专利名称：高纯度紫丹参甲素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从天然产物中分离制备高纯度的紫丹参甲素(Przewaquinone A，Przewatanshinquinone A)的方法。
背景技术：
目前报道含有紫丹参甲素的天然产物主要是丹参或紫丹参。药理研究表明，紫丹参甲素具有明显的抗肿瘤活性对小鼠Lewis肺癌、黑色素瘤1316和肉瘤180有不同程度的抑制作用。
紫丹参甲素的制备工艺在文献中报道的非常少，且很不成熟。高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是近年发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明目的本发明的目的是提出一种采用高速逆流色谱法可克量级制备紫丹参甲素的工艺，制备的紫丹参甲素纯度可达98％以上。
技术内容本发明的基本工艺路线是(1)用有机溶剂浸提含有紫丹参甲素的天然产物，得到其提取物；(2)将所得提取物用柱色谱层析法进行提纯，收集含紫丹参甲素的组分，蒸干溶剂；(3)将(2)所得样品用高速逆流色谱法分离制得纯度高于98％的紫丹参甲素产品。
柱色谱层析采用的固定相为硅胶(颗粒度为10-500目)；流动相可选不同比例的二元混合液A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃；B组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯类，优选氯仿-乙酸乙酯体系。A与B的体积比为1-10∶1。
高速逆流色谱法对紫丹参甲素精制溶剂体系主要有三个。均以上相为固定相，下相为流动相。一号溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，C组分为水，优选氯仿-甲醇-水体系，A、B、C的体积比为2-6∶2-6∶1-4。二号溶剂体系由四个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，C组分可选自正己烷、石油醚、环己烷等烷烃或醚类，D组分为水，优选氯仿-甲醇-正己烷-水体系，A、B、C、D的体积比为2-5∶2-5∶1-4∶1-4。三号溶剂体系由五个组分构成，A、C组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，D组分可选自正己烷、石油醚、环己烷等烷烃或醚类，E组分为水，优选四氯化碳-甲醇-二氯甲烷-正己烷-水体系，A、B、C、D、E的体积比为0.5-3∶2-5∶0.5-3∶1-4∶1-4。
实验适合于在室温为15℃-30℃下进行。
优点及效果用本法制备的紫丹参甲素纯度可达到98％以上。本法适用于以各种含紫丹参甲素的天然产物、天然产物的提取物为原料制备高纯度的紫丹参甲素。适用于采用各种型号的逆流色谱仪分离制备紫丹参甲素。本发明率先提出了一种可克量级制备紫丹参甲素的工艺，本工艺具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点。
实施例1采用氯仿-甲醇-正己烷-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用石油醚浸提丹参，减压蒸干溶剂，用硅胶柱对3g丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为9∶1的氯仿-乙酸乙酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为2.8∶3∶1.2∶2的氯仿-甲醇-正己烷-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液20ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
实施例2采用二氯甲烷-乙醇-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用硅胶柱对3g丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为7∶1的二氯甲烷-乙酸丙酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用分析型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，2ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为5∶3∶2的二氯甲烷-乙醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液2ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
实施例3采用氯仿-甲醇-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用硅胶柱对3g丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为4∶1的四氯化碳-乙酸异丙酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为3∶2∶2的氯仿-甲醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液20ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
实施例4采用四氯化碳-甲醇-二氯甲烷-正己烷-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用正己烷浸提丹参，减压蒸干溶剂，用硅胶柱对3g丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为8∶1的氯仿-乙酸正丁酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用分析型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为2∶3∶1∶1∶2的四氯化碳-甲醇-二氯甲烷-正己烷-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液20ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
实施例5采用氯仿-乙醇-二氯甲烷-石油醚-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用乙醇浸提紫丹参，减压蒸干溶剂，用硅胶柱对3g紫丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为9∶1的氯仿-乙酸乙酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为0.5∶3∶2∶1∶2的氯仿-乙醇-二氯甲烷-石油迷-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液20ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
实施例6采用四氯化碳-甲醇-正己烷-水体系制备纯度高于98％的紫丹参甲素首先用硅胶柱对3g紫丹参提取物进行分离，洗脱剂比例为9∶1的氯仿-乙酸乙酯溶液，分步收集，将含有紫丹参甲素的溶剂减压浓缩至干，得到初步纯化产物。使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。溶剂体系的制备将体积比为3∶3∶1∶2的二氯甲烷-丙酮-环己烷-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静置分层，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1∶1的上相和下相混合液20ml溶解初步纯化样品进行分离，收集紫丹参甲素的组分峰，旋转蒸发至干，得到红色紫丹参甲素固体，经HPLC分析，其纯度达到98％以上。
权利要求
1.一种高纯度紫丹参甲素的制备方法，其特征在于他的基本工艺路线是(1)用有机溶剂浸提含有紫丹参甲素的天然产物，得到其提取物；(2)将所得提取物用柱色谱层析进行提纯，收集含紫丹参甲素的组分，蒸干溶剂；(3)将(2)所得样品用高速逆流色谱法分离制得纯度高于98％的紫丹参甲素产品。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度紫丹参甲素的制备方法，其特征在于柱色谱层析采用的固定相为硅胶(颗粒度为10-500目)，流动相可选不同比例的二元混合液，A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃；B组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯类，优选氯仿-乙酸乙酯体系。A与B的体积比为1-10∶1。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度紫丹参甲素的制备方法，其特征在于高速逆流色谱法对紫丹参甲素精制溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，C组分为水，优选氯仿-甲醇-水体系，A、B、C的体积比为2-6∶2-6∶1-4。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度紫丹参甲素的制备方法，其特征在于高速逆流色谱法对紫丹参甲素精制溶剂体系由四个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，C组分可选自正己烷、石油醚、环己烷等烷烃或醚类，D组分为水，优选氯仿-甲醇-正己烷-水体系，A、B、C、D的体积比为2-5∶2-5∶1-4∶1-4。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度紫丹参甲素的制备方法，其特征在于高速逆流色谱法对紫丹参甲素精制溶剂体系由五个组分构成，A、C组分可选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，B组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，D组分可选自正己烷、石油醚、环己烷等烷烃或醚类，E组分为水，优选四氯化碳-甲醇-二氯甲烷-正己烷-水体系，A、B、C、D、E的体积比为0.5-3∶2-5∶0.5-3∶1-4∶1-4。
全文摘要
本发明涉及一种从天然产物中分离制备高纯度的紫丹参甲素的方法,他的基本工艺路线是:(1)用有机溶剂浸提含有紫丹参甲素的天然产物,得到其提取物;(2)将所得提取物用柱色谱层析进行提纯,收集含紫丹参甲素的组分,蒸干溶剂;(3)将(2)所得样品用高速逆流色谱法分离制得纯度高于98%的紫丹参甲素产品;本法适用于以各种含紫丹参甲素的天然产物、天然产物的提取物为原料制备高纯度的紫丹参甲素,适用于采用各种型号的逆流色谱仪分离制备紫丹参甲素,本发明率先提出了一种可克量级制备紫丹参甲素的工艺,本工艺具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点。
文档编号A61P35/00GK1380295SQ02104328
公开日2002年11月20日 申请日期2002年2月27日 优先权日2002年2月27日
发明者韩笑, 张天佑 申请人:北京天纯维通生物技术有限公司