专利名称：N－酰氨基烷基肼亚氨酰胺的制作方法
背景技术：
本发明通常涉及由于蛋白质与葡萄糖和其它还原糖反应而导致的蛋白质老化，具体地说，涉及抑制非酶促糖基化蛋白的反应及通常综合形成的高级糖基化作用(glycation)终产物和交联物。
很久以来就已知葡萄糖与蛋白质之间的反应。最早的表现是由Maillard在1912年观察到的在烹调食物时出现褐色素，他观察到葡萄糖或其它还原糖与氨基酸反应，形成经历一系列脱水和重排而形成稳定的褐色素的加合物。进一步研究表明，储存和加热的食物由于在葡萄糖和多肽链之间反应而导致发生非酶促棕黄反应，并且结果蛋白质产生交联，相应地显示出降低的生物利用率。
该还原糖和食物蛋白之间的反应被发现在体内具有其类似物。因此，已表明葡萄糖和蛋白质上的游离氨基之间形成被称为Amadori产物的稳定的1-脱氧ketosyl加合物的非酶促反应在血红蛋白中发生，其中通过与葡萄糖的反应的血红蛋白的β链的氨基末端的重排形成称为血红蛋白A1c的加合物。还在各种其它身体蛋白中发现发生该反应，例如晶状体蛋白，胶原蛋白和神经蛋白。参见Bucala等“高级糖基化作用；糖尿病和衰老的化学，生物和本质”药物学进展，23卷，pp.1-34，Academic Press(1992)。
而且，光谱和荧光特性类似于后阶段Maillard产物的褐色素也在体内观察到与一些长效蛋白相关，例如来自老年个体的晶状体蛋白和胶原蛋白。在年龄20-90岁的人的硬脑膜中观察到褐色素与年龄相关的线性增加。有趣的是，胶原蛋白的老化可在体外通过葡萄糖诱导的交联来模拟；还注意到胶原蛋白对其它蛋白的捕获和加合物的形成被认为通过交联反应而发生，并被认为是观察到的在肾基膜中的白蛋白和抗体积累的原因。
在美国专利4758583中，公开了通过与靶蛋白和葡萄糖之间的最初反应产生的早期糖基化产物反应来抑制高级糖基化终产物的形成的方法和相关制剂。相应地，当抑制剂和早期糖基化产物之间的反应出现阻断糖基化蛋白与其它蛋白物质形成交联的后阶段产物的后续反应时，则认为产生了抑制作用。被确定作为抑制剂的一个活性剂为氨基胍，进一步试验的结果已证明了它在这方面的功效。
虽然用氨基胍和类似化合物所取得的成功是有希望的，仍然存在鉴定和开发其它的拓宽可行性和可能的拓宽潜在活性范围及其诊断和治疗功效范围的抑制剂的需要。
发明概述根据本发明，公开了用于抑制蛋白高级糖基化(蛋白老化)的方法和组合物。具体地，该组合物包含用于抑制由于高级糖基化(glycation)终产物形成而产生的非酶促交联的活性剂物质。该活性剂物可选自能与来自葡萄糖与蛋白反应的早期糖基化产物反应并防止进一步反应的那些物质。通过本发明的方法和组合物还可防止由存在于体内或食物中的其它还原糖，包括核糖，半乳糖和果糖导致的交联。
这些活性剂包括具有下面结构式的N-酰基氨基烷基肼亚氨酰胺
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物学或药物学可接受的酸加成盐；和其混合物，及其载体。
用于本发明的化合物和它们的组合物看来与早期糖基化产物反应，从而防止相同的导致蛋白交联的来自后面形成的高级糖基化终产物的相同反应，从而防止蛋白老化。
本发明还涉及通过将早期糖基化产物阶段的初始糖基化蛋白与一定量的一种或多种本发明的活性剂接触来抑制蛋白老化的方法，或含有它们的组合物。在本方法用于工业应用的情况时，通过在为蛋白提取物时，则加入到它们的混合物中，或通过应用或加入到含有该蛋白或多种蛋白的食物中，可将一种或多种物质用于所讨论的蛋白中，这些方法均能防止过早老化和特定食物的腐败。
抑制高级糖基化终产物形成的能力使得它在蛋白老化是一个严重损害的所有应用中具有显著的意义。因此，在食品技术领域，通过使一些有勉强稳定性的食品不易腐败而延缓食物腐败将具有显著的经济和社会效益，并从而更适宜于消费者。减少腐败将降低试验、去除、替代的费用，食物增加的利用率可有助于稳定它们在市场中的价格。类似地，在蛋白的易腐败性是一个问题时的其它工业应用中，本发明物质的混合物在包含这些蛋白的组合物中将有利于它们延长的可用期。目前使用的已知导致包括动物变态反应和气喘的食物防腐剂和变色预防剂如二氧化硫，可被例如本文描述的那些化合物替代。
因为Maillard过程严重影响身体中的重要蛋白质物质，其中有胶原蛋白、弹性蛋白、晶状体蛋白和肾小球基膜，因此本方法具有特殊的治疗用途。这些蛋白随着年龄(因此使用术语“蛋白老化”)和作为糖尿病后果而变质。因此，延缓或基本抑制高级糖基化终产物的能力具有治疗糖尿病的希望，当然还改善动物的生活质量，也许还有寿命。
因为它们通过具有抗噬菌斑特性的阳离子抗菌剂、如洗必太防止牙齿着色，所以这些物质还可用于个人美容和卫生学领域。
因此，本发明的一个主要目的是提供一种通过相应地抑制高级糖基化终产物的形成而抑制作为蛋白与葡萄糖和其它活性糖反应的最终结果产生的广泛的蛋白交联的方法。
本发明的另一个目的是提供一种如前所述的方法，其特征在于，与确定为早期糖基化产物的初始糖基化蛋白反应。
本发明的另一个目的是提供一种如前所述的方法，该方法防止所述早期糖基化产物的重排和交联形成所述高级糖基化终产物。
本发明的另一个目的是提供能在前述方法中参与与所述早期糖基化产物反应的活性剂。
本发明的另一个目的是通过利用前述方法和活性剂来提供治疗蛋白老化的有害后果的治疗方法。
本发明的另一个目的是通过利用前述方法和活性剂来提供一种抑制牙齿着色的方法。
本发明的另一个目的是提供包含药物组合物的组合物，它们均包含本发明的活性剂。
本发明的另一个目的是提供新的化合物，以及它们的制备方法，在本发明方法和组合物中的应用。
考虑后面的描述，其它目的和优点对于本领域技术人员是显而易见的。优选实例的详细说明根据本发明，已开发出物质和包括含有所述物质的药物组合物的组合物及相关方法，它们被认为抑制存在于动物和植物材料中的许多靶蛋白中的高级糖基化终产物的形成。具体地说，本发明涉及一种组合物，它可含有一种或多种包含具有下面通式的N-酰基氨基烷基肼亚氨酰胺的物质
其中alk为含有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6个碳原子的低级烷基；和其生物学或药物上可接受的酸加成盐；和其混合物，及其载体。
上面涉及的低级烷基优选含有1-6个碳原子，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基，和其相应的支链异构体。这些基团任选被一个或多个卤素、羟基、氨基和低级烷基氨基取代。
本文涉及的亚烷基含有2-8个碳原子，同样可为直链或支链链，具体为1，2-亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基，和其相应的支链异构体。
上式中的卤原子可为氟、氯、溴或碘。低级烷氧基含有1-6个，优选1-3个碳原子，具体为甲氧基、乙氧基、正丁氧基、异丁氧基等。
对于本发明的目的而言，等同于式(I)化合物的还有生物学和药物学可接受的酸加成盐。这些酸加成盐可来自各种有机和无机酸，例如硫酸、磷酸、盐酸、氢溴酸、氨基磺酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、肉桂酸、乙酸、苯甲酸、葡糖酸、抗坏血酸、甲磺酸和相关的酸。
在式I所包括的化合物中，一些取代基是优选的。例如，其中alk为1，2-亚乙基，R为甲基的化合物是优选的。具体地，为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐或氢溴酸盐的新化合物显示出尤其可用于治疗哺乳动物(特别是人类)患者的活性的特性。
本发明的代表化合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰氨氢溴酸盐；N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰氨盐酸盐；N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰氨氢溴酸盐；和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亚氨酰氨氢溴酸盐。
上述化合物能抑制靶蛋白上的高级糖基化终产物的形成。蛋白交联形成高级糖基化终产物导致其它蛋白的捕获，并导致在体内产生如皮肤弹性降低和产生皱纹、某些肾疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎的病症。类似地，经历非酶促褐变的植物材料产生变质，在为食物的情况下，变得腐败或变硬，从而不适宜食用。因此，根据本发明采用的化合物抑制这个后阶段的Maillard作用并参与上述有害的变化中。
本发明的原理是使用阻断后糖基化步骤，即形成荧光发色团的活性剂，其中该发色团的存在与糖尿病和衰老的有害后果相关，并导致它们的产生。理想的活性剂将防止发色团的形成及蛋白与蛋白的相关交联和在其它蛋白上捕获蛋白，例如在动脉和肾中发生的。
本发明化合物被认为与其发生反应的早期糖基化产物的化学性质可能是变化的，相应地，本文采用的术语“早期糖基化产物”指包括在此范围的任何和所有这些变化。例如，已推测了参与形成高级糖基化终产物的并可通过与本发明化合物反应被阻断的带羰基部分的早期糖基化产物。在一个实施方案中，预测早期糖基化产物可能包含可缩合形成高级糖基化终产物的Amadori产物或其其它缩合，脱水和/或重排产物的活性羰基部分。在另一个方案中，包含一个或多个羰基部分(例如乙醇醛，甘油醛或3-脱氧葡糖醛酮)的活性羰基化合物可从Amadori或其它早期糖基化终产物的裂解形成，并通过与胺或Amadori产物的后续反应可形成含羰基的高级糖基化产物，例如烷基甲酰基糖基吡咯。
一些研究者研究了高级糖基化产物的形成的机理。Eble等的体外研究(1983)“非酶促糖基化和依赖葡萄糖的蛋白交联”，生物化学杂志，2589406-9412，涉及在不存在葡萄糖时，糖基化蛋白与非糖基化蛋白的交联。Eble等试图阐明Maillard反应的机理，并相应地将RNA酶的初始糖基化作为模型系统，接着在变化的条件下进行测定。在一个方面，分离糖基化的蛋白物质，并放置在不含葡萄糖的环境中，从而观察以确定交联程度。
Eble等因此观察到不仅与糖基化蛋白，而且与非糖基化蛋白继续发生交联。Eble等观察到的一个现象是，糖基化蛋白与蛋白物质之间的反应看来发生在蛋白链的赖氨酸部位。在该文中由Eble等进行的证实试验证明，游离的赖氨酸与RNA酶上的赖氨酸竞争与糖基化蛋白的结合。因此，从这些数据可推出赖氨酸可作为高级糖基化的抑制剂；然而，产生它的这一结论和导致它的应被考虑在由Eble等制备和考察的相对有限的模型系统的内容中。显然，Eble等没有认识到对于体外和体内的蛋白的高级糖基化的抑制，是否在作为本发明基础的发现中存在这一假设。
Eble等的实验没有提出在始终存在葡萄糖时，体内形成高级糖基化终产物中的活性裂解产物机理或任何其它机理。事实上，其它研究者支持用于解释体内形成高级糖基化终产物的这一机理(参见如Hayase等，生物化学杂志，263，pp.3758-3764(1989)；Sell和Monnier，生物化学杂志，264，pp.21597-21602(1989)Oimomi等农业生物化学，53(6)1727-1728(1989)；和糖尿病研究和临床实践，6311-313(1989))。因此，在Eble模型系统中使用赖氨酸作为抑制剂对本发明化合物在体内在存在葡萄糖时抑制高级糖基化产物形成和改善糖尿病的并发症和衰老中的应用没有影响。
可用于本发明的组合物包括或包含能与早期糖基化产物的活性羰基中间体反应的活性剂。适宜的活性剂为本发明的式I化合物。
本发明同样涉及抑制高级糖基化终产物的形成的方法，该方法包括将靶蛋白与本发明的组合物接触。在靶蛋白包含在植物或动物来源的食物中的情况下，可通过各种常规方法将包含这些活性剂的组合物应用到这些食物中。
在食品工业中，许多年前就已发现亚硫酸盐抑制Maillard反应，并通常用于加工和储存的食物中。然而，最近食物中的亚硫酸盐参与气喘中的严重、甚至致命的反应。因此，已禁止用亚硫酸盐处理新鲜水果和蔬菜。变态反应的机理不清楚。因此，本发明的组合物和活性剂提供在用这种方法处理食物中的亚硫酸盐的非毒性替代物。
因为从对本发明情况的讨论中很清楚，所以本方法和组合物具有抑制动物和植物中的关键蛋白的老化的希望，作为其结果伴随着具有经济和医学效益。在为食物的情况下，施用本发明的组合物具有延缓食物腐败，从而增加食物的存储寿命和对于消费者的更大的利用率的希望。用非毒性、生物相容的化合物替代目前使用的防腐剂，例如已知导致人变态反应和气喘的二氧化硫是本发明的另一个优点。
本发明的治疗实质涉及抑制如前所述的在由高级糖基化和交联导致的关键蛋白的老化中证实的老化过程。因此，通过本发明的实验，在寿命和机能方面对身体蛋白，尤其是结构性身体蛋白，例如胶原蛋白，弹性蛋白，晶状体蛋白，神经蛋白，肾小球基膜均有利。因此，本发明降低涉及通过交联靶蛋白捕获蛋白的疾病的发病率，例如视网膜病，白内障，糖尿病性肾疾病，肾小球硬化病，外周血管疾病，闭塞性动脉硬化，外周神经病，中风，高血压，动脉粥样硬化，骨关节炎，心房周强直，皮肤弹性丧失和产生皱纹，关节僵硬，肾小球性肾炎等。同样，所有这些疾病在受糖尿病糖尿症折磨的病人中得到证实。因此，本治疗方法涉及治疗老年病人或患有一种上述疾病的患者中的所提到的疾病。
通过形成高级糖基化产物的蛋白交联可降低结构性蛋白，例如，血管壁中的胶原蛋白的稳定性，还可捕获血清蛋白，例如将脂蛋白捕获至胶原蛋白。而且，这可导致内皮增加的渗透性，从而共价捕获内皮下基质中外渗的血浆蛋白，降低血浆和基质蛋白对酶的生理性降解的敏感性。由于这些原因，由慢性高血糖诱导的糖尿病性血管的进行性闭塞被假设来自葡萄糖来源的交联的过量形成而产生。这些糖尿病性微血管的变化和微血管的闭塞可使用本发明的组合物和方法通过化学抑制高级糖基化产物的形成而被有效地防止。
研究表明，靶器官中的慢性糖尿病损伤的产生主要与高血糖相关，这样严密的代谢控制将延迟或甚至防止末端器官的损伤。参见Nicholls等，实验室研究，60，No.4，p.486(1989)，它讨论了胰岛同系移植物和氨基胍在大鼠糖尿病性肾病中的作用。这些研究进一步证明了在糖尿病大鼠中，氨基胍减少主动脉壁蛋白的交联，并证实了Brownlee等对这个糖尿病并发症的另外的靶器官的早期研究，科学，232，pp.1629-1632(1986)。而且，另外的研究表明了在肾中由氨基胍捕获免疫球蛋白的减少(Brownlee等，糖尿病，35，增刊，1，p.42A(1986))。
Brownlee等，1988，同前，提供了关于在具糖尿病肾病标志的肾的形态学变化方面，在链脲霉素-糖尿病大鼠模型中使用氨基胍干扰糖尿病肾病的发展的进一步的证据。这些研究者报道氨基胍防止作为糖尿病肾病的主要结构异常特征的肾小球基膜厚度的增加。
这些数据一起有力地证明，通过本发明的教导，对高级糖基化终产物(AGEs)形成的抑制可在晚期及早期防止由于糖尿病造成的结构损伤以及在由AGEs形成而导致的衰老过程中的变化。
导致更加僵硬的细胞膜的糖尿病诱导的红细胞变形的变化是交联的另一个证明，并且在体内氨基胍已表明能防止它。在这些研究中，使用诱导患长期糖尿病的新西兰白兔来研究试验化合物对红细胞(RBC)变形(df)的影响。通过管饲法以100mg/kg的比例对糖尿病白兔施用试验化合物。
糖尿病的另一个后果是导致通常与慢性糖尿病相关的减少的骨的形成的高血糖诱导的基质骨分化。在动物模型中，糖尿病降低基质诱导的骨分化70％。
虽然为一种有希望的治疗剂，但氨基胍显示出在某些情况下，在一些病人群体中可能抑制其治疗有用性的其它一些药物学活性。因此，继续研究一种高级糖基化终产物形成的抑制剂，它对该活性具有选择性，而对二氨基氧化酶(DAO)和可诱导形式的氧化氮合成酶没有影响。本发明鉴定出新化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺和其各种盐，尤其是作为唯一的高级糖基化终产物形成的选择性抑制剂的盐酸盐，而对二氨基氧化酶或氧化氮的形成没有明显影响。因此，本发明提供抑制高级糖基化终产物的形成，而不伴随性抑制二氨基氧化酶和氧化氮形成的方法和组合物，该组合物包含N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰氨和其各种盐形式。
在本发明组合物用于体内或治疗目的的情况下，可注意到本文使用的化合物或制剂为生物相容的。可用治疗有效量的本发明的制剂或化合物制备药物组合物，该组合物可包括选自已知用于此目的为已知物质的药物学可接受的载体。取决于施用方法，可将该组合物制备成各种形式。而且，可使用式I化合物的各种药物学可接受加成盐。
在通过静脉内，肌肉内或腹膜内注射给药的情况下，使用液体形式。适宜时，可制备固体剂型，例如片剂，胶囊剂，或液体剂型，例如溶液剂和悬浮剂等用于口服给药。对于皮肤或眼睛的表面或皮肤施用，可用制剂在适宜赋形剂，例如水，乙醇，丙二醇中配制溶液剂，洗剂或软膏剂，它们可能包含一种载体以有助于渗透到皮肤或眼睛中。例如表面制剂可包含高达约10％的式I化合物。也考虑对其它身体组织给药的其它适宜形式。
在本发明具有治疗用途的情况下，对打算治疗的动物宿主可给药适宜药物形式的一定量的一种或多种活性剂。可通过已知方法完成给药，例如口服，局部和胃肠外方法，例如真皮内，皮下，静脉内或腹膜内注射，以及通过其它常规方法。可以延长的时间期限以例如多达约30mg/kg的剂量进行制剂的给药。
如前面所提到的，本发明还涉及一种抑制由于口腔中的非酶促褐变导致的牙齿着色的方法，包括对需要这种治疗的个体给药抑制高级糖基化终产物形成的有效量的包含结构式I活性剂的组合物。
在口腔中发生的非酶促褐变反应导致牙齿的着色。目前使用的抗斑剂加速该非酶促褐变反应和进一步的牙齿的着色。最近，一类具有明显抗噬菌斑特性的阳离子抗菌剂被配制成用于日常用来杀死口腔细菌的漱口液。这些阳离子制剂包含如双胍啶、氯化十六烷基吡啶、葡萄糖酸洗必太、双辛氢啶和洁尔灭。
由洗必太和其它抗斑剂造成的牙齿染色显然来自Maillard反应的增强。Nordbo，牙齿研究杂志，58，p.1429(1979)报道在体外洗必太和洁尔灭催化褐变反应。加入到患有糖衍生物和氨基源的混合物中的洗必太由于Maillard反应导致增加的颜色形成。还已知使用洗必太导致增加的牙齿表面。Nordbo提出洗必太以两种方式导致牙齿染色第一，通过增加包含多个氨基的表面的形成，第二，通过催化导致着色产物的Maillard反应。
根据本方法，将式I混合物配制成适宜于用于口腔的组合物。特别适宜的制剂为掺入了活性剂的漱口液和牙膏。
在本发明的实践中，以漱口液和牙膏制造中熟知的量和组合使用的非毒性、药学上可接受的载体来完成常规的制造方法。
式I的活性剂以抑制高级糖基化终产物形成的有效量配制在组合物中。当然，它的量随使用的特定活性剂及特定的剂量形式而变化，但通常为特定制剂重量的0.01％-1.0％的范围。
式I包含的一些化合物为可通过本领域熟知的化学合成的改进来制备的新的化合物。可根据Nakashima等欧洲医学化学杂志，22，553-558(1987)中描述的方法来自制备式I化合物。该参考文献在第554页描述了下面两个式I化合物的盐酸盐的制备N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺(也称为1-氨基-3-乙酰氨基丙基胍；)和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亚氨酰胺(也称为1-氨基-3-乙酰氨基丁基胍)。
本发明化合物的一种合成方法示于下路线图中。
路线I
在该反应路线图中，将溶解在甲醇或其它适宜极性溶剂中的氨基硫脲与乙基溴反应，加热至回流温度约2-12小时。冷却至室温，向甲醇溶液中加入叔丁基甲基醚，产生S-乙基氨基硫脲氢溴酸盐。
接着，向S-乙基氨基硫脲氢溴酸盐中加入适当的式II的N-酰基亚烷基二胺。在加热至回流温度约2-12小时后，冷却，分离所需的式I的N-酰基氨基烷基肼亚氨酰胺，如果需要，从例如异丙醇和叔丁基甲基醚的混合物的适宜的溶剂中通过重结晶纯化。
通常从相应的氢溴酸盐通过用强碱，如氢氧化钠中和氢溴酸盐，接着用强酸处理以产生相应的盐来制备式I混合物的各种酸加成盐。另外，可将氢溴酸盐溶于甲醇中，并用气态氯化氢处理以产生相应的盐酸盐。
制备本发明化合物的另一个方法包括如下面路线图II所示的它们的制备路线II
在该反应路线图中，将氯化氰与适当的式II的N-酰基亚烷基二胺反应以产生未分离的中间体的混合物。接着将示于上面反应路线图II方括号中的这些未分离的中间体在极性溶剂中与无水肼一起回流约1-约15小时。
适宜的极性溶剂包括醇，例如2-丙醇和乙醇。肼加入步骤的反应温度当然取决于选择的特定的溶剂的性质并随之而改变。
下面实施例为对本发明的说明。实施例1A. S-乙基氨基硫脲溴化氢将氨基硫脲(218.4g，2.4mol)溶解在乙醇(1L)中。向混合物中加入乙基溴(306.6g，2.8mol)，将混合物缓慢加热回流。在反应进行过程中，在7小时内将所有固体溶解在溶液中。将溶液回流两个多小时，冷却至环境温度。将叔丁基甲基醚(700ml)加入到乙醇溶液中，放置在冰箱中过夜。在两次收获中收集白色晶体(418g，87％)；mp 123-5℃.。1H-NMR(D2O)3.18(2H，dd)，1.39(3H，t)。13C-NMR(D2O)169.6，25.7，13.8ppm。B. N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺溴化氢向S-乙基氨基硫脲溴化氢(100g，0.5mol)的750ml乙醇溶液中加入N-乙酰-亚乙基二胺(51g，0.5mol)。在与四个漂白捕获器相连的系统中将混合物回流8小时。在冷却混合物时，形成白色晶体并过滤。在与漂白捕获器相连的真空系统下，将溶液蒸发至红色油状物。在2-丙醇/tBuOMe中油状物缓慢结晶，在三次收获中产生白色结晶的标题化合物(39.5g，33％)；mp 127-8℃.。1H-NMR(D2O)3.36(4H，t)，2.00(3H，s)。13C-NMR(D2O)175.0，158.4，40.6，38.5，22.3ppm。实施例2N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐将N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐(5g，20.8mmol)溶解在50ml水中。将AmberliteIRA-400(OH)(50g，来自Aldrich)上样至具有多孔玻璃的柱上(2.5cm直径×45cm)。将树脂用200ml1NNaOH洗脱，接着用蒸馏水洗脱直至pH7。将溴化氢水溶液上样至树脂上并一滴滴洗脱。洗脱掉更多的水直至洗脱液为中性。混合茚三酮试验为阳性的所有含水级分，加入10ml6NHCl。真空除去水，产生无色油状物，接着从2-丙醇重结晶，产生3.82g(94％)；mp 127-8℃。1H-NMR(D2O)3.36(4H，dt)，1.99(3H，s)。13C-NMR(D2O)174.9，158.2，40.5，38.4，22.0ppm。实施例3N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐将氢溴酸盐N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐(5g，20.8mmol)溶解在100ml甲醇中。冰浴中向搅拌的溶液中通入HCl气15分钟。通入HCl气后，室温下，将溶液搅拌2小时，加入200mltBuOMe。24小时后，在烧瓶的底部分离出油状物。从油状物中倾析出液体。从2-丙醇/tBuOMe中结晶出油状物，产生3.3g(82％)的白色晶体，该晶体与来自方法A的晶体具有相同的物理性质。实施例4在基本上如实施例1的段落A和B描述的反应过程中，采用适宜的起始物质来制备下面的式I化合物N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐；和N-(4-乙酰氨基丁基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐。实施例5N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐下面过程必须在通风良好的通风橱中进行。将早已称重的2L三颈烧瓶的出口与6NKOH阱相连，通过浸没在干冰丙酮浴中将整个烧瓶冷却至-70℃。从其重量变化在天平上监测的演示瓶对烧瓶吹扫氯化氰气。收集62g氯化氰(1mol)。向液化的气体中加入冷的2-丙醇(500ml)和机械搅拌装置。剧烈搅拌下，滴加N-乙酰亚乙基二胺(102g，1mol)的2-丙醇(500ml)溶液，使内部温度不超过5℃。加入完成后，5℃下，将化合物搅拌1小时，缓慢加入无水肼(28.2ml，0.9mol)。5℃下，将混合物搅拌1小时，室温下，再搅拌1小时，接着进一步回流15小时。在回流的最后1小时中，通过蒸馏除去溶剂将反应混合物的体积减少一半。冷却时，缓慢形成白色立方体晶体。接着收集晶体，干燥产生标题化合物。实施例6下面方法用来评价本发明化合物抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)与大鼠尾腱胶原蛋白覆盖的96孔平板交联的能力。
通过37℃下，将200mg/ml浓度的BSA与200mM葡萄糖的0.4M磷酸钠缓冲液，pH7.4一起保温12周制备AGE-BSA。接着将糖基化的BSA用磷酸盐缓冲液(PAS)充分透析48小时，其中另外更换5次缓冲液。首先用300ulsuperbloc封闭缓冲液(Pierce#37515X)将大鼠尾腱胶原蛋白覆盖的平板封闭1小时。通过使用NUNC-多探针或DynatechELISA-平板洗涤机，用PAS-Tween20溶液(0.05％Tween 20)就平板洗涤两次，从孔中除去封闭溶液。通过37℃下，加入50ul各种稀释在PAS或试验化合物中的AGE-BSA 4小时，使用或不使用所需浓度的溶解在PAS缓冲液，pH7.4中的试验化合物来进行AGE-BSA(取决于AGE-BSA的分批，为1-10μg/孔)与大鼠尾腱胶原蛋白覆盖平板的交联。将含有或不含有试验化合物的未褐变BSA的PAS缓冲液加入到各孔中作为对照。通过用PAS-Tween缓冲液将各孔洗涤三次除去未交联的AGE-BSA。用抗AGE-RNase的多克隆抗体定量与尾腱胶原蛋白覆盖平板交联的AGE-BSA。在1小时保温后，通过用PAS-Tween洗涤4次除去AGE抗体。
接着通过加入辣根过氧化物酶结合的二抗，例如羊抗兔免疫球蛋白，并保温30分钟来检测结合的AGE抗体。加入底物2，2-连氮基-二(3-乙基苯噻唑啉磺酸)(ABTS发色团)(Zymed#00-2011)。再让反应进行15分钟，410nm下，在Dynatech平板计数器读取吸光度。
如下计算各个试验化合物的抑制百分数％。
抑制百分数＝{[光密度(不含化合物)-光密度(含化合物)]/光密度(不含化合物)}100％。
10mM各种试验化合物的IC50相对抑制如下试验化合物IC50N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸2.6mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐3.6mMN-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺氢溴酸12.2mM氨基胍盐酸盐 12.0mM上面的试验表明，式I化合物为更有效的高级糖基化形成的抑制剂，这样这种类型的药物治疗在减少与蛋白高级糖基化和蛋白和其他大分子之间形成交联相关的疾病中具有好处。可用药物治疗来防止在糖尿病和衰老过程中发生的导致例如肾损伤和对腱、韧带和其它关节的血管外损伤等并发症的蛋白的增加的捕获和交联。实施例7用下面方法来评价在存在核糖时，本发明化合物抑制N-乙酰基甘氨酰赖氨酸甲酯的交联的能力。材料N-乙酰基甘氨酰赖氨酸甲酯(在下式中的DP)核糖(在下式中的R)试验化合物(在下式中的C)试剂0.5M磷酸钠缓冲液pH7.4N-乙酰基甘氨酰赖氨酸甲酯的0.5M磷酸钠缓冲液，pH7.4核糖800mM如果需要，将化合物溶解在上述缓冲液中，pH调至7.4步骤如下制备含有混合物80mg/ml N-乙酰基甘氨酰赖氨酸甲酯/缓冲液 0.1 0.1 -核糖 0.1 0.1 0.1试验化合物-0.1 0.1缓冲液0.2 0.1 0.2并在37℃下保温16-24小时。在保温期间的最后，使用350nm波长的激发光和400nm波长的发射光读取荧光。根据下式，从在存在试验化合物时荧光的降低来计算交联的抑制抑制(％)＝100×[DPRC荧光-RC荧光]/DPR荧光各种试验化合物的抑制如下试验化合物IC50mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸11.46N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐10.64N-(3-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐＞10.0氨基胍盐酸盐 10.0上面的实验表明，式I化合物拥有抑制高级糖基化形成的活性，这种类型的药物治疗减少与蛋白高级糖基化和蛋白和其他大分子之间形成交联相关的病理学。药物治疗可被用来防止在糖尿病和衰老过程中发生的蛋白的增加的捕获和交联，它们导致例如肾损伤和对腱、韧带和其它关节的血管外损伤等并发症。实施例8为了确定试验化合物对二氨基氧化酶的作用，使用下面的分析方法。该分析法是基于胺底物转化成接着与试剂含有的相应的醛产物的比色动力酶分析法。用于该方法中的酶和底物的浓度确保反应为饱和环境，并在室温下与保温时间为线性关系。材料磷酸钠缓冲液，0.1M，pH＝7.4腐胺(Sigma)，0.03M(4.8mg/ml)二氨基氧化酶(Sigma)，3U/ml(50mg/ml)O-氨基苯甲醛(Sigma)，(0.5mg/ml)96孔平板，平板计数器w/450nm的吸收性滤步骤室温下进行反应。除开磷酸钠缓冲液可在4℃下储存1个月外，所有的反应试剂和试验化合物的稀释液均应用缓冲液新配制。一旦配制，溶液可在室温下保存。腐胺和二胺氧化酶很易溶于缓冲液中。O-氨基苯甲醛(O-bzld)对光敏感，需要在37℃下稍微加热。这用铝箔覆盖试管中进行。此外，由于氧化，在打开容器后，该试剂开始丧失它的活性，因此，必须迅速完成它。在将容器加热到室温后，称取必须的量。
1.将适宜量的缓冲液吸取到各孔中。
2.向适宜的孔中加入50μl试验化合物。向试验和全部孔中加入50μl二氨基氧化酶(DAO)溶液。让化合物与酶相互作用15分钟的预保温步骤。
3.让分光光度计空置于空气中用重复移液管向所有孔中加入50μlO-氨基苯甲醛溶液。此后，向试验和所有孔中加入50μl腐胺底物溶液。底物不加入空白孔中。用自动平板计数器在450nm读取初始吸光度。接着让反应进行37分钟，读取最后的吸光度。体积空白(μl)总体积(μl)试验化合物(μl)缓冲液 200 150 100DAO 505050o-bzld 505050腐胺0 5050化合物 0 0 50D.计算各试验和空白孔的初始吸光度值作为这些孔的空白。这使得能校正可能来自由化合物引起的任何干扰吸光度的光密度。空白孔的起始吸光度被用作参数以确定如果在试验化合物稀释时见到任何极其异常的吸光度时，是否任何化合物的滴定可被接受。
从最终吸光度值中减去起始吸光度确定值。结果以不存在任何试验化合物的总酶活的百分数表示试验化合物最终-试验化合物起始/(全部最终-全部起始)×100浓度与全部的百分数的半对数图能计算IC50值。建议使用软件如INPLOT。
在该分析中测试本发明的代表化合物和氨基胍时，获得下面的结果试验化合物IC50mMN-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐 6858N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺盐酸盐 3140氨基胍盐酸盐 21实施例9为了确定试验化合物对可诱导氧化氮合成酶的作用和由此形成的氧化氮，使用下面的分析方法。
用脂多糖诱导巨噬细胞(RAW 264.7)的氧化氮(NO)的产生，加入各种化合物以评价由使用化合物产生的抑制。
洗涤细胞，计数并稀释至1.0×106细胞/ml的浓度。接着将100ul细胞/孔等分至96孔组织培养平板中的各孔中，产生1.0×105细胞/ml的最终浓度。在三个孔中进行分析，以收获足够的上清以备检测。在37℃的烘箱中将细胞保温2小时，接着将使用化合物加入其中。37℃下，将保温再续3小时，此后加入脂多糖。37℃下，继续保温过夜，接着，向300μl样品中加入400μl 1％磺胺的4NHCl溶液和100μl 6NHCl。室温下，将该混合物保温10分钟，加入300μl 1％N-(1-萘基)亚乙基二胺盐酸盐的甲醇溶液。在每次加入后，在450nm下读取光密度。
在该分析中测试本发明的代表化合物和氨基胍时，获得下面的结果试验化合物NO释放的抑制百分数％N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐 20N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐 15N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺盐酸盐 33氨基胍盐酸盐 44实施例10片剂mg/片剂式I化合物50淀粉 50甘露糖醇 75硬脂酸镁 2硬脂酸 5将化合物，一部分淀粉和乳糖混合，用淀粉糊湿润成粒。将湿润的颗粒置于浅盘中，45℃下，干燥过夜。在粉碎机中将干燥的颗粒粉碎至约20目的粒径。加入硬脂酸镁，硬脂酸和等量的淀粉，在适宜的片压机上挤压之前，混合整个混合物。使用11/3”冲压机，用4kg的硬度将片剂压成232mg的重量。根据USP XVI中描述的方法，这些片剂在半小时内崩解。实施例11洗剂mg/g式I化合物 1.0乙醇400.0聚乙二醇400 300.0羟基丙基纤维素 5.0丙二醇 配制成1.0g实施例12为了进一步研究非酶促褐变抑制剂防止例如发生在牙齿表面的表面蛋白的着色的能力，进行下面褐变实验。作为膜覆盖的牙齿表面的替代物，用未曝光和显影的相纸来提供在相纸背面的固定的蛋白(明胶，如胶原蛋白)的表面。穿出5毫米的圆孔，50℃下，在含3mM叠氮化钠的100mM葡萄糖-6-磷酸的0.5M磷酸缓冲液pH 7.4的溶液中浸没一周。葡萄糖-6-磷酸是能以比葡萄糖更快的比例参与非酶促褐变的糖。除葡萄糖-6-磷酸外，还包括洗必太和/或式I化合物。保温后，将明胶/纸盘用水漂洗，观察褐色并照相。
与仅浸泡在缓冲液中的盘相比，仅在葡萄糖-6-磷酸中保温显示轻微的褐色。包含洗必太(为最终浓度为0.04％洗必太的Peridex形式)则显示出明显的褐色。向洗必太中加入式I化合物完全抑制明胶的褐变，在不存在洗必太的情况下，包含式I化合物也是如此。
由葡萄糖-6-磷酸在明胶表面的单独作用形成的轻微的褐色及式I化合物的对它的防止证明本发明在防止牙齿表面非酶促褐变中的效用。在存在洗必太时的增加的褐变和本发明化合物对它的防止证明本发明在防止洗必太产生的抗噬菌斑制剂增强的非酶促褐变中的效用。实施例13漱口液％式I化合物1.4葡萄糖酸洗必太 0.12乙醇 11.6糖精钠 0.15FD&Blue NO.1 0.001薄荷油 0.5甘油 10.0Tween 60 0.3加水至 100实施例14牙膏％式I化合物5.5山梨糖醇，70％的水溶液 25糖精钠 0.15十二烷基硫酸钠 1.75Carbopol934，6％分散体 15薄荷油 1.0氢氧化钠，50％水溶液 0.76二价磷酸钙二水合物 45加水至 100在不脱离其实质或必要特征的情况下，可以其它形式实施或以其它方法进行本发明。因此本公开被认为从各方面来进行说明，并且不限制所附权利要求所述的本发明的范围，落在相同的含义和范围中的所有变化均被包含在本发明中。
权利要求
1.一种抑制靶蛋白高级糖基化的组合物，包括有效量的式I化合物
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物或药物学可接受的酸加成盐；和其载体。
2.权利要求1的组合物，其中R为甲基。
3.权利要求1的组合物，其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
4.权利要求1的组合物，其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
5.权利要求1的组合物，其为N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
6.一种施用于动物以抑制在所述动物中的靶蛋白的高级糖基化的药物组合物，包括药物学有效量的式I化合物
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物或药物学可接受的酸加成盐；和其载体。
7.权利要求6的组合物，其中R为甲基。
8.权利要求6的组合物，其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
9.权利要求6的组合物，其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
10.权利要求6的组合物，其为N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
11.一种抑制靶蛋白的高级糖基化产物形成的方法，该方法包括施用有效量的组合物，其中所述组合物包括式I化合物
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物或药物学可接受的酸加成盐；和其载体。
12.权利要求11的方法，其中R为甲基。
13.权利要求11的方法，其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
14.权利要求11的方法，式I的化合物其为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
15.权利要求11的方法，式I的化合物其为N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
16.一种治疗动物以抑制所述动物中靶蛋白的高级糖基化终产物形成的方法，该方法包括施用有效量的药物学组合物，其中所述药物学组合物包括式I化合物
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物或药物学可接受的酸加成盐；和其载体。
17.权利要求16的方法，其中R为甲基。
18.权利要求16的方法，其中式I化合物为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
19.权利要求16的方法，其中式I化合物为N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
20.权利要求16的方法，其中式I化合物为N-(3-乙酰氨基丙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
21.一种抑制口腔中由非酶促褐变导致的牙齿着色的方法，包括施用有效量的包含式I化合物的抑制高级糖基化终产物形成的组合物
其中alk为具有2-8个碳原子的直链或支链亚烷基，R为含有1-6碳原子的低级烷基；和它们生物或药物学可接受的酸加成盐；和其载体。
22.一种治疗动物以抑制所述动物中靶蛋白的高级糖基化终产物的形成，而不伴随性地影响二氨基氧化酶和可诱导的氧化氮合成酶的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺和其生物学和药物学可接受的酸加成盐，和其载体。
23.权利要求22的方法，其中组合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐。
24.权利要求22的方法，其中组合物包括N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐。
25.化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺氢溴酸盐，或其它药物学可接受的盐。
26.化合物N-(2-乙酰氨基乙基)肼亚氨酰胺盐酸盐，或其它药物学可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及使用式(Ⅰ)化合物的组合物和抑制非酶促交联(蛋白老化)的方法,其中alk为具有2—8个碳原子的直链或支链亚烷基,R为含有1—6碳原子的低级烷基;和它们生物或药物学可接受的酸加成盐。相应地,公开了一种包含该N－酰基氨基烷基肼亚氨酰胺的组合物,该组合物能抑制靶蛋白高级糖基化终产物的形成。该方法包括将靶蛋白与组合物接触。由于可以处理食物腐败和动物蛋白老化,由此预测了本发明的工业和治疗用途。
文档编号A61P1/00GK1209117SQ96199999
公开日1999年2月24日 申请日期1996年12月26日 优先权日1995年12月26日
发明者P·C·乌尔里赫, D·R·瓦格勒 申请人:奥尔顿有限公司