答。
2.一种如权利要求1所述的含有抗原或基因载体与免疫佐剂的药物组合物，其能通过上呼吸道(气管内、肺部和鼻腔)、口腔和肠胃外途径来进行施用。
3.一种如权利要求1和2所述的含有抗原或基因载体与免疫佐剂的药物组合物，包含得自乳酸的聚合物和得自乳酸与乙醇酸的共聚物。
4.一种如权利要求1和2所述的含有抗原或基因载体与免疫佐剂的药物组合物，其被包埋到平均粒径为1至20μm的微球体当中。
5.一种如权利要求1和2所述的含有抗原或基因载体与免疫佐剂的药物组合物，其中生产方法以及施加在其中的有机溶剂不会引起被包封的抗原、质粒或免疫佐剂功能的丧失。
6.一种如权利要求1和2所述的药物组合物，其中所述免疫佐剂增强了针对抗原或基因载体的免疫应答，从而降低了诱发免疫应答所需抗原或基因的剂量。
7.一种如权利要求1和2所述的药物组合物，其中所述免疫佐剂增强了针对抗原或基因载体的免疫应答，从而在单剂量施用后能够引发细胞和体液特异性免疫应答。
8.一种获得如权利要求1和2所述组合物的方法，其中在所述方法的第一个步骤中，所述抗原或基因载体被加到初级乳浊液的含水相中而免疫佐剂被加到相同乳浊液的有机相(其含有所述的聚合物)中，从而形成油包水的含有抗原或基因载体与佐剂的乳浊液。
9.一种获得如权利要求1和2所述组合物的方法，其中在权利要求8中获得的油包水乳浊液被再次乳化到含有适当表面活性剂的含水相中从而获得水包油-油包水的乳浊液。
10.一种如权利要求1和2所述药物组合物，其中所述抗原是被重组或纯化的源自麻风分枝杆菌的65kDa热休克蛋白。
11.一种如权利要求1和2所述药物组合物，其中所述基因载体是含有编码源自麻风分枝杆菌的65kDa热休克蛋白的基因的质粒。
12.一种如权利要求1，2和7所述药物组合物，其中所述佐剂是海藻糖双霉菌酸酯。
13.一种如权利要求1，2和7所述药物组合物，其中所述抗原是源自麻风分枝杆菌的65kDa热休克蛋白以及佐剂是海藻糖双霉菌酸酯。
14.一种如权利要求1，2和7所述药物组合物，其中所述基因载体是含有编码源自麻风分枝杆菌的65kDa热休克蛋白的基因的质粒以及佐剂是海藻糖双霉菌酸酯。
15.一种如权利要求1，2和7所述药物组合物，该组合物经肺施用后能够引发免疫应答，该免疫应答的特征在于-刺激细胞因子如IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ和TNFα的产生；-IgG1和IgG2a同种型抗体的产生；-由肺泡巨噬细胞产生的一氧化氮增多；-刺激局部和全身的免疫应答。
16.一种如权利要求1，2和7所述药物组合物，该组合物经肠胃外施用后能够引发免疫应答，该免疫应答的特征在于-刺激细胞因子如IL-6，IL-10，IL-12和IFN-γ的产生；-特异于所述抗原的Th1型血清免疫球蛋白的产生；-IgG1和IgG2a同种型，尤其是IgG2a同种型抗体的产生。
17.如权利要求1，2和7所述药物组合物用于预防传染病的用途，其在人和动物宿主体内需要一种特征如权利要求15和16中所述的特异性免疫应答。
18.如权利要求1，2和7所述药物组合物作为治疗剂用于治疗传染病、哮喘、自身免疫疾病和癌症的用途，其在人和动物宿主体内需要一种特征如权利要求15和16中所述的特异性免疫应答。
19.如权利要求1，2和7所述药物组合物用于预防人类和动物肺结核的用途。
20.如权利要求1，2和7所述药物组合物用于治疗人类和动物肺结核的用途。
全文摘要
本发明涉及能够在接种了目的抗原或编码该目的抗原的基因载体的宿主体内刺激免疫应答的组合物。该组合物包含基于得自乳酸和乙醇酸的共聚体的微球体，该微球体包封了具有得自分枝杆菌成分的免疫刺激特性的抗原、基因载体和/或佐剂。本发明的具体应用在于被包封在粒径小于10μm的微球体内的与热休克蛋白结合的或与含有编码所述热休克蛋白基因的质粒结合的海藻糖双霉菌酸酯在被单次或多次施用后能够诱导产生特异性抗体和细胞免疫应答，以及能够诱导分泌与预防传染病和癌症相关的细胞因子的用途。
文档编号A61K9/00GK1549728SQ02817186
公开日2004年11月24日 申请日期2002年7月17日 优先权日2001年7月17日
发明者约瑟·马奇尔·小罗德里格斯, 切利奥·洛佩斯·席尔瓦, 洛佩斯 席尔瓦, 约瑟 马奇尔 小罗德里格斯 申请人:米纳斯吉拉斯联合大学, 切利奥·洛佩斯·席尔瓦